Name: direct measurement of kdm1a target engagement using chemoprobe-based immunoassays
Uploaded: 2019-06-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Measurement of KDM1A Target Engagement Using Chemoprobe-based Immunoassays at JoVE.com

מחקר זה ממומן על ידי Oryzon גנומיקה. דרום אמריקה, הופמן-לה רוש, ונתמך באופן חלקי על ידי CIIP-20152001 ו RETOS תוכנית שיתוף פעולה RTC-2015-3332-1.

דגימות הדם הושגו ממכון החקירה של ביודיקה סנט פאו ביאובנק על פי החקיקה הספרדית (האמת Decreto דה Biobancos 1716/2011) ואישור וועדות האתיקה המקומיות. מחקרים עם רקמות בעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות המוסדיות לטיפול ולשימוש בבעלי חיים מעבדתיים (הוראת מועצת הקהילות האירופית 86/609/eec) שהוקמה על ידי הוועדה ה?...

<ol>
	<li>Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+demethylation+mediated+by+the+nuclear+amine+oxidase+homolog+LSD1.">Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1.</a> Cell. 119 (7), 941-953 (2004).</li><li>Maiques-Diaz, A., Somervaille, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LSD1:+biologic+roles+and+therapeutic+targeting.">LSD1: biologic roles and therapeutic targeting.</a> Epigenomics. 8 (8), 1103-1116 (2016).</li><li>Maes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORY-1001,+a+Potent+and+Selective+Covalent+KDM1A+Inhibitor,+for+the+Treatment+of+Acute+Leukemia.">ORY-1001, a Potent and Selective Covalent KDM1A Inhibitor, for the Treatment of Acute Leukemia.</a> Cancer Cell. 33 (3), 495-511 (2018).</li><li>Sugino, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+LSD1+inhibitor+NCD38+ameliorates+MDS-related+leukemia+with+complex+karyotype+by+attenuating+leukemia+programs+via+activating+super-enhancers.">A novel LSD1 inhibitor NCD38 ameliorates MDS-related leukemia with complex karyotype by attenuating leukemia programs via activating super-enhancers.</a> Leukemia. 31 (11), 2303-2314 (2017).</li><li>Kleppe, M., Shank, K., Efthymia, P., Riehnhoff, H., Levine, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysine-Specific+Histone+Demethylase,+LSD1,+(KDM1A)+As+a+Novel+Therapeutic+Target+in+Myeloproliferative+Neoplasms.">Lysine-Specific Histone Demethylase, LSD1, (KDM1A) As a Novel Therapeutic Target in Myeloproliferative Neoplasms.</a> Blood. 126, 601 (2015).</li><li>Jutzi, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LSD1+Inhibition+Prolongs+Survival+in+Mouse+Models+of+MPN+by+Selectively+Targeting+the+Disease+Clone.">LSD1 Inhibition Prolongs Survival in Mouse Models of MPN by Selectively Targeting the Disease Clone.</a> HemaSphere. 2 (3), 54 (2018).</li><li>Mohammad, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Hypomethylation+Signature+Predicts+Antitumor+Activity+of+LSD1+Inhibitors+in+SCLC.">DNA Hypomethylation Signature Predicts Antitumor Activity of LSD1 Inhibitors in SCLC.</a> Cancer Cell. 28 (1), 57-69 (2015).</li><li>Rivers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RN-1,+a+potent+and+selective+lysine-specific+demethylase+1+inhibitor,+increases+&#947;-globin+expression,+F+reticulocytes,+and+F+cells+in+a+sickle+cell+disease+mouse+model.">RN-1, a potent and selective lysine-specific demethylase 1 inhibitor, increases &#947;-globin expression, F reticulocytes, and F cells in a sickle cell disease mouse model.</a> Experimental Hematology. 43 (7), 546-553 (2015).</li><li>Rivers, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+administration+of+the+LSD1+inhibitor+ORY-3001+increases+fetal+hemoglobin+in+sickle+cell+mice+and+baboons.">Oral administration of the LSD1 inhibitor ORY-3001 increases fetal hemoglobin in sickle cell mice and baboons.</a> Experimental Hematology. 67, 60-64 (2018).</li><li>Buesa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dual+LSD1/MAO-B+inhibitor+ORY-2001+prevents+the+development+of+the+memory+deficit+in+samp8+mice+through+induction+of+neuronal+plasticity+and+reduction+of+neuroinflammation.">The dual LSD1/MAO-B inhibitor ORY-2001 prevents the development of the memory deficit in samp8 mice through induction of neuronal plasticity and reduction of neuroinflammation.</a> Alzheimer&#8217;s &amp; Dementia. 11 (7), P905 (2015).</li><li>Schmidt, D. M., McCafferty, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-2-Phenylcyclopropylamine+is+a+mechanism-based+inactivator+of+the+histone+demethylase+LSD1.">Trans-2-Phenylcyclopropylamine is a mechanism-based inactivator of the histone demethylase LSD1.</a> Biochemistry. 46 (14), 4408-4416 (2007).</li><li>Forneris, F., Binda, C., Vanoni, M. A., Battaglioli, E., Mattevi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+histone+demethylase+LSD1+reads+the+histone+code.">Human histone demethylase LSD1 reads the histone code.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41360-41365 (2005).</li><li>Gonz#225;lez, E. C., Maes, T., Crusat, C. M., Mu#241;oz, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oryzon+Genomics,+Methods+to+determine+kdm1a+target+engagement+and+chemoprobes+useful+therefor.">Oryzon Genomics, Methods to determine kdm1a target engagement and chemoprobes useful therefor.</a> , (2016).</li><li>Mascaró, C., Ortega, A., Carceller, E., Rruiz Rodriguez, R., Cicero, F., Lunardi, S., Yu, L., Hilbert, M., Maes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoprobe-based+assays+of+histone+lysine+demethylase+1A+target+occupation+enable+in+vivo+pharmacokinetics+and+-dynamics+studies+of+KDM1A+inhibitors.">Chemoprobe-based assays of histone lysine demethylase 1A target occupation enable in vivo pharmacokinetics and -dynamics studies of KDM1A inhibitors.</a> Journal of Biological Chemistry. , (2019).</li><li>Rodriguez-Suarez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Homogeneous+Nonradioactive+Methyltransferase+and+Demethylase+Assays+Targeting+Histone+H3+Lysine+4.">Development of Homogeneous Nonradioactive Methyltransferase and Demethylase Assays Targeting Histone H3 Lysine 4.</a> Journal of Biomolecular Screening. 17 (1), 49-58 (2011).</li><li>Lynch, J. T., Cockerill, M. J., Hitchin, J. R., Wiseman, D. H., Somervaille, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD86+expression+as+a+surrogate+cellular+biomarker+for+pharmacological+inhibition+of+the+histone+demethylase+lysine-specific+demethylase+1.">CD86 expression as a surrogate cellular biomarker for pharmacological inhibition of the histone demethylase lysine-specific demethylase 1.</a> Analytical Biochemistry. 442 (1), 104-106 (2013).</li><li>Schulz-Fincke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-activity+studies+on+N-Substituted+tranylcypromine+derivatives+lead+to+selective+inhibitors+of+lysine+specific+demethylase+1+(LSD1)+and+potent+inducers+of+leukemic+cell+differentiation.">Structure-activity studies on N-Substituted tranylcypromine derivatives lead to selective inhibitors of lysine specific demethylase 1 (LSD1) and potent inducers of leukemic cell differentiation.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 144, 52-67 (2018).</li><li>Ishii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CETSA+quantitatively+verifies+in+vivo+target+engagement+of+novel+RIPK1+inhibitors+in+various+biospecimens.">CETSA quantitatively verifies in vivo target engagement of novel RIPK1 inhibitors in various biospecimens.</a> Scientific Report. 7, 13000 (2017).</li><li>Maes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORY-2001:+An+Epigenetic+drug+for+the+treatment+of+cognition+defects+in+Alzheimer&#8217;s+disease+and+other+neurodegenerative+disorders.">ORY-2001: An Epigenetic drug for the treatment of cognition defects in Alzheimer&#8217;s disease and other neurodegenerative disorders.</a> Alzheimer&#8217;s &amp; Dementia. 12 (7), P1192 (2017).</li></ol>

הפרוטוקול המוצג כאן פותחה כדי למדוד ישירות KDM1A היעד באמצעות רומן KDM1A chemoprobe ללכוד מבוסס אליסה. השיטה אומתה על קווי הגוף האנושי התרבותי ודגימות vivo לשעבר מן האדם, עכברוש ועכבר בבון (כולל PBMCs, ריאות, המוח, העור, גידולים), אבל יכול להיות מיושם בקלות על מינים אחרים שבו KDM1A נוגדן היעד אפיסקופים ו קטלי...

ליזין מסוים demethylase 1 (KDM1A)1 הוא demethקלז מעורב בשליטה של תמלול גנים. חלבון זה התפתחה כיעד תרופתי מועמד2 באונקולוגיה; כולל לוקמיה מיאלואידית חריפה3 (AML), מיאלודיספלסטית סינדרום (MDS)4, myelofibrosis (MF)5,6, תא קטן סרטן ריאות (sclc)7; ב מחלת התאים המגל (scd)8,9, ו ב מחלות מערכת העצבים המרכזית כולל מחלת אלצהיימר (AD), טרשת נפוצה (MS); ובתוקפנות10.
רוב התרכובות הKDM1A מעכבות בהתפתחות הקלינית הן נגזרות ציקלופרופילטין ומעכבים את החלבון באמצעות כריכה בעלת כריכת שינוי בעלת הפלאונטי (באופנה). עיכוב של KDM1A גורם ביטוי גנים שינויים, אבל שינויים אלה משתנים מאוד על פני רקמות, סוגי תאים, או מחלות מקרים. עיכוב של KDM1A גם משנה את הסימנים היסטון12, אך שינויים אלה מיוצרים בדרך כלל באופן מקומי באתר מסוים בגנום, והם שוב, רקמות מאוד תאים ספציפיים.
הפרוטוקול פותח כדי למדוד באופן ישיר התחייבות KDM1A היעד בדגימות ביולוגיות והוא ממוטב לשימוש עם מעכבי נגזרות ציקלוקילאמין. הגישה מבוססת על טכנולוגיית אליסה ומנתחת, במקביל, סה כ חופשי (כלומר לא מאוגד על ידי מעכב) KDM1A בתמצית חלבון יליד ממדגם ביולוגי בתוך שיטת שלב מוצק. כצעד הראשון, המדגם הביולוגי הוא להיות לאחר הנוכחות של KDM1A ביולוגית כימית סלקטיבית OG-88113,14, נגזר KDM1A מעכב סלקטיבי אורי-1001 (i, מעכב), חזק מעכבי של KDM1A במחקר קליני פיתוח לטיפול במחלות אונקולוגי. לKDM1A יש IC50 של 120 nM וכולל moiety כריכת אופנה מקושר פוליאתילן ביולוגי גליקול (יתד)-זנב. הגלימה מקושרת בלעדית לKDM1A החופשי, אבל לא לKDM1A המדכא במדגם. לאחר הכריכה כימית, KDM1A המכיל מתחמי במדגם נלכדים על צלחות microtiter עם משטח מצופה streptavidin כדי לקבוע KDM1A חינם, או על צלחות מצופה עם נוגדן לכידת מונושבטיים נגד KDM1A כדי לקבוע את סך KDM1A. לאחר שטיפת, שתי הצלחות הן מודקות עם נוגדן זיהוי anti-KDM1A, שטף שוב, ו-מודעם עם משני HRP מצוח חמור נגד ארנב IgG נוגדן לאיתור באמצעות מצע וכימות זורח על ידי מדידת יחסי יחידות אור (RLU) בלומטר (איור 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59390/59390fig1.jpg"> איור 1. הסכמה של אליסה האנזים מקושר כימית מערכת מערכת לKDM1A יעד התחייבות: A) ההגדרה של סה כ KDM1A באמצעות סנדוויץ ' אליסה ו B) קביעת הKDM1A בחינם באמצעות כימול אליסה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59390/59390fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
עקומה סטנדרטית כלולה בשתי צלחות ה-אליסה כדי לאמת את היניאריות של כל אחד מהסטנדרטים. הקביעה של התחייבות KDM1A יעד בכל מדגם מחושבת לאחר מכן כערך יחסי לדגם טרום-מינון או טיפול בכלי רכב.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0,05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 X Protease Inhibitor Tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>#11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep well storage block</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#734-1679</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well ELISA plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>#436110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive black Film</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>#6050173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive transparent Film</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#60941-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated KDM1A probe OG-881</td>
			<td>Oryzon Genomics S.A.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># 3117057001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#23208)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Protein Assay</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>#500-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lysis buffer 10X</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#9803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for 96- well plates</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>Rotina 420R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full length, enzymatically active human Recombinant LSD1 / KDM1A</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>#31426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 5 Project</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol-Enhacer and Peroxide Solution (Chemiluminescent Substrate)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#37074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader Infinite 200-Tecan</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Infinite 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal capture antibody Anti-KDM1A (N-terminal epitope)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>#ab53269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle G18 gauge blunt</td>
			<td>BD</td>
			<td>#303129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORY-1001 (iadademstat)</td>
			<td>Oryzon Genomics S.A.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBMC separation tubes 10 ml</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>#163288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBMC separation tubes 50 ml</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>#227288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate shaker</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td>Rotamax 120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal detection antibody Anti-KDM1A (C-terminal epitope)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#672184BF-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody Peroxidase-conjugated Donkey Anti-rabbit IgG</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#31458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer cuvette 1.5</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>#302100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer for cuvette</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GeneQuant 1300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>#Z704A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>#303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 1 ultrapure water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Milli-Q Advantage A10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner</td>
			<td>VWR</td>
			<td>USC200T</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct measurement of kdm1a target engagement using chemoprobe-based immunoassays

הערכה של מעורבות היעד, המוגדרת כאינטראקציה של תרופה עם החלבון שהוא תוכנן עבורו, היא דרישה בסיסית לפרשנות הפעילות הביולוגית של כל תרכובת בתחום הפיתוח של הסמים או בפרויקטי מחקר בסיסיים. ב אפיגנטיקה, היעד התחייבות מוערך לרוב על ידי ניתוח של סמנים proxy במקום מדידת האיחוד של המתחם ליעד. במורד הזרם הביולוגי שנותחו כוללים את אפנון סימן האבן או משתנה הביטוי הגנטי. KDM1A הוא ליזין דמטקלז המסיר קבוצות מתיל מH3K4 מונו ודימתיל, שינוי המשויך להשתקה הביטוי הגנטי. אפנון סמני ה-proxy תלויה בסוג התא ובפונקציה של האיפור הגנטי של התאים שנחקרו, אשר יכול להפוך פרשנות והשוואת מקרה הצלב די קשה. כדי לעקוף בעיות אלה, פרוטוקול רב-תכליתי מוצג כדי להעריך את השפעות המינון ואת הדינמיקה של התחייבות ישירה KDM1A היעד. התיקון תיאר עושה שימוש KDM1A chemoprobe כדי ללכוד ולכמת אנזים עצורים, ניתן להחיל באופן נרחב על תאים או דגימות רקמות ללא צורך שינוי גנטי, יש חלון מצוין של גילוי, והוא יכול לשמש הן עבור מחקר בסיסי וניתוח של דגימות קליניות.

יניאריות of סך הכל וההגדרה חינם KDM1A.
סדרות סטנדרטיות הוכנו כמתואר בשלב 5.3.2., באמצעות 0 עד 2500 pg של אנזים רקומביננטי KDM1A אנושי באורך מלא. ערכי ה-RLU של Total ו-rKDM1A Free העריכו לאמת את היניאריות (איור 2A ו- 2a). נתונים מיוצ...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Measurement of KDM1A Target Engagement Using Chemoprobe-based Immunoassays at JoVE.com

Direct Measurement of KDM1A Target Engagement Using Chemoprobe-based Immunoassays

מדידה ישירה של התחייבות KDM1A יעד באמצעות החיסונית מבוססי כימוציל

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי למדוד KDM1A מטרת האירוסין בתוך תא אנושי או בעלי חיים, רקמות או דגימות דם שטופלו עם KDM1A מעכבי. הפרוטוקול משתמש תיוג כימית של האנזים KDM1A חינם וקוונפיקציה ישירה של הכיבוש היעד באמצעות החיסונית מבוססי כימופי מבוסס והוא יכול לשמש במחקרים פרה-קליניים וקליניים.

The assessment of the target engagement, defined as the interaction of a drug with the protein it was designed for, is a basic requirement for the ...

הערכת מעורבות היעד, כלומר, האינטראקציה של תרופה עם החלבון שהיא תוכננה עבורו, היא דרישה בסיסית לפרשנות של הפעילות הביולוגית של כל תרכובת בפיתוח תרופות, או בפרויקטים מחקריים בסיסיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת מדידה ישירה של אפקט המינון והדינמיקה של מעורבות יעד KDM1A, ולא מדידות של אפקטים במורד הזרם כגון סימני אבן וביטוי. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת במחקר בסיסי וגם בניסויים קליניים, ב מערכת העצבים המרכזית אונקולוגית או מחלות אחרות הכפופות לטיפול במעכב KDM1A לחקר פרמקודינמיקה.טכניקה זו מבוססת על כימותרפיה שפותחה כדי ללמוד ORY-1001, iadademstat, אבל יכול לשמש באמת עבור מעכבי KDM1A אחרים ואת האסטרטגיה ניתן ליישם על מטרות אחרות. ההליך יוכח על ידי רקל רואיז, מנהלת תפעול של פלטפורמת גילוי PK /PD מהמעבדה שלי. במהלך טיפול בתא עם ORY-1001 המתחם נקשר לחלבון KDM1A נוכח בגרעין.כדי להתחיל בהליך זה, לאחזר 10 microliter לשימוש יחיד aliquot של 20 מילימולאר biotinylated בדיקה OG-881 פתרון מלאי מהמקרר ולתת לו להתחמם בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. באמצעות micropipet עם טיפים מסנן, באופן סדרתי לדלל את פתרון המלאי כדי להכין את פתרון העבודה שני micromolar. לאחר מכן, ממיסים טבליה אחת של מעכב פרוטאז במיליליטר אחד של PBS בצינור מיקרוצנטריפוגה.עבור כל מיליליטר של הנפח הרצוי של חיץ תות תא 1x עם הכימותרפיה, לערבב 100 microliters של חיץ תמוגה תאים 10x השיג, 150 microliters של מעכב פרוטאז 10x, 12.5 microliters של שתי פתרון עבודה OG-881 micromolar ו 737.5 microliters של מים מזוקקים כפולים מסוג 1. תאים lysed במאגר תזה 1x בנוכחות הכימותרפיה שנקשרת לכל חלבון KDM1A חינם. כדי להתכונן מרקמות, השתמש מרגמה ועלי כי הם מצוננים על קרח יבש כדי לרסק הומוגניזציה חתיכה אחת סנטימטר מעוקב של רקמה קפואה.Aliquot את הרקמה לתוך בקבוקונים חד פעמיים, הקפד להעביר כ 40 מיליגרם של אבקת רקמות לתוך כל בקבוקון, תוך הימנעות הפשרה בכל עת. לאחסן את הדגימות ב 80 מעלות צלזיוס עד מוכן לעיבוד. כדי להתכונן כדורי תא, להשתמש מחדש את גלולה של כ 10 מיליון תאים ב 200 microliters של מאגר תמוגה תא 1x המכיל 25 ננומולרי OG-881.מערבולת כל מדגם בקצרה ולשמור אותם על קרח במשך חמש דקות. באמצעות sonicator, sonicate הדגימות עם שלושה פולסים ב 45 קילוהרץ נמשך 20 שניות כל אחד. מניחים את הדגימות על קרח במשך 20 שניות בין פולסים.שמור את הדגימות על הקרח לחמש דקות נוספות. לאחר מכן, מערבולת לזמן קצר צנטריפוגה הדגימות ב 14, 000 פעמים G במשך 10 דקות בצנטריפוגה כי הוא מקורר מראש בארבע מעלות צלזיוס. באמצעות מיקרופיפט מיליליטר אחד להעביר כל על-טבעי לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר נפרד.השאירו את הצינורות על הקרח במשך שעתיים לפני העיבוד. לאחר מכן, לכמת את החלבון המקומי באמצעות ההסטה ברדפורד כמתואר בפרוטוקול הטקסט. צלחת כוללת מצופה בנוגדן נגד KDM1A.צלחת חינם מצופה סטרפטבידין. לאחר מכן, לייסט התא נוסף הן לצלחות והן למתחם KDM1A נלכד ישירות או דרך הכימותרפיה. צלחות נשטפות ומוגררות בנוגדן לגילוי נגד KDM1A ונוגדן משני יחד עם פרוקסידזה חזרת.לבסוף, מצע זוהר מתווסף ואות שנוצר. עבור סך הכל KDM1A ELISA, להכין 10 מיליליטר של KDM1A ללכוד נוגדן PBS לריכוז סופי של שני מיקרוגרם למיליליטר עבור כל צלחת. מעבירים 100 מיקרוליטרים לכל באר של הצלחת.לקבלת KDM1A ELISA בחינם, הכינו 10 מיליליטר סטרפטבידין ב-PBS כריכוז של 10 מיקרוגרם למיליליטר לכל צלחת. מעבירים 100 מיקרוליטרים לכל באר של הצלחת. לאחר מכן, אוטם עליון כל צלחת עם סרט דבק ודגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס.למחרת, להסיר את הצלחות מהמקרר ולתת להם לצייד בטמפרטורת החדר במשך כ 45 דקות. לשטוף כל צלחת שלוש פעמים עם חיץ לשטוף, הקפד להקיש על הצלחת על מגבות נייר לאחר כל שלב כביסה כדי להסיר כל פתרון שיורית. הוסף 200 microliters של חיץ חסימה לכל באר של שתי הצלחות.למעלה לאטום את הצלחות עם סרט דבק דגירה בטמפרטורת החדר במשך שעתיים. בינתיים, לדלל את תמציות חלבון מקורי שהושגו בעבר עם PBS לריכוז המתאים לפרוס את הצלחת כדי להכין עקומה סטנדרטית באמצעות rKDM1A אנושי כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר השלמת הדגירה בת השעתיים, השליכו את חיץ החסימה ושטפו את הצלחות עם חיץ שטיפה, ודאגו להקיש על הצלחת על מגבות נייר לאחר כל שלב כביסה כדי להסיר כל פתרון שיורית.העבר את הדגימות המדולללות המתאימות לבלוק אחסון באר עמוק 96 בקירור בעקבות התפלגות הלוח שנמצאה בטבלה 2 של פרוטוקול הטקסט. שמור בלוק זה על קרח תוך צינורות 100 microliters לתוך לוחות ELISA הכוללת וחופשית בעקבות התפלגות הלוח נמצא בטבלה שלוש של פרוטוקול הטקסט. דגירה בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת, ואז להשליך את הדגימות ולשטוף את הצלחות חמש פעמים עם חיץ לשטוף.הכן 20 מיליליטר של נוגדן גילוי ארנב נגד KDM1A בחסימת חיץ בריכוז של 0.125 מיקרוגרם למיליליטר. הוסף 100 מיקרוליטרים של פתרון נוגדן הגילוי לכל באר של שתי הצלחות, למעט אלה המתאימים לפקדים השליליים. למעלה לאטום את הצלחות עם סרט דבק דגירה בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת.לאחר מכן, להשליך את פתרון נוגדן זיהוי ולשטוף את הצלחות שש פעמים עם חיץ לשטוף. הכן 25 מיליליטר של נוגדן נגד ארנב עיזים משני, HRP, לדילול של אחד עד 5,000 במאגר חסימה. הוסיפו 100 מיקרוליטרים של ת פתרון הנוגדנים המשני לכל באר של צלחות המיקרוטיטר ודגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה.30 דקות לפני סוף הדגירה, מערבבים חלקים שווים של משפר לומינול ופתרון חמצן בבקבוק ענבר בתנאי אור רך. השאירו את התערובת בטמפרטורת החדר. כאשר הדגירה של שעה אחת הושלמה, להשליך את פתרון הנוגדנים המשני ולשטוף את הצלחות שש פעמים עם חיץ לשטוף.לאחר מכן, pipet 100 microliters של פתרון העבודה luminol לכל באר של הצלחות, הקפדה על צינור לאט מאוד, כדי למנוע היווצרות בועה. השתמש טיימר כדי לשלוט על הזמן בין תוספת של הפתרון ואת מדידת luminescence של הצלחות ולשמור על הזמן הזה קבוע כדי להשיג טוב בין assay לשכפל. למעלה לאטום את הצלחות עם סרט דבק צנטריפוגה ב 500 פעמים G ו בטמפרטורת החדר במשך 45 שניות כדי לחסל את כל הבועות הנותרות.הדגירה את הצלחות על שייקר צלחת ב 100 סל"ד במשך דקה אחת. לאחר מכן, להסיר את הסרט דבק ולהכניס את הצלחת לתוך קורא מיקרופלסטיק ולהשאיר אותו במשך שלוש דקות כדי לייצב את הטמפרטורה ב 25 מעלות צלזיוס. קרא את יחידות האלוהות היחסיות של כל מראית צלחת ELISA.שמור והעתק את ערכי RLU הגולמיים מקבצי הגיליון האלקטרוני הגולמיים של הנתונים לצורך ניתוח נוסף. במחקר זה, רומן KDM1A לכידת כימותרפיה מבוסס ELISA משמש למדידה ישירה KDM1A מעורבות היעד בתאים ודגימות רקמה. ערכי RLU של rKDM1A הכולל והחינם מוערכים כדי לאמת את ליניאריות.ערכי ה- RLU של KDM1A הכולל והחינם שזוהו במחשבים אישיים אנושיים משלושה מתנדבים עצמאיים מודבקים על העקומה הסטנדרטית. תאי AML מתורבתים בהתאם להמלצות הספק ומטופלים ברכב או ORY-1001 בריכוזים שונים. תמצית החלבון המקורית מתקבלת בנוכחות 25 מילימולרים OG-881 כימופרוב ו 0.5 מיקרוגרם של חלבון הכולל משמש לביצוע הניתוח של מעורבות היעד.סה"כ וחינם KDM1A נקבעים לאחר מכן ואת האחוזים של מעורבות היעד של ORY-1001 כדי KDM1A מחושב יחסית לרכב. מעורבות היעד KDM1A מגיב מינון ב PBMCs ובטיפול ריאות של חולדות עם ORY-1001 על ידי gavage אוראלי, מחושב יחסית קבוצת הרכב מוצג כאן. הדגירה לשעבר vivo עם 25 ננומולרים ORY-1001 של תמציות חלבון ריאות מן בעלי החיים שטופלו ברכב, מניבה TE מלא, עדיין, אבל לא להגדיל עוד יותר את TE בדגימות של חולדות שטופלו במשך ארבעה ימים עם 30 מיקרוגרם לקילוגרם ORY-1001, המאשר KDM1A כבר היה מעוכב באופן מלא vivo.פרוטוקול זה מעריך מעורבות יעד KDM1A על ידי מדידת KDM1A חופשי וסה"כ. זכור שזה דורש מיצוי חלבון מקומי. טכניקה זו יכולה לשמש על דגימות ממינים שונים כדי להעריך מעכב מסוים, גם כדי לסנן מעכבים חדשים.הכימותרפיה המשמשת במחקר זה יכולה להיות מיושמת גם עבור כימופרוטומיקה כדי ללמוד את האינטראקציה KDM1A. זכור לעבוד בבטחה ולכבד בכל עת אמצעי מניעה בעת טיפול דגימות ביולוגיות ותרכובות ביו-אקטיביות כמו מעכב KDM1A.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Covalent Binding of Antibodies to Cellulose Paper Discs and Their Applications in Naked-eye Colorimetric Immunoassays

קשר הקוולנטי של נוגדני דיסקי נייר תאיים ואת היישומים שלהם ב Immunoassays מדד-צבע Naked-עין

This report presents two methods for the covalent immobilization of capture antibodies on cellulose filter paper grade No. 1 (medium-flow filter paper) ...

Measurement of Basal and Forskolin-stimulated Lipolysis in Inguinal Adipose Fat Pads

מדידה של ליפוליזה מגורה של Basal ו- Forskolin במרפאות שומן אדיפוז

Lipolysis is a process by which the lipid stored as triglycerides in adipose tissues are hydrolyzed into glycerol and fatty acids. This article describes ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

ניצול מערכת העשרה Immunoprecipitation מקיף כדי לזהות פרופיל אנדוגני שינוי Post-translational של חלבונים היעד

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Simultaneous Measurement of Superoxide/Hydrogen Peroxide and NADH Production by Flavin-containing Mitochondrial Dehydrogenases

מדידה סימולטני של סופראוקסיד/מימן על-חמצני ו- NADH הייצור על ידי המכילות פלווין Dehydrogenases מיטוכונדריאלי

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include ...

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

מדידה של צריכת חמצן מיטוכונדריאלי של סיבי Permeabilized דרוזופילה באמצעות כמויות מינימליות של רקמות

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

A Direct Force Probe for Measuring Mechanical Integration Between the Nucleus and the Cytoskeleton

בדיקה ישירה כוח למדידת מכני אינטגרציה בין הגרעין של שלד התא

The mechanical properties of the nucleus determine its response to mechanical forces generated in cells. Because the nucleus is molecularly continuous ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

באמצעות תוכן גבוהה הדמיה לכמת התחייבות היעד תאים חסיד

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

רגישות גבוהה מדידה של שעתוק הזיקות איגוד מקדם-DNA על ידי טיטור תחרותי באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Cortisol Measurement in Koala (Phascolarctos cinereus) Fur

Cortisol Measurement in Koala Phascolarctos cinereus Fur

הקורטיזול מדידה קואלה (פאיסקולארקטוס cinereus) פרווה

Optimal methods of hormone extraction used to measure stress in animals across sample types are not always the same. Australia&#39;s iconic marsupial ...

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability DARTS assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

יחסי למחצה כמותית של התרופה מגיב יציבות היעד (חצים) שיטת לימוד האינטראקציה Rapamycin/mTOR

Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) is a robust method for detection of novel small molecule protein targets. It can be used to verify known ...