Name: direct measurement of kdm1a target engagement using chemoprobe-based immunoassays
Uploaded: 2019-06-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Measurement of KDM1A Target Engagement Using Chemoprobe-based Immunoassays at JoVE.com

Denne undersøgelse blev finansieret af Oryzon Genomics. S.A., Hoffman-La Roche, og delvist understøttet af CIIP-20152001 og RETOS Collaboration program RTC-2015-3332-1.

Der blev udtaget blodprøver fra Instituto de Investigación Biomédica Sant Pau biobank i henhold til spansk lovgivning (Real Decreto de Biobancos 1716/2011) og godkendelse af de lokale etiske komitéer. Der er udført undersøgelser med animalsk væv i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer for pasning og anvendelse af forsøgsdyr (de Europæiske Fællesskabers direktiv 86/609/EØF), der er oprettet af det etiske udvalg for dyreforsøg på PRAAL-PCB.
1. fremstilling af...

<ol>
	<li>Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+demethylation+mediated+by+the+nuclear+amine+oxidase+homolog+LSD1.">Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1.</a> Cell. 119 (7), 941-953 (2004).</li><li>Maiques-Diaz, A., Somervaille, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LSD1:+biologic+roles+and+therapeutic+targeting.">LSD1: biologic roles and therapeutic targeting.</a> Epigenomics. 8 (8), 1103-1116 (2016).</li><li>Maes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORY-1001,+a+Potent+and+Selective+Covalent+KDM1A+Inhibitor,+for+the+Treatment+of+Acute+Leukemia.">ORY-1001, a Potent and Selective Covalent KDM1A Inhibitor, for the Treatment of Acute Leukemia.</a> Cancer Cell. 33 (3), 495-511 (2018).</li><li>Sugino, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+LSD1+inhibitor+NCD38+ameliorates+MDS-related+leukemia+with+complex+karyotype+by+attenuating+leukemia+programs+via+activating+super-enhancers.">A novel LSD1 inhibitor NCD38 ameliorates MDS-related leukemia with complex karyotype by attenuating leukemia programs via activating super-enhancers.</a> Leukemia. 31 (11), 2303-2314 (2017).</li><li>Kleppe, M., Shank, K., Efthymia, P., Riehnhoff, H., Levine, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysine-Specific+Histone+Demethylase,+LSD1,+(KDM1A)+As+a+Novel+Therapeutic+Target+in+Myeloproliferative+Neoplasms.">Lysine-Specific Histone Demethylase, LSD1, (KDM1A) As a Novel Therapeutic Target in Myeloproliferative Neoplasms.</a> Blood. 126, 601 (2015).</li><li>Jutzi, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LSD1+Inhibition+Prolongs+Survival+in+Mouse+Models+of+MPN+by+Selectively+Targeting+the+Disease+Clone.">LSD1 Inhibition Prolongs Survival in Mouse Models of MPN by Selectively Targeting the Disease Clone.</a> HemaSphere. 2 (3), 54 (2018).</li><li>Mohammad, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Hypomethylation+Signature+Predicts+Antitumor+Activity+of+LSD1+Inhibitors+in+SCLC.">DNA Hypomethylation Signature Predicts Antitumor Activity of LSD1 Inhibitors in SCLC.</a> Cancer Cell. 28 (1), 57-69 (2015).</li><li>Rivers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RN-1,+a+potent+and+selective+lysine-specific+demethylase+1+inhibitor,+increases+&#947;-globin+expression,+F+reticulocytes,+and+F+cells+in+a+sickle+cell+disease+mouse+model.">RN-1, a potent and selective lysine-specific demethylase 1 inhibitor, increases &#947;-globin expression, F reticulocytes, and F cells in a sickle cell disease mouse model.</a> Experimental Hematology. 43 (7), 546-553 (2015).</li><li>Rivers, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+administration+of+the+LSD1+inhibitor+ORY-3001+increases+fetal+hemoglobin+in+sickle+cell+mice+and+baboons.">Oral administration of the LSD1 inhibitor ORY-3001 increases fetal hemoglobin in sickle cell mice and baboons.</a> Experimental Hematology. 67, 60-64 (2018).</li><li>Buesa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dual+LSD1/MAO-B+inhibitor+ORY-2001+prevents+the+development+of+the+memory+deficit+in+samp8+mice+through+induction+of+neuronal+plasticity+and+reduction+of+neuroinflammation.">The dual LSD1/MAO-B inhibitor ORY-2001 prevents the development of the memory deficit in samp8 mice through induction of neuronal plasticity and reduction of neuroinflammation.</a> Alzheimer&#8217;s &amp; Dementia. 11 (7), P905 (2015).</li><li>Schmidt, D. M., McCafferty, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-2-Phenylcyclopropylamine+is+a+mechanism-based+inactivator+of+the+histone+demethylase+LSD1.">Trans-2-Phenylcyclopropylamine is a mechanism-based inactivator of the histone demethylase LSD1.</a> Biochemistry. 46 (14), 4408-4416 (2007).</li><li>Forneris, F., Binda, C., Vanoni, M. A., Battaglioli, E., Mattevi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+histone+demethylase+LSD1+reads+the+histone+code.">Human histone demethylase LSD1 reads the histone code.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41360-41365 (2005).</li><li>Gonz#225;lez, E. C., Maes, T., Crusat, C. M., Mu#241;oz, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oryzon+Genomics,+Methods+to+determine+kdm1a+target+engagement+and+chemoprobes+useful+therefor.">Oryzon Genomics, Methods to determine kdm1a target engagement and chemoprobes useful therefor.</a> , (2016).</li><li>Mascaró, C., Ortega, A., Carceller, E., Rruiz Rodriguez, R., Cicero, F., Lunardi, S., Yu, L., Hilbert, M., Maes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoprobe-based+assays+of+histone+lysine+demethylase+1A+target+occupation+enable+in+vivo+pharmacokinetics+and+-dynamics+studies+of+KDM1A+inhibitors.">Chemoprobe-based assays of histone lysine demethylase 1A target occupation enable in vivo pharmacokinetics and -dynamics studies of KDM1A inhibitors.</a> Journal of Biological Chemistry. , (2019).</li><li>Rodriguez-Suarez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Homogeneous+Nonradioactive+Methyltransferase+and+Demethylase+Assays+Targeting+Histone+H3+Lysine+4.">Development of Homogeneous Nonradioactive Methyltransferase and Demethylase Assays Targeting Histone H3 Lysine 4.</a> Journal of Biomolecular Screening. 17 (1), 49-58 (2011).</li><li>Lynch, J. T., Cockerill, M. J., Hitchin, J. R., Wiseman, D. H., Somervaille, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD86+expression+as+a+surrogate+cellular+biomarker+for+pharmacological+inhibition+of+the+histone+demethylase+lysine-specific+demethylase+1.">CD86 expression as a surrogate cellular biomarker for pharmacological inhibition of the histone demethylase lysine-specific demethylase 1.</a> Analytical Biochemistry. 442 (1), 104-106 (2013).</li><li>Schulz-Fincke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-activity+studies+on+N-Substituted+tranylcypromine+derivatives+lead+to+selective+inhibitors+of+lysine+specific+demethylase+1+(LSD1)+and+potent+inducers+of+leukemic+cell+differentiation.">Structure-activity studies on N-Substituted tranylcypromine derivatives lead to selective inhibitors of lysine specific demethylase 1 (LSD1) and potent inducers of leukemic cell differentiation.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 144, 52-67 (2018).</li><li>Ishii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CETSA+quantitatively+verifies+in+vivo+target+engagement+of+novel+RIPK1+inhibitors+in+various+biospecimens.">CETSA quantitatively verifies in vivo target engagement of novel RIPK1 inhibitors in various biospecimens.</a> Scientific Report. 7, 13000 (2017).</li><li>Maes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORY-2001:+An+Epigenetic+drug+for+the+treatment+of+cognition+defects+in+Alzheimer&#8217;s+disease+and+other+neurodegenerative+disorders.">ORY-2001: An Epigenetic drug for the treatment of cognition defects in Alzheimer&#8217;s disease and other neurodegenerative disorders.</a> Alzheimer&#8217;s &amp; Dementia. 12 (7), P1192 (2017).</li></ol>

Protokollen præsenteres her blev udviklet til direkte at måle KDM1A Target engagement ved hjælp af en roman KDM1A chemoprobe Capture baseret ELISA. Metoden er blevet valideret på dyrkede humane cellelinjer og ex vivo-prøver fra menneske, rotte og mus og bavian (herunder Pbm'er, lunge, hjerne, hud, tumorer), men kan let anvendes på andre arter, hvor KDM1A antistof Target epitoper og katalytisk Center er bevaret. Da OG-881 er en aktivitet baseret chemoprobe, er prøve kvaliteten vigtig og korrekt manipulation og beva...

Lysin specifik demethylase 1 (KDM1A)1 er en demethylase involveret i kontrollen af gen transskription. Dette protein er dukket op som en kandidat farmakologiske mål2 i onkologi; herunder akut myeloid Leukemia3 (AML), Myelodysplasi syndrom (MDS)4, myelofibrose (MF)5,6, småcellet lungekræft (SCLC)7; i seglcellesygdom (SCD)8,9, og i centrale nervesystem sygdomme, herunder Alzheimers sygdom (ad), multipel sklerose (MS); og i aggression10.
De fleste af de KDM1A hæmmende forbindelser i klinisk udvikling er cyclopropylamin derivater og hæmmer proteinet ved kovalent binding til dets Flavin adenin dinucleotid (fad) cofaktor11. Hæmning af KDM1A inducerer genekspression ændringer, men disse ændringer varierer enormt på tværs af væv, celletyper, eller sygdomstilfælde. Hæmning af KDM1A ændrer også Histon mærker12, men disse ændringer er generelt produceres lokalt på et bestemt sted i genomet, og er igen, meget væv og celle specifikke.
Protokollen blev udviklet til direkte at måle KDM1A Target engagement i biologiske prøver og er blevet optimeret til brug med cyclopropylamin afledte hæmmere. Analysen er baseret på ELISA-teknologi og analyserer parallelt, samlet og gratis (dvs. ubundet af inhibitor) KDM1A i et indfødt proteinekstrakt fra en biologisk prøve i en solid fase analyse. Som et første skridt lyses den biologiske prøve i nærværelse af den biotinylerede KDM1A selektive chemoprobe og-88113,14, afledt af den selektive KDM1A inhibitor ORY-1001 (iadademstat), en potent hæmmer af KDM1A i kliniske udvikling til behandling af onkologiske sygdomme. Chemoprobe har en IC50 for KDM1A af 120 nm og omfatter en fad bindende delen forbundet med en biotinyleret polyethylenglycol (peg)-hale. Chemoprobe binder udelukkende til den frie KDM1A, men ikke til den inhibitor bundne KDM1A i prøven. Efter chemoprobe bindingen optages de KDM1A, der indeholder komplekser i prøven, på mikrotiterplader med streptavidin belagt overflade for at bestemme fri KDM1A eller på plader belagt med et monoklonalt anti-KDM1A Capture-antistof for at bestemme total KDM1A. Efter vask inkuberet begge plader med anti-KDM1A-detektionsanti stof, vaskes igen og inkuberet med et sekundært HRP-konjugeret æsel anti-kanin IgG-antistof til påvisning ved hjælp af et luminescerende substrat og kvantificering ved måling af relative lysenheder (RLU) i et luminometer (figur 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59390/59390fig1.jpg"> Figur 1. Skema af ELISA enzym forbundet chemoprobe immunoabsorber ende assay for KDM1A Target engagement: A) bestemmelse af total KDM1A ved hjælp af sandwich Elisa og B) bestemmelse af gratis KDM1A ved hjælp af chemoprobe Elisa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59390/59390fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
En standardkurve er inkluderet i begge ELISA-plader for at verificere lineariteten af hver analyse. Bestemmelsen af KDM1A Target engagement i hver prøve beregnes derefter som en relativ værdi til den præ-dosis eller køretøj behandlet prøve.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0,05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 X Protease Inhibitor Tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>#11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep well storage block</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#734-1679</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well ELISA plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>#436110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive black Film</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>#6050173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive transparent Film</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#60941-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated KDM1A probe OG-881</td>
			<td>Oryzon Genomics S.A.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># 3117057001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#23208)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Protein Assay</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>#500-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lysis buffer 10X</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#9803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for 96- well plates</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>Rotina 420R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full length, enzymatically active human Recombinant LSD1 / KDM1A</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>#31426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 5 Project</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol-Enhacer and Peroxide Solution (Chemiluminescent Substrate)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#37074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader Infinite 200-Tecan</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Infinite 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal capture antibody Anti-KDM1A (N-terminal epitope)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>#ab53269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle G18 gauge blunt</td>
			<td>BD</td>
			<td>#303129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORY-1001 (iadademstat)</td>
			<td>Oryzon Genomics S.A.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBMC separation tubes 10 ml</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>#163288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBMC separation tubes 50 ml</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>#227288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate shaker</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td>Rotamax 120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal detection antibody Anti-KDM1A (C-terminal epitope)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#672184BF-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody Peroxidase-conjugated Donkey Anti-rabbit IgG</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#31458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer cuvette 1.5</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>#302100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer for cuvette</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GeneQuant 1300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>#Z704A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>#303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 1 ultrapure water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Milli-Q Advantage A10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner</td>
			<td>VWR</td>
			<td>USC200T</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct measurement of kdm1a target engagement using chemoprobe-based immunoassays

Vurderingen af Target engagement, defineret som samspillet mellem et lægemiddel med det protein, det var designet til, er et grundlæggende krav for fortolkningen af den biologiske aktivitet af enhver forbindelse i narkotika udvikling eller i grundlæggende forskningsprojekter. I Epigenetik, Target engagement er oftest vurderes af analysen af proxy markører i stedet for at måle Unionen af forbindelsen til målet. Downstream biologiske udlæsninger, der er blevet analyseret omfatter Histon Mark modulation eller genekspression ændringer. KDM1A er en lysin demethylase, der fjerner methylgrupper fra mono-og dimethylerede H3K4, en ændring forbundet med hæmning af genekspression. Graduering af proxy markører er afhængig af celletype og funktion af den genetiske sammenstilling af de undersøgte celler, hvilket kan gøre fortolkning og Cross-case sammenligning ganske vanskeligt. For at omgå disse problemer, en alsidig protokol præsenteres for at vurdere dosis effekter og dynamikken i den direkte KDM1A Target engagement. Den beskrevne analyse gør brug af en KDM1A chemoprobe til at indfange og kvantificere uhæmmet enzym, kan anvendes bredt på celler eller vævsprøver uden behov for genetisk modifikation, har et fremragende vindue til påvisning, og kan bruges både til grundforskning og analyse af kliniske prøver.

Lineariteten af total og fri KDM1A bestemmelse.
En standard serie blev udarbejdet som beskrevet i trin 5.3.2., ved hjælp af 0 til 2500 PG af fuld længde humant rekombinant KDM1A enzym. RLU-værdierne for total og Free rKDM1A blev vurderet for at verificere lineariteten (figur 2a og 2b). Data er repræsenteret som middelværdien fra 3 eksperimenter med 3 tekniske r...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Measurement of KDM1A Target Engagement Using Chemoprobe-based Immunoassays at JoVE.com

Direct Measurement of KDM1A Target Engagement Using Chemoprobe-based Immunoassays

Direkte måling af KDM1A Target engagement ved hjælp af Chemoprobe-baserede Immunoassays

Her præsenterer vi en protokol til måling KDM1A Target engagement i en menneske-eller dyrecelle, væv eller blodprøver behandlet med KDM1A-hæmmere. Protokollen anvender chemoprobe-mærkning af det frie KDM1A enzym og direkte kvantificering af målbesættelsen ved hjælp af chemoprobe-baserede immunassays og kan anvendes i prækliniske og kliniske studier.

The assessment of the target engagement, defined as the interaction of a drug with the protein it was designed for, is a basic requirement for the ...

Vurderingen af målet engagement, det vil sige samspillet mellem et lægemiddel med det protein, det var designet til, er et grundlæggende krav til fortolkning af den biologiske aktivitet af enhver forbindelse i udviklingen af lægemidler, eller i grundlæggende forskningsprojekter. Den største fordel ved denne teknik er, at den muliggør direkte måling af dosiseffekt og dynamikken i KDM1A-målengagementet i stedet for målinger af downstream-effekter såsom histonmærker og udtryk. Denne teknik kan anvendes i grundforskning og også i kliniske forsøg, i onkologiske CNS eller andre sygdomme, der behandles med KDM1A-hæmmer for at studere farmakodynamik.Denne teknik er baseret på en kemoprobe udviklet til at studere ORY-1001, iadademstat, men kan virkelig bruges til andre KDM1A-hæmmere, og strategien kan anvendes på andre mål. Proceduren vil blive demonstreret af Raquel Ruiz, driftsleder af PK / PD opdagelse platform fra mit laboratorium. Under cellebehandling med ORY-1001 binder forbindelsen sig til KDM1A-proteinet, der er til stede i kernen.For at begynde denne procedure, hente en 10 microliter engangsbrug aliquot af 20 millimolar biotinyleret sonde OG-881 lager opløsning fra køleskabet og lad det varme op ved stuetemperatur i 10 minutter. Ved hjælp af et mikropipet med filterspidser fortyndes stamopløsningen serielt for at forberede den to mikromolararbejdsopløsning. Dernæst opløses en tablet proteasehæmmer i en milliliter PBS i et mikrocentrifugerør.For hver milliliter af det ønskede volumen af 1x celle lysis buffer med kemoprobe blandes 100 mikroliter af kommercielle opnåede 10x celle lysis buffer, 150 mikroliter af 10x proteasehæmmer, 12,5 mikroliter af de to mikromolar OG-881 arbejdsopløsning og 737,5 mikroliter af type-1 dobbelt destilleret vand. Celler lyses i 1x lysis buffer i nærvær af kemoprobe, der binder sig til enhver gratis KDM1A protein. For at forberede sig fra væv, bruge en morter og støder, der er kølet på tøris til at pulverisere og homogenisere en en kubisk centimeter stykke frosset væv.Aliquot vævet i engangs-hætteglas, og sørg for at overføre ca 40 milligram væv pulver i hvert hætteglas, og samtidig undgå optøning på alle tidspunkter. Opbevar prøverne ved 80 grader Celsius, indtil de er klar til at blive behandlet. For at forberede sig fra cellepiller skal pelletpend pellet af ca. 10 millioner celler i 200 mikroliter af 1x cellelysis buffer indeholdende 25 nanomolar OG-881.Vortex hver prøve kort og holde dem på is i fem minutter. Ved hjælp af en sonicator, sonikere prøverne med tre impulser på 45 kilohertz varig i 20 sekunder hver. Prøverne sættes på is i 20 sekunder mellem impulserne.Hold prøverne på is i yderligere fem minutter. Derefter vortex kort og centrifuge prøverne på 14, 000 gange G i 10 minutter i en centrifuge, der er pre-kølet ved fire grader Celsius. Ved hjælp af en en milliliter mikropipet overføre hver supernatant i en separat 1,5 milliliter mikrocentrifuge rør.Lad rørene være på is i to timer før forarbejdning. Derefter kvantificere den indfødte protein ved hjælp af Bradford assay som skitseret i tekstprotokollen. En totalplade er belagt med anti-KDM1A antistof.Gratis plade er belagt med streptavidin. Celle lysate tilsættes derefter til begge plader og KDM1A kompleks er fanget direkte eller gennem kemoprobe. Plader vaskes og inkuberes med anti-KDM1A detektion antistof og et sekundært antistof koblet til peberrodperoxidase.Endelig tilføjes selvlysende underlag og signal genereret. For total KDM1A ELISA klargøres 10 milliliter KDM1A-opsamlingsantistof i PBS til en endelig koncentration på to mikrogram pr. milliliter for hver plade. Overfør 100 mikroliter i hver brønd af pladen.Gratis KDM1A ELISA klargør 10 milliliter streptavidin i PBS som en koncentration på 10 mikrogram pr. milliliter for hver plade. Overfør 100 mikroliter i hver brønd af pladen. Derefter top forsegle hver plade med klæbende film og inkubere natten over ved fire grader Celsius.Den næste dag, fjerne pladerne fra køleskabet og lad dem ligevægt ved stuetemperatur i ca 45 minutter. Vask hver plade tre gange med vaskebuffer, og sørg for at banke på pladen på papirservietter efter hvert vasketrin for at fjerne eventuelle resterende opløsning. Tilføj 200 mikroliter af blokerende buffer til hver brønd af begge plader.Top forsegle pladerne med klæbende film og inkubere ved stuetemperatur i to timer. I mellemtiden fortyndes de tidligere opnåede indfødte proteinekstrakter med PBS til den rette koncentration og lægger pladen ud for at forberede en standardkurve ved hjælp af human rKDM1A som beskrevet i tekstprotokollen. Når inkubationen på to timer er afsluttet, skal du kassere blokeringsbufferen og vaske pladerne med vaskebuffer, og sørg for at banke pladen på papirservietter efter hvert vasketrin for at fjerne eventuelle resterende opløsninger.De relevante fortyndede prøver overføres til en nedkølet 96 dyb brøndopbevaringsblok efter pladefordelingen i tabel to i tekstprotokollen. Hold denne blok på is, mens pipettering 100 mikroliter pr godt ind i den samlede og gratis ELISA plader efter pladefordelingen findes i tabel tre i tekstprotokollen. Inkuber ved stuetemperatur i en time, kassér derefter prøverne og vask pladerne fem gange med vaskebuffer.Der tilberedes 20 milliliter kaninanti-KDM1A-detektionsantistof ved blokerende buffer ved en koncentration på 0,125 mikrogram pr. milliliter. Der tilsættes 100 mikroliter af detektionsantistofopløsningen til hver brønd af begge plader, undtagen dem, der svarer til de negative kontroller. Top forsegle pladerne med klæbende film og inkubere ved stuetemperatur i en time.Derefter kasseres detektionsantistofopløsningen, og pladerne vaskes seks gange med vaskebuffer. Der tilberedes 25 milliliter sekundært antikaninantistof fra ged, HRP, til en fortynding på 1 til 5.000 i blokerende buffer. Der tilsættes 100 mikroliter af den sekundære antistofopløsning til hver brønd af mikrotiterpladerne og inkuberes ved stuetemperatur i en time.30 minutter før afslutningen af denne inkubation blandes lige dele luminolforstærker og peroxidopløsning i en ravflaske under bløde lysforhold. Lad denne blanding være ved stuetemperatur. Når inkubationen på en time er afsluttet, kasseres den sekundære antistofopløsning, og pladerne vaskes seks gange med vaskebuffer.Dernæst pipet 100 mikroliter af luminol arbejdsløsning til hver brønd af pladerne, og sørg for at pipet meget langsomt for at undgå bobledannelse. Brug en timer til at styre tiden mellem tilsætning af opløsningen og luminescensmålingen af pladerne og hold denne tid konstant for at opnå en god interanalysere reproducerbarhed. Top forsegle pladerne med klæbende film og centrifuge ved 500 gange G og ved stuetemperatur i 45 sekunder for at fjerne eventuelle resterende bobler.Inkuber pladerne på en pladeshaker ved 100 omdrejninger i et minut. Fjern derefter den selvklæbende film og sæt pladen i en mikropladelæser og lad den blive stabiliseret i tre minutter for at stabilisere temperaturen ved 25 grader Celsius. De relative luminescensenheder for hver ELISA-pladeanalyse aflæses.Gem og kopiér de rå RLU-værdier fra de rå dataregnearkfiler til yderligere analyse. I denne undersøgelse, en ny KDM1A kemoprobe fange baseret ELISA bruges til direkte at måle KDM1A mål engagement i celler og vævsprøver. RLU-værdierne for total og fri rKDM1A vurderes for at kontrollere lineariteten.RLU-værdierne for den samlede og frie KDM1A, der påvises i humane PBM'er fra tre uafhængige frivillige, overlejres derefter standardkurven. AML-celler dyrkes efter provideranbefade og behandles med enten køretøj eller ORY-1001 i forskellige koncentrationer. Det oprindelige proteinekstrakt opnås ved tilstedeværelse af 25 millimolar OG-881 kemoprobe, og 0,5 mikrogram totalprotein anvendes til at udføre målengagementets analyse.Samlet og gratis KDM1A bestemmes derefter, og procentdelen af målengagementet for ORY-1001 til KDM1A beregnes i forhold til køretøjet. Den dosisresponsive KDM1A-målengagement i PBM'er og i lungebehandling af rotter med ORY-1001 ved oral sonde, beregnet relativt køretøjsgruppen vises her. Ex vivo inkubation med 25 nanomolar ORY-1001 af lungeproteinekstrakter fra de køretøjsbehandlede dyr giver endnu fuld TE, men øger ikke yderligere TE i prøver fra rotter behandlet i fire dage med 30 mikrogram pr. kg ORY-1001, hvilket bekræfter, at KDM1A allerede var fuldt hæmmet in vivo.Denne protokol vurderer KDM1A-målengagement ved at måle frit og samlet KDM1A. Husk det kræver indfødte protein ekstraktion. Denne teknik kan bruges på prøver fra forskellige arter til at vurdere en bestemt hæmmer, også til at screene for nye inhibitorer.Kemoprobe, der anvendes i denne undersøgelse, kan også anvendes til kemoproteomics til at studere KDM1A interactum. Husk at arbejde sikkert og til enhver tid respektere forebyggende foranstaltninger ved håndtering af biologiske prøver og bioaktive forbindelser som KDM1A-hæmmer.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Covalent Binding of Antibodies to Cellulose Paper Discs and Their Applications in Naked-eye Colorimetric Immunoassays

Kovalent binding af antistoffer til cellulosepapir diske og deres anvendelser i Naked-eye Farvemåletekniske Immunoassays

This report presents two methods for the covalent immobilization of capture antibodies on cellulose filter paper grade No. 1 (medium-flow filter paper) ...

Measurement of Basal and Forskolin-stimulated Lipolysis in Inguinal Adipose Fat Pads

Måling af basal og forskolin-stimuleret lipolyse i fedtpads

Lipolysis is a process by which the lipid stored as triglycerides in adipose tissues are hydrolyzed into glycerol and fatty acids. This article describes ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

Udnytte en omfattende Immunoprecipitation berigelse System for at identificere en endogen posttranslationel modifikation profil for Target proteiner

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Simultaneous Measurement of Superoxide/Hydrogen Peroxide and NADH Production by Flavin-containing Mitochondrial Dehydrogenases

Samtidig måling af superoxid/Hydrogen Peroxid og NADH produktion af Flavin-holdige mitokondrie Dehydrogenases

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include ...

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

Måling af mitokondrie iltforbrug i Permeabilized fibre fra Drosophila bruger minimale mængder af væv

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

A Direct Force Probe for Measuring Mechanical Integration Between the Nucleus and the Cytoskeleton

En direkte kraft sonde til at måle mekanisk Integration mellem kernen og cytoskelettet

The mechanical properties of the nucleus determine its response to mechanical forces generated in cells. Because the nucleus is molecularly continuous ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Ved hjælp af højt indhold Imaging for at kvantificere mål Engagement i vedhængende celler

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Høj følsomhed måling af transskription faktor-DNA bindende tilhørsforhold ved konkurrencedygtige titrering med Fluorescens mikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Cortisol Measurement in Koala (Phascolarctos cinereus) Fur

Cortisol Measurement in Koala Phascolarctos cinereus Fur

Cortisol måling i Koala (Phascolarctos cinereus) pels

Optimal methods of hormone extraction used to measure stress in animals across sample types are not always the same. Australia&#39;s iconic marsupial ...

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability DARTS assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

En semi-kvantitativ stof affinitet lydhør Target stabilitet (dart) assay til at studere Rapamycin/mTOR interaktion

Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) is a robust method for detection of novel small molecule protein targets. It can be used to verify known ...