Name: direct measurement of kdm1a target engagement using chemoprobe-based immunoassays
Uploaded: 2019-06-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Measurement of KDM1A Target Engagement Using Chemoprobe-based Immunoassays at JoVE.com

Deze studie werd gefinancierd door Oryzon Genomics. S.A., Hoffman-La Roche, en deels ondersteund door het CIIP-20152001 en RETOS Collaboration Program RTC-2015-3332-1.

Bloedmonsters werden verkregen van het Instituto de Recheréda van de onderzoekers Sant Pau biobank volgens de Spaanse wetgeving (Real Decreto de Biobancos 1716/2011) en de goedkeuring van de lokale ethische comités. Studies met dierlijk weefsel werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtsnoeren voor de verzorging en het gebruik van proefdieren (Richtlijn 86/609/EEG van de Europese Gemeenschappen) die is ingesteld door het ethisch comité voor dierproeven op de PRAAL-PCB.
<p class="jove...

<ol>
	<li>Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+demethylation+mediated+by+the+nuclear+amine+oxidase+homolog+LSD1.">Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1.</a> Cell. 119 (7), 941-953 (2004).</li><li>Maiques-Diaz, A., Somervaille, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LSD1:+biologic+roles+and+therapeutic+targeting.">LSD1: biologic roles and therapeutic targeting.</a> Epigenomics. 8 (8), 1103-1116 (2016).</li><li>Maes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORY-1001,+a+Potent+and+Selective+Covalent+KDM1A+Inhibitor,+for+the+Treatment+of+Acute+Leukemia.">ORY-1001, a Potent and Selective Covalent KDM1A Inhibitor, for the Treatment of Acute Leukemia.</a> Cancer Cell. 33 (3), 495-511 (2018).</li><li>Sugino, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+LSD1+inhibitor+NCD38+ameliorates+MDS-related+leukemia+with+complex+karyotype+by+attenuating+leukemia+programs+via+activating+super-enhancers.">A novel LSD1 inhibitor NCD38 ameliorates MDS-related leukemia with complex karyotype by attenuating leukemia programs via activating super-enhancers.</a> Leukemia. 31 (11), 2303-2314 (2017).</li><li>Kleppe, M., Shank, K., Efthymia, P., Riehnhoff, H., Levine, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysine-Specific+Histone+Demethylase,+LSD1,+(KDM1A)+As+a+Novel+Therapeutic+Target+in+Myeloproliferative+Neoplasms.">Lysine-Specific Histone Demethylase, LSD1, (KDM1A) As a Novel Therapeutic Target in Myeloproliferative Neoplasms.</a> Blood. 126, 601 (2015).</li><li>Jutzi, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LSD1+Inhibition+Prolongs+Survival+in+Mouse+Models+of+MPN+by+Selectively+Targeting+the+Disease+Clone.">LSD1 Inhibition Prolongs Survival in Mouse Models of MPN by Selectively Targeting the Disease Clone.</a> HemaSphere. 2 (3), 54 (2018).</li><li>Mohammad, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Hypomethylation+Signature+Predicts+Antitumor+Activity+of+LSD1+Inhibitors+in+SCLC.">DNA Hypomethylation Signature Predicts Antitumor Activity of LSD1 Inhibitors in SCLC.</a> Cancer Cell. 28 (1), 57-69 (2015).</li><li>Rivers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RN-1,+a+potent+and+selective+lysine-specific+demethylase+1+inhibitor,+increases+&#947;-globin+expression,+F+reticulocytes,+and+F+cells+in+a+sickle+cell+disease+mouse+model.">RN-1, a potent and selective lysine-specific demethylase 1 inhibitor, increases &#947;-globin expression, F reticulocytes, and F cells in a sickle cell disease mouse model.</a> Experimental Hematology. 43 (7), 546-553 (2015).</li><li>Rivers, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+administration+of+the+LSD1+inhibitor+ORY-3001+increases+fetal+hemoglobin+in+sickle+cell+mice+and+baboons.">Oral administration of the LSD1 inhibitor ORY-3001 increases fetal hemoglobin in sickle cell mice and baboons.</a> Experimental Hematology. 67, 60-64 (2018).</li><li>Buesa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dual+LSD1/MAO-B+inhibitor+ORY-2001+prevents+the+development+of+the+memory+deficit+in+samp8+mice+through+induction+of+neuronal+plasticity+and+reduction+of+neuroinflammation.">The dual LSD1/MAO-B inhibitor ORY-2001 prevents the development of the memory deficit in samp8 mice through induction of neuronal plasticity and reduction of neuroinflammation.</a> Alzheimer&#8217;s &amp; Dementia. 11 (7), P905 (2015).</li><li>Schmidt, D. M., McCafferty, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-2-Phenylcyclopropylamine+is+a+mechanism-based+inactivator+of+the+histone+demethylase+LSD1.">Trans-2-Phenylcyclopropylamine is a mechanism-based inactivator of the histone demethylase LSD1.</a> Biochemistry. 46 (14), 4408-4416 (2007).</li><li>Forneris, F., Binda, C., Vanoni, M. A., Battaglioli, E., Mattevi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+histone+demethylase+LSD1+reads+the+histone+code.">Human histone demethylase LSD1 reads the histone code.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41360-41365 (2005).</li><li>Gonz#225;lez, E. C., Maes, T., Crusat, C. M., Mu#241;oz, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oryzon+Genomics,+Methods+to+determine+kdm1a+target+engagement+and+chemoprobes+useful+therefor.">Oryzon Genomics, Methods to determine kdm1a target engagement and chemoprobes useful therefor.</a> , (2016).</li><li>Mascaró, C., Ortega, A., Carceller, E., Rruiz Rodriguez, R., Cicero, F., Lunardi, S., Yu, L., Hilbert, M., Maes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoprobe-based+assays+of+histone+lysine+demethylase+1A+target+occupation+enable+in+vivo+pharmacokinetics+and+-dynamics+studies+of+KDM1A+inhibitors.">Chemoprobe-based assays of histone lysine demethylase 1A target occupation enable in vivo pharmacokinetics and -dynamics studies of KDM1A inhibitors.</a> Journal of Biological Chemistry. , (2019).</li><li>Rodriguez-Suarez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Homogeneous+Nonradioactive+Methyltransferase+and+Demethylase+Assays+Targeting+Histone+H3+Lysine+4.">Development of Homogeneous Nonradioactive Methyltransferase and Demethylase Assays Targeting Histone H3 Lysine 4.</a> Journal of Biomolecular Screening. 17 (1), 49-58 (2011).</li><li>Lynch, J. T., Cockerill, M. J., Hitchin, J. R., Wiseman, D. H., Somervaille, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD86+expression+as+a+surrogate+cellular+biomarker+for+pharmacological+inhibition+of+the+histone+demethylase+lysine-specific+demethylase+1.">CD86 expression as a surrogate cellular biomarker for pharmacological inhibition of the histone demethylase lysine-specific demethylase 1.</a> Analytical Biochemistry. 442 (1), 104-106 (2013).</li><li>Schulz-Fincke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-activity+studies+on+N-Substituted+tranylcypromine+derivatives+lead+to+selective+inhibitors+of+lysine+specific+demethylase+1+(LSD1)+and+potent+inducers+of+leukemic+cell+differentiation.">Structure-activity studies on N-Substituted tranylcypromine derivatives lead to selective inhibitors of lysine specific demethylase 1 (LSD1) and potent inducers of leukemic cell differentiation.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 144, 52-67 (2018).</li><li>Ishii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CETSA+quantitatively+verifies+in+vivo+target+engagement+of+novel+RIPK1+inhibitors+in+various+biospecimens.">CETSA quantitatively verifies in vivo target engagement of novel RIPK1 inhibitors in various biospecimens.</a> Scientific Report. 7, 13000 (2017).</li><li>Maes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORY-2001:+An+Epigenetic+drug+for+the+treatment+of+cognition+defects+in+Alzheimer&#8217;s+disease+and+other+neurodegenerative+disorders.">ORY-2001: An Epigenetic drug for the treatment of cognition defects in Alzheimer&#8217;s disease and other neurodegenerative disorders.</a> Alzheimer&#8217;s &amp; Dementia. 12 (7), P1192 (2017).</li></ol>

Het hier gepresenteerde protocol is ontwikkeld om KDM1A doel betrokkenheid direct te meten met behulp van een roman KDM1A chemoprobe Capture based ELISA. De methode is gevalideerd op gekweekte menselijke cellijnen en ex vivo monsters van mens, rat en muis en baviaan (inclusief PBMCs, longen, hersenen, huid, tumoren), maar kan gemakkelijk worden toegepast op andere soorten waarin het KDM1A antilichaam doelwit epitopen en katalytische centrum worden bewaard. Aangezien OG-881 een op activiteiten gebaseerde chemoprobe is, is...

Lysine specifieke demethylase 1 (KDM1A)1 is een demethylase betrokken bij de controle van gentranscriptie. Dit eiwit is ontstaan als een kandidaat farmacologisch doel2 in oncologie; waaronder acute myeloïde leukemie3 (AML), Myelodysplasie syndroom (MDS)4, myelofibrose (MF)5,6, kleincellige longkanker (SCLC)7; in sikkelcelziekte (SCD)8,9, en in het centrale zenuwstelsel ziekten met inbegrip van de ziekte van Alzheimer (AD), multiple sclerose (MS); en in agressie10.
De meeste van de KDM1A remmende verbindingen in de klinische ontwikkeling zijn cyclopropylamine derivaten en remmen het eiwit door covalente binding aan zijn flavine adenine dinucleotide (FAD) cofactor11. Remming van KDM1A induceert genexpressie veranderingen, maar deze veranderingen variëren enorm over weefsels, celtypen of ziektegevallen. Remming van KDM1A verandert ook Histon-markeringen12, maar deze veranderingen worden meestal lokaal geproduceerd op een specifieke site in het genoom, en zijn opnieuw, zeer weefsel-en celspecifiek.
Het protocol is ontwikkeld om direct KDM1A doel betrokkenheid bij biologische monsters te meten en is geoptimaliseerd voor gebruik met cycloopropylamine-remmers. De test is gebaseerd op ELISA-technologie en analyseert, parallel, totaal en vrij (d.w.z. ongebonden door remmer) KDM1A in een native proteïne-extract van een biologisch monster in een vaste fase test. Als eerste stap wordt het biologisch monster gelyseerd in aanwezigheid van de biotinyleerd KDM1A selectieve chemoprobe og-88113,14, afgeleid van de selectieve KDM1A remmer ORY-1001 (iadademstat), een krachtige remmer van KDM1A in klinisch ontwikkeling voor de behandeling van oncologische ziekte. De chemoprobe heeft een IC50 voor KDM1A van 120 nm en bevat een Fad binding gedeelte gekoppeld aan een biotinyleerd polyethyleenglycol (PEG)-staart. De chemoprobe bindt uitsluitend aan de vrije KDM1A, maar niet aan de KDM1A van de remmer in het monster. Na de binding van chemoprobe worden de KDM1A met complexen in het monster gevangen op microtiterplaten met streptavidine gecoat oppervlak om vrije KDM1A te bepalen, of op platen bekleed met een monoklonaal anti-KDM1A Capture antilichaam om de totale KDM1A te bepalen. Na het wassen worden beide platen geïnfiltreerd met een anti-KDM1A detectie-antilichaam, opnieuw gewassen, en geïnfiltreerd met een secundaire HRP-geconjugeerde ezel anti-Rabbit IgG antilichaam voor detectie met behulp van een luminescente substraat en kwantificering door het meten van relatieve verlichtingseenheden (RLU) in een luminometer (Figuur 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59390/59390fig1.jpg"> Figuur 1. Schema van ELISA-enzym gekoppeld chemoprobe-immunoabsorberende test voor KDM1A target engagement: A) bepaling van het totaal KDM1A met behulp van sandwich-Elisa en B) bepaling van vrije KDM1A met behulp van CHEMOPROBE Elisa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59390/59390fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
In beide ELISA-platen wordt een standaard curve opgenomen om de lineariteit van elke test te controleren. De bepaling van KDM1A doel betrokkenheid in elk monster wordt vervolgens berekend als een relatieve waarde voor de voor dosis of het behandelde monster.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0,05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 X Protease Inhibitor Tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>#11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep well storage block</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#734-1679</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well ELISA plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>#436110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive black Film</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>#6050173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive transparent Film</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#60941-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated KDM1A probe OG-881</td>
			<td>Oryzon Genomics S.A.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># 3117057001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#23208)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Protein Assay</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>#500-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lysis buffer 10X</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#9803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for 96- well plates</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>Rotina 420R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full length, enzymatically active human Recombinant LSD1 / KDM1A</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>#31426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 5 Project</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol-Enhacer and Peroxide Solution (Chemiluminescent Substrate)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#37074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader Infinite 200-Tecan</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Infinite 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal capture antibody Anti-KDM1A (N-terminal epitope)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>#ab53269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle G18 gauge blunt</td>
			<td>BD</td>
			<td>#303129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORY-1001 (iadademstat)</td>
			<td>Oryzon Genomics S.A.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBMC separation tubes 10 ml</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>#163288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBMC separation tubes 50 ml</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>#227288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate shaker</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td>Rotamax 120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal detection antibody Anti-KDM1A (C-terminal epitope)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#672184BF-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody Peroxidase-conjugated Donkey Anti-rabbit IgG</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#31458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer cuvette 1.5</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>#302100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer for cuvette</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GeneQuant 1300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>#Z704A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>#303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 1 ultrapure water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Milli-Q Advantage A10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner</td>
			<td>VWR</td>
			<td>USC200T</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct measurement of kdm1a target engagement using chemoprobe-based immunoassays

De beoordeling van de beoogde betrokkenheid, gedefinieerd als de interactie van een medicijn met het eiwit waarvoor het is ontworpen, is een basisvoorwaarde voor de interpretatie van de biologische activiteit van een samengestelde drug ontwikkeling of in basis onderzoeksprojecten. In Epigenetics wordt de doel betrokkenheid meestal beoordeeld door de analyse van proxy markers in plaats van het meten van de vereniging van de verbinding met het doel. Downstream biologische uitlezingen die zijn geanalyseerd omvatten de Histon Mark modulatie of genexpressie veranderingen. KDM1A is een lysine demethylase dat methylgroepen verwijdert uit mono-en dimethylated H3K4, een modificatie in verband met het uitzwijgen van genexpressie. Modulatie van de proxy markers is afhankelijk van het celtype en de functie van de genetische make-up van de onderzochte cellen, die interpretatie en Cross-case vergelijking vrij moeilijk kan maken. Om deze problemen te omzeilen, wordt een veelzijdig protocol gepresenteerd om de dosis effecten en de dynamiek van de directe KDM1A doel betrokkenheid te beoordelen. De beschreven test maakt gebruik van een KDM1A chemoprobe voor het vangen en kwantificeren van ongeremd enzym, kan breed worden toegepast op cellen of weefselmonsters zonder de noodzaak van genetische modificatie, heeft een uitstekend detectie venster en kan zowel voor fundamenteel onderzoek worden gebruikt en analyse van klinische monsters.

De lineariteit van de totale en vrije KDM1A bepaling.
Een standaard serie werd opgesteld zoals beschreven in stap 5.3.2, met gebruikmaking van 0 tot 2500 PG van het humane recombinant KDM1A enzym van de volledige lengte. De RLU-waarden van Total en Free rKDM1A werden beoordeeld om de lineariteit te controleren (Figuur 2a en 2b). Gegevens worden weergegeven als gemid...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Measurement of KDM1A Target Engagement Using Chemoprobe-based Immunoassays at JoVE.com

Direct Measurement of KDM1A Target Engagement Using Chemoprobe-based Immunoassays

Directe meting van KDM1A target engagement met behulp van Chemoprobe-gebaseerde immunoassay

Hier presenteren we een protocol voor het meten van KDM1A doel betrokkenheid in een humane of dierlijke cel, weefsel of bloedmonsters behandeld met KDM1A remmers. Het protocol maakt gebruik van chemoprobe-tagging van het vrije KDM1A-enzym en de directe kwantificering van de doel bezetting met behulp van op chemoprobe gebaseerde immunoassays en kan worden gebruikt in preklinisch onderzoek en klinische studies.

The assessment of the target engagement, defined as the interaction of a drug with the protein it was designed for, is a basic requirement for the ...

De beoordeling van de doelbetrokkenheid, dat wil zeggen de interactie van een geneesmiddel met het eiwit waarvoor het is ontworpen, is een basisvereiste voor de interpretatie van de biologische activiteit van een verbinding in de ontwikkeling van geneesmiddelen, of in basisonderzoeksprojecten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een directe meting van het dosis-effect en de dynamiek van de KDM1A-doelbetrokkenheid mogelijk maakt, in plaats van metingen van downstream-effecten zoals histonmarkeringen en expressie. Deze techniek kan worden toegepast in fundamenteel onderzoek en ook in klinische studies, in oncologische CNS of andere ziekten die onderworpen zijn aan behandeling met KDM1A-remmer om farmacodynamica te bestuderen.Deze techniek is gebaseerd op een chemoprobe ontwikkeld om ORY-1001 te bestuderen, iadademstat, maar kan echt worden gebruikt voor andere KDM1A-remmers en de strategie kan worden toegepast op andere doelen. De procedure zal worden aangetoond door Raquel Ruiz, operationeel manager van de PK / PD discovery platform van mijn lab. Tijdens de celbehandeling met ORY-1001 bindt de verbinding zich aan het KDM1A-eiwit dat in de kern aanwezig is.Om te beginnen met deze procedure, haal een 10 microliter eenmalig gebruik aliquot van 20 millimolar biotinylated sonde OG-881 voorraad oplossing uit de koelkast en laat het opwarmen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Met behulp van een micropipet met filtertips verdun je de voorraadoplossing in serie om de twee micromolar werkoplossing voor te bereiden. Los vervolgens een tablet proteaseremmer op in één milliliter PBS in een microcentrifugebuis.Voor elke milliliter van het gewenste volume van 1x cellysebuffer met de chemosonde, meng 100 microliter commerciële verkregen 10x cellysebuffer, 150 microliter van de 10x proteaseremmer, 12,5 microliter van de twee micromolar OG-881 werkoplossing en 737,5 microliter van type-1 dubbel gedestilleerd water. Cellen worden gelysed in 1x lyse buffer in aanwezigheid van de chemoprobe die zich bindt aan een gratis KDM1A eiwit. Om te bereiden op weefsels, gebruik maken van een mortier en stamper die worden gekoeld op droog ijs te verpulveren en homogeniseren een een kubieke centimeter stuk bevroren weefsel.Aliquot het weefsel in single-use flesjes, ervoor te zorgen dat ongeveer 40 milligram weefsel poeder over te dragen in elke flacon, terwijl het vermijden van ontdooien te allen tijde. Bewaar de monsters op 80 graden Celsius tot het klaar is om te verwerken. Om te bereiden op celpellets, resuspend de pellet van ongeveer 10 miljoen cellen in 200 microliters van 1x cel lyse buffer met 25 nanomolar OG-881.Vortex elk monster kort en houd ze op ijs voor vijf minuten. Met behulp van een sonicator, sonicate de monsters met drie pulsen op 45 kilohertz durend voor 20 seconden per stuk. Plaats de monsters 20 seconden tussen de pulsen.Houd de monsters nog vijf minuten op ijs. Vervolgens, vortex kort en centrifugeren de monsters op 14,000 keer G gedurende 10 minuten in een centrifuge die is voorgekoeld op vier graden Celsius. Met behulp van een een milliliter micropipet overdracht elke supernatant in een aparte 1,5 milliliter microcentrifuge buis.Laat de buizen twee uur op ijs staan voor de verwerking. Kwantificeer vervolgens het inheemse eiwit met behulp van de Bradford-test zoals beschreven in het tekstprotocol. Een totale plaat is bekleed met anti-KDM1A antilichaam.De vrije plaat is bekleed met streptavidin. Cellysaat wordt vervolgens aan beide platen toegevoegd en KDM1A-complex wordt direct of via de chemoprobe opgevangen. Platen worden gewassen en geïncubeerd met het anti-KDM1A detectieantilichaam en een secundair antilichaam gekoppeld aan mierikswortelperoxidase.Ten slotte wordt lichtgevend substraat toegevoegd en signaal gegenereerd. Voor de totale KDM1A ELISA, bereid 10 milliliter KDM1A vangen antilichaam in PBS tot een uiteindelijke concentratie van twee microgram per milliliter voor elke plaat. Breng 100 microliter in elke put van de plaat.Bereid voor gratis KDM1A ELISA 10 milliliter streptavidin in PBS voor als een concentratie van 10 microgram per milliliter voor elke plaat. Breng 100 microliter in elke put van de plaat. Dan, top afdichting elke plaat met lijm film en incubeer 's nachts op vier graden Celsius.De volgende dag, verwijder de platen uit de koelkast en laat de ze evenwicht bij kamertemperatuur voor ongeveer 45 minuten. Was elke plaat drie keer met wasbuffer, zorg ervoor dat u de plaat op papieren handdoeken tikt na elke wasstap om eventuele restoplossing te verwijderen. Voeg 200 microliter blokkeerbuffer toe aan elke put van beide platen.Top verzegel de platen met kleeffolie en incubbate op kamertemperatuur gedurende twee uur. Verdun ondertussen de eerder verkregen inheemse eiwitextracten met PBS tot de juiste concentratie en leg de plaat op om een standaardcurve voor te bereiden met behulp van menselijke rKDM1A zoals beschreven in het tekstprotocol. Nadat de incubatie van twee uur is voltooid, gooi de blokkeringsbuffer weg en was de platen met wasbuffer, zodat u na elke wasstap op de plaat op papieren handdoeken tikt om eventuele restoplossing te verwijderen.Breng de juiste verdunde monsters over naar een gekoeld 96 diep putopslagblok volgens de plaatverdeling in tabel twee van het tekstprotocol. Houd dit blok op ijs terwijl u 100 microliters per put in de totale en gratis ELISA-platen pipet volgens de plaatverdeling in tabel drie van het tekstprotocol. Broed een uur bij kamertemperatuur, gooi de monsters weg en was de platen vijf keer met wasbuffer.Bereid 20 milliliter konijn anti-KDM1A detectie antilichaam in het blokkeren van buffer bij een concentratie van 0,125 microgram per milliliter. Voeg 100 microliter van de detectieantilichaamoplossing toe aan elke put van beide platen, behalve die welke overeenkomen met de negatieve controles. Top verzegel de platen met kleeffolie en incubbate op kamertemperatuur gedurende een uur.Gooi hierna de antilichaamoplossing van de detectie weg en was de platen zes keer met wasbuffer. Bereid 25 milliliter secundaire geit anti-konijn antilichaam, HRP, tot een verdunning van een tot 5.000 in het blokkeren buffer. Voeg 100 microliter van de secundaire antilichaamoplossing toe aan elke put van de microtiterplaten en broed een uur lang bij kamertemperatuur uit.Meng 30 minuten voor het einde van deze incubatie gelijke delen van luminolversterker en peroxideoplossing in een oranje fles onder zachte lichtomstandigheden. Laat dit mengsel op kamertemperatuur. Wanneer de incubatie van een uur is voltooid, gooi de secundaire antilichaamoplossing weg en was de platen zes keer met wasbuffer.Vervolgens pipet 100 microliters van de luminol werkoplossing voor elke put van de platen, zorg ervoor dat pipet heel langzaam om bubble vorming te voorkomen. Gebruik een timer om de tijd tussen de toevoeging van de oplossing en de luminescentiemeting van de platen te regelen en houd deze tijd constant om een goede reproduceerbaarheid tussen de test te bereiken. Top verzegel de platen met kleeffolie en centrifuge op 500 keer G en op kamertemperatuur gedurende 45 seconden om eventuele resterende bellen te elimineren.Incubeer de platen op een plaatshaker bij 100 tpm gedurende een minuut. Verwijder vervolgens de kleeffolie en plaats de plaat in een microplatelezer en laat deze drie minuten rusten om de temperatuur te stabiliseren op 25 graden Celsius. Lees de relatieve luminescentie-eenheden van elke ELISA-plaattest.Sla de ruwe RLU-waarden op en kopieer deze uit de raw-gegevensspreadsheetbestanden voor verdere analyse. In deze studie, een nieuwe KDM1A chemoprobe capture gebaseerde ELISA wordt gebruikt om direct te meten KDM1A doel betrokkenheid in cellen en weefsel monsters. De RLU-waarden van totale en gratis rKDM1A worden beoordeeld om de lineariteit te verifiëren.De RLU waarden van de totale en gratis KDM1A gedetecteerd in de menselijke PBMCs van drie onafhankelijke vrijwilligers worden vervolgens bovenop de standaard curve. AML-cellen worden gekweekt volgens aanbevelingen van de provider en worden behandeld met een voertuig of ORY-1001 in verschillende concentraties. Het inheemse eiwitextract wordt verkregen in aanwezigheid van 25 millimolar OG-881 chemoprobe en 0,5 microgram totaal eiwit wordt gebruikt om de analyse van de target engagement uit te voeren.Totaal en gratis KDM1A worden vervolgens bepaald en de percentages van de doelbetrokkenheid van ORY-1001 tot KDM1A worden berekend ten opzichte van het voertuig. De dosis-responsieve KDM1A doel betrokkenheid in PBMCs en in longbehandeling van ratten met ORY-1001 door orale gavage, berekend relatief de voertuiggroep wordt hier getoond. De ex vivo incubatie met 25 nanomolar ORY-1001 longeiwitextracten uit de met het voertuig behandelde dieren levert volledige TE op, maar verhoogt de TE niet verder in monsters van ratten die gedurende vier dagen met 30 microgram per kilogram ORY-1001 zijn behandeld, wat bevestigt dat KDM1A al volledig in vivo was geremd.Dit protocol beoordeelt KDM1A target engagement door het meten van gratis en totale KDM1A. Vergeet niet dat het inheemse eiwitextractie vereist. Deze techniek kan worden gebruikt op monsters van verschillende soorten om een specifieke remmer te beoordelen, ook om te screenen op nieuwe remmers.De chemoprobe gebruikt in deze studie kan ook worden toegepast voor chemoproteomics om de KDM1A interactum te bestuderen. Vergeet niet om veilig te werken en te allen tijde preventieve maatregelen te respecteren bij het hanteren van biologische monsters en bioactieve verbindingen zoals KDM1A-remmer.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Covalent Binding of Antibodies to Cellulose Paper Discs and Their Applications in Naked-eye Colorimetric Immunoassays

Covalente binding van antilichamen aan Cellulose Paper Discs en hun toepassingen in het blote oog Colorimetrisch Immuniteitsonderzoeken

This report presents two methods for the covalent immobilization of capture antibodies on cellulose filter paper grade No. 1 (medium-flow filter paper) ...

Measurement of Basal and Forskolin-stimulated Lipolysis in Inguinal Adipose Fat Pads

Meting van basale en forskolin-gestimuleerde lipolyse in buikvlies vetpads

Lipolysis is a process by which the lipid stored as triglycerides in adipose tissues are hydrolyzed into glycerol and fatty acids. This article describes ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

Met behulp van een uitgebreide Immunoprecipitation verrijking systeem ter identificatie van het profiel van een endogene posttranslationele wijziging voor Target eiwitten

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Simultaneous Measurement of Superoxide/Hydrogen Peroxide and NADH Production by Flavin-containing Mitochondrial Dehydrogenases

Gelijktijdige meting van Superoxide/waterstofperoxide en NADH productie door Flavin-bevattende mitochondriale Dehydrogenases

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include ...

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

Meting van mitochondriale zuurstofverbruik in permeabel vezels van Drosophila met minimale hoeveelheden weefsel

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

A Direct Force Probe for Measuring Mechanical Integration Between the Nucleus and the Cytoskeleton

Een directe kracht sonde voor het meten van de mechanische integratie tussen de kern en het cytoskelet

The mechanical properties of the nucleus determine its response to mechanical forces generated in cells. Because the nucleus is molecularly continuous ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Met behulp van hoog gehalte Imaging om te kwantificeren Target Engagement in Adherente cellen

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hoge gevoeligheid meten van transcriptie Factor-DNA-bindende affiniteiten concurrerende getitreerd wordt met behulp van fluorescentie microscopie

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Cortisol Measurement in Koala (Phascolarctos cinereus) Fur

Cortisol Measurement in Koala Phascolarctos cinereus Fur

Cortisol meting in Koala (Phascolarctos cinereus) bont

Optimal methods of hormone extraction used to measure stress in animals across sample types are not always the same. Australia&#39;s iconic marsupial ...

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability DARTS assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

Een semi-kwantitatieve drug affiniteit responsieve doel stabiliteit (DARTS) assay voor het bestuderen van Rapamycine/mTOR interactie

Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) is a robust method for detection of novel small molecule protein targets. It can be used to verify known ...