Name: direct measurement of kdm1a target engagement using chemoprobe-based immunoassays
Uploaded: 2019-06-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Measurement of KDM1A Target Engagement Using Chemoprobe-based Immunoassays at JoVE.com

Questo studio è stato finanziato da Oryzon Genomics. S.A., Hoffman-La Roche e parzialmente supportati dal programma di collaborazione CIIP-20152001 e RETOS RTC-2015-3332-1.

I campioni di sangue sono stati ottenuti dall'Instituto de Investigaciàn Biomédica Sant Pau Biobank secondo la legislazione spagnola (Real Decreto de Biobancos 1716/2011) e l'approvazione dei comitati etici locali. Gli studi con tessuti animali sono stati effettuati in conformità con gli orientamenti istituzionali per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (direttiva del Consiglio delle Comunità europee 86/609/CEE) istituito dal Comitato etico per la sperimentazione animale PRAAL-PCB.
<p class="jov...

<ol>
	<li>Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+demethylation+mediated+by+the+nuclear+amine+oxidase+homolog+LSD1.">Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1.</a> Cell. 119 (7), 941-953 (2004).</li><li>Maiques-Diaz, A., Somervaille, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LSD1:+biologic+roles+and+therapeutic+targeting.">LSD1: biologic roles and therapeutic targeting.</a> Epigenomics. 8 (8), 1103-1116 (2016).</li><li>Maes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORY-1001,+a+Potent+and+Selective+Covalent+KDM1A+Inhibitor,+for+the+Treatment+of+Acute+Leukemia.">ORY-1001, a Potent and Selective Covalent KDM1A Inhibitor, for the Treatment of Acute Leukemia.</a> Cancer Cell. 33 (3), 495-511 (2018).</li><li>Sugino, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+LSD1+inhibitor+NCD38+ameliorates+MDS-related+leukemia+with+complex+karyotype+by+attenuating+leukemia+programs+via+activating+super-enhancers.">A novel LSD1 inhibitor NCD38 ameliorates MDS-related leukemia with complex karyotype by attenuating leukemia programs via activating super-enhancers.</a> Leukemia. 31 (11), 2303-2314 (2017).</li><li>Kleppe, M., Shank, K., Efthymia, P., Riehnhoff, H., Levine, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysine-Specific+Histone+Demethylase,+LSD1,+(KDM1A)+As+a+Novel+Therapeutic+Target+in+Myeloproliferative+Neoplasms.">Lysine-Specific Histone Demethylase, LSD1, (KDM1A) As a Novel Therapeutic Target in Myeloproliferative Neoplasms.</a> Blood. 126, 601 (2015).</li><li>Jutzi, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LSD1+Inhibition+Prolongs+Survival+in+Mouse+Models+of+MPN+by+Selectively+Targeting+the+Disease+Clone.">LSD1 Inhibition Prolongs Survival in Mouse Models of MPN by Selectively Targeting the Disease Clone.</a> HemaSphere. 2 (3), 54 (2018).</li><li>Mohammad, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Hypomethylation+Signature+Predicts+Antitumor+Activity+of+LSD1+Inhibitors+in+SCLC.">DNA Hypomethylation Signature Predicts Antitumor Activity of LSD1 Inhibitors in SCLC.</a> Cancer Cell. 28 (1), 57-69 (2015).</li><li>Rivers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RN-1,+a+potent+and+selective+lysine-specific+demethylase+1+inhibitor,+increases+&#947;-globin+expression,+F+reticulocytes,+and+F+cells+in+a+sickle+cell+disease+mouse+model.">RN-1, a potent and selective lysine-specific demethylase 1 inhibitor, increases &#947;-globin expression, F reticulocytes, and F cells in a sickle cell disease mouse model.</a> Experimental Hematology. 43 (7), 546-553 (2015).</li><li>Rivers, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+administration+of+the+LSD1+inhibitor+ORY-3001+increases+fetal+hemoglobin+in+sickle+cell+mice+and+baboons.">Oral administration of the LSD1 inhibitor ORY-3001 increases fetal hemoglobin in sickle cell mice and baboons.</a> Experimental Hematology. 67, 60-64 (2018).</li><li>Buesa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dual+LSD1/MAO-B+inhibitor+ORY-2001+prevents+the+development+of+the+memory+deficit+in+samp8+mice+through+induction+of+neuronal+plasticity+and+reduction+of+neuroinflammation.">The dual LSD1/MAO-B inhibitor ORY-2001 prevents the development of the memory deficit in samp8 mice through induction of neuronal plasticity and reduction of neuroinflammation.</a> Alzheimer&#8217;s &amp; Dementia. 11 (7), P905 (2015).</li><li>Schmidt, D. M., McCafferty, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-2-Phenylcyclopropylamine+is+a+mechanism-based+inactivator+of+the+histone+demethylase+LSD1.">Trans-2-Phenylcyclopropylamine is a mechanism-based inactivator of the histone demethylase LSD1.</a> Biochemistry. 46 (14), 4408-4416 (2007).</li><li>Forneris, F., Binda, C., Vanoni, M. A., Battaglioli, E., Mattevi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+histone+demethylase+LSD1+reads+the+histone+code.">Human histone demethylase LSD1 reads the histone code.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41360-41365 (2005).</li><li>Gonz#225;lez, E. C., Maes, T., Crusat, C. M., Mu#241;oz, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oryzon+Genomics,+Methods+to+determine+kdm1a+target+engagement+and+chemoprobes+useful+therefor.">Oryzon Genomics, Methods to determine kdm1a target engagement and chemoprobes useful therefor.</a> , (2016).</li><li>Mascaró, C., Ortega, A., Carceller, E., Rruiz Rodriguez, R., Cicero, F., Lunardi, S., Yu, L., Hilbert, M., Maes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoprobe-based+assays+of+histone+lysine+demethylase+1A+target+occupation+enable+in+vivo+pharmacokinetics+and+-dynamics+studies+of+KDM1A+inhibitors.">Chemoprobe-based assays of histone lysine demethylase 1A target occupation enable in vivo pharmacokinetics and -dynamics studies of KDM1A inhibitors.</a> Journal of Biological Chemistry. , (2019).</li><li>Rodriguez-Suarez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Homogeneous+Nonradioactive+Methyltransferase+and+Demethylase+Assays+Targeting+Histone+H3+Lysine+4.">Development of Homogeneous Nonradioactive Methyltransferase and Demethylase Assays Targeting Histone H3 Lysine 4.</a> Journal of Biomolecular Screening. 17 (1), 49-58 (2011).</li><li>Lynch, J. T., Cockerill, M. J., Hitchin, J. R., Wiseman, D. H., Somervaille, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD86+expression+as+a+surrogate+cellular+biomarker+for+pharmacological+inhibition+of+the+histone+demethylase+lysine-specific+demethylase+1.">CD86 expression as a surrogate cellular biomarker for pharmacological inhibition of the histone demethylase lysine-specific demethylase 1.</a> Analytical Biochemistry. 442 (1), 104-106 (2013).</li><li>Schulz-Fincke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-activity+studies+on+N-Substituted+tranylcypromine+derivatives+lead+to+selective+inhibitors+of+lysine+specific+demethylase+1+(LSD1)+and+potent+inducers+of+leukemic+cell+differentiation.">Structure-activity studies on N-Substituted tranylcypromine derivatives lead to selective inhibitors of lysine specific demethylase 1 (LSD1) and potent inducers of leukemic cell differentiation.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 144, 52-67 (2018).</li><li>Ishii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CETSA+quantitatively+verifies+in+vivo+target+engagement+of+novel+RIPK1+inhibitors+in+various+biospecimens.">CETSA quantitatively verifies in vivo target engagement of novel RIPK1 inhibitors in various biospecimens.</a> Scientific Report. 7, 13000 (2017).</li><li>Maes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORY-2001:+An+Epigenetic+drug+for+the+treatment+of+cognition+defects+in+Alzheimer&#8217;s+disease+and+other+neurodegenerative+disorders.">ORY-2001: An Epigenetic drug for the treatment of cognition defects in Alzheimer&#8217;s disease and other neurodegenerative disorders.</a> Alzheimer&#8217;s &amp; Dementia. 12 (7), P1192 (2017).</li></ol>

Il protocollo qui presentato è stato sviluppato per misurare direttamente il coinvolgimento del target KDM1A utilizzando una nuova chemoprobe KDM1A che coglie la base ELISA. Il metodo è stato convalidato su linee cellulari umane coltivate e campioni di ex vivo da esseri umani, ratti e topi e babbuini (compresi PMC, polmone, cervello, pelle, tumori), ma può essere facilmente applicato ad altre specie in cui l'anticorpo KDM1A bersaglio epitopi e cataliti centro sono conservati. Poiché OG-881 è una chemioprobe basata s...

La lisina demetilasi specifica 1 (KDM1A)1 è un demetilare coinvolto nel controllo della trascrizione genica. Questa proteina è emersa come bersaglio farmacologico candidato2 in oncologia; tra cui acuta mieloide Leucemia3 (AML), Sindrome da Mielodisplasia (MDS)4, Mielofibrosi (MF)5,6, Cancro polmonare a piccole cellule (SCLC)7; nella malattia delle cellule falciformi (SCD)8,9, e nelle malattie del sistema nervoso centrale tra cui il morbo di Alzheimer (AD), la sclerosi multipla (MS); e nell'aggressione10.
La maggior parte dei composti inibitori di KDM1A nello sviluppo clinico sono derivati della ciclopropilaree e inibiscono la proteina legandosi covalente al suo cofattore dinucleotide di flavin adenina (FAD)11. L'inibizione di KDM1A induce cambiamenti nell'espressione genica, ma questi cambiamenti variano enormemente tra i tessuti, i tipi di cellule o i casi di malattia. L'inibizione di KDM1A cambia anche i segni itoni12, ma questi cambiamenti sono generalmente prodotti localmente in un sito specifico del genoma, e sono ancora una volta, altamente tessuto e cellule specifiche.
Il protocollo è stato sviluppato per misurare direttamente l'impegno del target KDM1A in campioni biologici ed è stato ottimizzato per l'uso con inibitori derivati dalla ciclopropile. Il saggio si basa sulla tecnologia ELISA e analizza, in parallelo, Total e Free (cioè non legato dall'inibitore) KDM1A in un estratto di proteina autoctona da un campione biologico in un saggio in fase solida. Come primo passo, il campione biologico viene lizzato in presenza della chemoprobe selettiva KDM1A biomutlata OG-88113,14, derivata dall'inibitore selettivo di KDM1A ORY-1001 (iadademstat), un potente inibitore di KDM1A in sviluppo per il trattamento della malattia oncologica. La chemiosche ha un IC50 per KDM1A di 120 nM e comprende una moiety legante FAD collegata a una coda di glicole di polietilene biotinyato (PEG). La chemiosa si lega esclusivamente al KDM1A gratuito, ma non al KDM1A inibitore nel campione. Dopo la rilegatura della chemiosa, il KDM1A contenente complessi nel campione vengono catturati su piastre di microtitro con superficie rivestita di streptavidin per determinare kDM1A libero, o su piastre rivestite con un anticorpo di cattura anti-KDM1A monoclonale per determinare il totale KDM1A. Dopo il lavaggio, entrambe le piastre vengono incubate con un anticorpo anti-rilevamento anti-KDM1A, lavate di nuovo e incubate con un anticorpo igG con asino concatenato HRP secondario per la rilevazione utilizzando un substrato luminescente e la quantificazione misurando unità di luce (RLU) in un luminometro (Figura 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59390/59390fig1.jpg"> come illustrato nella Figura 1. Schema di ELISA Enzima collegato chemioprobeata saggio immunoassorante per KDM1A target engagement: A) Determinazione del totale KDM1A utilizzando sandwich ELISA e B) Determinazione di KDM1A gratuito utilizzando chemioprobe ELISA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59390/59390fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
In entrambe le piastre ELISA è inclusa una curva standard per verificare la linearità di ogni analisi. La determinazione dell'impegno target KDM1A in ogni campione viene quindi calcolata come valore relativo al campione pre-dose o al veicolo trattato.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0,05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 X Protease Inhibitor Tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>#11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep well storage block</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#734-1679</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well ELISA plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>#436110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive black Film</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>#6050173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive transparent Film</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#60941-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated KDM1A probe OG-881</td>
			<td>Oryzon Genomics S.A.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># 3117057001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#23208)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Protein Assay</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>#500-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lysis buffer 10X</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#9803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for 96- well plates</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>Rotina 420R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full length, enzymatically active human Recombinant LSD1 / KDM1A</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>#31426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 5 Project</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol-Enhacer and Peroxide Solution (Chemiluminescent Substrate)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#37074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader Infinite 200-Tecan</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Infinite 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal capture antibody Anti-KDM1A (N-terminal epitope)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>#ab53269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle G18 gauge blunt</td>
			<td>BD</td>
			<td>#303129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORY-1001 (iadademstat)</td>
			<td>Oryzon Genomics S.A.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBMC separation tubes 10 ml</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>#163288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBMC separation tubes 50 ml</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>#227288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate shaker</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td>Rotamax 120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal detection antibody Anti-KDM1A (C-terminal epitope)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#672184BF-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody Peroxidase-conjugated Donkey Anti-rabbit IgG</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#31458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer cuvette 1.5</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>#302100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer for cuvette</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GeneQuant 1300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>#Z704A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>#303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 1 ultrapure water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Milli-Q Advantage A10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner</td>
			<td>VWR</td>
			<td>USC200T</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct measurement of kdm1a target engagement using chemoprobe-based immunoassays

La valutazione dell'impegno target, definita come l'interazione di un farmaco con la proteina per cui è stato progettato, è un requisito fondamentale per l'interpretazione dell'attività biologica di qualsiasi composto nello sviluppo di farmaci o nei progetti di ricerca di base. Nell'epigenetica, l'impegno target è più spesso valutato mediante l'analisi dei marcatori proxy invece di misurare l'unione del composto al bersaglio. Le letture biologiche a valle che sono state analizzate includono la modulazione del marchio dell'istorio o i cambiamenti dell'espressione genica. KDM1A è una lisila demetila si riparte da H3K4 mono e dimetilata, una modifica associata al silenziamento dell'espressione genica. La modulazione dei marcatori proxy dipende dal tipo di cellula e dalla funzione della composizione genetica delle cellule studiate, il che può rendere piuttosto difficile l'interpretazione e il confronto tra maiuscole e minuscole. Per aggirare questi problemi, viene presentato un protocollo versatile per valutare gli effetti della dose e la dinamica del coinvolgimento diretto del target KDM1A. L'analisi descritta fa uso di una chemoprobe KDM1A per catturare e quantificare l'enzima disinibito, può essere ampiamente applicato a cellule o campioni di tessuto senza necessità di modificazione genetica, ha un'eccellente finestra di rilevamento e può essere utilizzato sia per la ricerca di base e l'analisi di campioni clinici.

La linearità della determinazione Total e Free KDM1A.
Una serie Standard è stata preparata come descritto nel passaggio 5.3.2., utilizzando da 0 a 2500 pg dell'enzima KDM1A ricombinante umano a lunghezza intera. I valori RLU di Total e Free rKDM1A sono stati valutati per verificare la linearità (Figura 2A e 2B). I dati sono rappresentati come media da 3 esperimen...

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Direct Measurement of KDM1A Target Engagement Using Chemoprobe-based Immunoassays

Misurazione diretta del coinvolgimento target KDM1A utilizzando Immunoassays basate su Chemoprobe

Qui, presentiamo un protocollo per misurare kDM1A target engagement in una cellula umana o animale, tessuto o campioni di sangue trattati con inibitori KDM1A. Il protocollo utilizza l'etichettatura chemioprobe dell'enzima KDM1A gratuito e la quantificazione diretta dell'occupazione target utilizzando immunoasisti basati sulla chemiospa e può essere utilizzato in studi preclinici e clinici.

The assessment of the target engagement, defined as the interaction of a drug with the protein it was designed for, is a basic requirement for the ...

La valutazione dell'impegno target, cioè l'interazione di un farmaco con la proteina per cui è stato progettato, è un requisito di base per l'interpretazione dell'attività biologica di qualsiasi composto nello sviluppo di farmaci o in progetti di ricerca di base. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente la misurazione diretta dell'effetto di dose e della dinamica dell'innesto bersaglio di KDM1A, piuttosto che misurazioni di effetti a valle come segni istoni ed espressione. Questa tecnica può essere applicata nella ricerca di base e anche negli studi clinici, nel SNC oncologico o in altre malattie soggette a trattamento con inibitore KDM1A per studiare farmacodinamica.Questa tecnica si basa su una chemioprobe sviluppata per studiare ORY-1001, iadademstat, ma può essere realmente utilizzata per altri inibitori del KDM1A e la strategia può essere applicata ad altri obiettivi. La procedura sarà dimostrata da Raquel Ruiz, responsabile operativo della piattaforma di scoperta PK/PD del mio laboratorio. Durante il trattamento cellulare con ORY-1001 il composto si lega alla proteina KDM1A presente nel nucleo.Per iniziare questa procedura, recuperare un'aliquota singola da 10 microlitri di soluzione di magazzino OG-881 a sonda biotilata millimolare dal frigorifero e lasciarla riscaldare a temperatura ambiente per 10 minuti. Utilizzando un micropipeto con punte filtranti, diluire in serie la soluzione stock per preparare la soluzione di lavoro a due micromolari. Quindi, sciogliere una compressa di inibitore della proteasi in un millilitro di PBS in un tubo di microcentrifugo.Per ogni millilitro del volume desiderato di tampone di lysis cellulare 1x con la chemioprobe, mescolare 100 microlitri di tampone di lysi cellulare ottenuto commercialmente, 150 microlitri dell'inibitore della proteasi 10x, 12,5 microlitri della soluzione di lavoro micromolare OG-881 e 737,5 microlitri di acqua distillata doppia di tipo 1. Le cellule vengono liscive in tampone di lisi 1x in presenza della chemioprobe che si lega a qualsiasi proteina KDM1A libera. Per prepararsi dai tessuti, utilizzare un mortaio e un pestello che vengono refrigerati sul ghiaccio secco per polverizzare e omogeneizzare un pezzo di tessuto congelato di un centimetro cubo.Aliquotare il tessuto in fiale mono-uso, assicurandosi di trasferire circa 40 milligrammi di polvere di tessuto in ogni flaconcino, evitando allo stesso tempo lo scongelamento. Conservare i campioni a 80 gradi Celsius fino a quando non sono pronti per l'applicazione. Per prepararsi da pellet cellulari, rimescolare il pellet di circa 10 milioni di cellule in 200 microlitri di tampone di lisi cellulare 1x contenente 25 OG-881 nanomolare.Vortice ogni campione brevemente e tenerli sul ghiaccio per cinque minuti. Utilizzando un sonicatore, sonicare i campioni con tre impulsi a 45 kilohertz della durata di 20 secondi ciascuno. Posizionare i campioni sul ghiaccio per 20 secondi tra gli impulsi.Tenere i campioni sul ghiaccio per altri cinque minuti. Quindi, vortice brevemente e centrifugare i campioni a 14.000 volte G per 10 minuti in una centrifuga che viene pre-refrigerata a quattro gradi Celsius. L'uso di un micropipetto millilitro trasferisce ogni supernatante in un tubo di microcentrifugo separato da 1,5 millilitri.Lasciare i tubi sul ghiaccio per due ore prima della lavorazione. Quindi, quantificare la proteina nativa usando il saggio di Bradford come delineato nel protocollo di testo. Una piastra totale è rivestita con anticorpo anti-KDM1A.La piastra libera è rivestita con streptavidina. Il lisato cellulare viene quindi aggiunto a entrambe le piastre e il complesso KDM1A viene catturato direttamente o attraverso la chemioprobe. Le piastre vengono lavate e incubate con l'anticorpo di rilevamento anti-KDM1A e un anticorpo secondario accoppiato alla perossidasi rafano.Infine, viene aggiunto un substrato luminescente e generato segnale. Per il KDM1A ELISA totale, preparare 10 millilitri di anticorpo di cattura KDM1A in PBS a una concentrazione finale di due microgrammi per millilitro per ogni piastra. Trasferire 100 microlitri in ogni pozzo della piastra.Per KDM1A ELISA gratuito, preparare 10 millilitri di streptavidina in PBS come concentrazione di 10 microgrammi per millilitro per ogni piastra. Trasferire 100 microlitri in ogni pozzo della piastra. Quindi, sigillare in alto ogni piastra con pellicola adesiva e incubare durante la notte a quattro gradi Celsius.Il giorno successivo, rimuovere i piatti dal frigorifero e lasciarli equilibrare a temperatura ambiente per circa 45 minuti. Lavare ogni piastra tre volte con tampone di lavaggio, assicurandosi di toccare la piastra sugli asciugamani di carta dopo ogni fase di lavaggio per rimuovere qualsiasi soluzione residua. Aggiungere 200 microlitri di tampone di blocco ad ogni pozzo di entrambe le piastre.Sigillare in alto le piastre con pellicola adesiva e incubare a temperatura ambiente per due ore. Nel frattempo, diluire gli estratti proteici nativi precedentemente ottenuti con PBS alla concentrazione appropriata e disporre la piastra per preparare una curva standard utilizzando rKDM1A umano come delineato nel protocollo di testo. Al termine dell'incubazione di due ore, scartare il tampone di blocco e lavare le piastre con tampone di lavaggio, assicurandosi di toccare la piastra sugli asciugamani di carta dopo ogni fase di lavaggio per rimuovere qualsiasi soluzione residua.Trasferire i campioni diluiti appropriati in un blocco refrigerato di stoccaggio di pozzi profondi 96 in seguito alla distribuzione delle lastre trovata nella tabella due del protocollo di testo. Mantenere questo blocco sul ghiaccio mentre si pipettano 100 microlitri per pozzo nelle piastre ELISA totali e libere seguendo la distribuzione delle lastre trovata nella tabella tre del protocollo di testo. Incubare a temperatura ambiente per un'ora, quindi scartare i campioni e lavare le piastre cinque volte con tampone di lavaggio.Preparare 20 millilitri di anticorpo di rilevamento anti-KDM1A del coniglio nel tampone di blocco a una concentrazione di 0,125 microgrammi per millilitro. Aggiungere 100 microlitri della soluzione anticorpale di rivelazione a ciascun pozzo di entrambe le piastre, ad eccezione di quelli corrispondenti ai controlli negativi. Sigillare in alto le piastre con pellicola adesiva e incubare a temperatura ambiente per un'ora.Successivamente, scartare la soluzione anticorpale di rilevamento e lavare le piastre sei volte con tampone di lavaggio. Preparare 25 millilitri di anticorpo anti-coniglio di capra secondario, HRP, con una diluizione da uno a 5.000 nel tampone di blocco. Aggiungere 100 microlitri della soluzione anticorpale secondaria ad ogni pozzo delle piastre del microtitolo e incubare a temperatura ambiente per un'ora.30 minuti prima della fine di questa incubazione, mescolare parti uguali di esaltatore di luminol e soluzione di perossido in una bottiglia ambrata in condizioni di luce soffaccia. Lasciare questa miscela a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione di un'ora, scartare la soluzione anticorpale secondaria e lavare le piastre sei volte con tampone di lavaggio.Successivamente, pipettare 100 microlitri della soluzione di lavoro del luminol ad ogni pozzo delle piastre, assicurandosi di pipet molto lentamente per evitare la formazione di bolle. Utilizzare un timer per controllare il tempo tra l'aggiunta della soluzione e la misurazione della luminescenza delle piastre e mantenere questo tempo costante per ottenere una buona riproducibilità tra i test. Sigillare in alto le piastre con pellicola adesiva e centrifuga a 500 volte G e a temperatura ambiente per 45 secondi per eliminare eventuali bolle rimanenti.Incubare le piastre su uno shaker a 100 giri/min per un minuto. Quindi, rimuovere la pellicola adesiva e inserire la piastra in un lettore di micropiastrine e lasciarla per tre minuti per stabilizzare la temperatura a 25 gradi Celsius. Leggere le relative unità di luminescenza di ogni saggio di piastra ELISA.Salvare e copiare i valori RLU non elaborati dai file del foglio di calcolo dei dati non elaborati per ulteriori analisi. In questo studio, un nuovo ELISA basato sulla cattura di chemioprobe KDM1A viene utilizzato per misurare direttamente l'impegno target KDM1A in cellule e campioni di tessuto. I valori RLU di rKDM1A totali e liberi vengono valutati per verificare la linearità.I valori RLU del KDM1A totale e libero rilevati nei PBPC umani da tre volontari indipendenti vengono quindi sovrapposti alla curva standard. Le celle AML sono coltivate seguendo le raccomandazioni del fornitore e vengono trattate con veicoli o ORY-1001 a diverse concentrazioni. L'estratto proteico nativo è ottenuto in presenza di chemioprobe OG-881 millimolare e 0,5 microgrammi di proteina totale viene utilizzato per eseguire l'analisi del coinvolgimento target.Vengono quindi determinati KDM1A totali e gratuiti e vengono calcolate le percentuali di coinvolgimento target da ORY-1001 a KDM1A rispetto al veicolo. L'impegno target KDM1A dose-responsive nei PBBC e nel trattamento polmonare dei ratti con ORY-1001 per gavage orale, calcolato rispetto al gruppo di veicoli è mostrato qui. L'incubazione ex vivo con 25 nanomolare ORY-1001 di estratti di proteine polmonari dagli animali trattati con il veicolo, produce TE completo, ma non aumenta ulteriormente te nei campioni di ratti trattati per quattro giorni con 30 microgrammi per chilogrammo ORY-1001, confermando che KDM1A era già completamente inibito in vivo.Questo protocollo valuta l'impegno target KDM1A misurando kdm1a gratuito e totale. Ricorda che richiede l'estrazione di proteine native. Questa tecnica può essere utilizzata su campioni di diverse specie per valutare uno specifico inibitore, anche per migliorare la ricerca di nuovi inibitori.La chemioprobe utilizzata in questo studio può anche essere applicata per la chemioproteomica per studiare l'interactum KDM1A. Ricorda di lavorare in sicurezza e rispettare in ogni momento le misure preventive quando si maneggiano campioni biologici e composti bioattivi come l'inibitore di KDM1A.

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