Name: direct measurement of kdm1a target engagement using chemoprobe-based immunoassays
Uploaded: 2019-06-13T13:00:00
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本研究はオリゾンゲノミクスが出資した。S.A.、ホフマン・ラ・ロシュ、CIIP-20152001およびRETOSコラボレーションプログラムRTC-2015-3332-1によって部分的にサポートされています。

血液サンプルは、スペインの法律(レアル・デクレト・デ・バイオバンコス1716/2011)と地元の倫理委員会の承認に従って、インスティトゥート・デ・インスティトゥート・デ・ディオメディカ・サン・パウ・バイオバンクから入手されました。動物組織を用いた研究は、動物実験倫理委員会が設置した実験動物のケアと使用に関する制度ガイドライン(欧州共同体協議会指令86/609/EEC)に従?...

<ol>
	<li>Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+demethylation+mediated+by+the+nuclear+amine+oxidase+homolog+LSD1.">Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1.</a> Cell. 119 (7), 941-953 (2004).</li><li>Maiques-Diaz, A., Somervaille, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LSD1:+biologic+roles+and+therapeutic+targeting.">LSD1: biologic roles and therapeutic targeting.</a> Epigenomics. 8 (8), 1103-1116 (2016).</li><li>Maes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORY-1001,+a+Potent+and+Selective+Covalent+KDM1A+Inhibitor,+for+the+Treatment+of+Acute+Leukemia.">ORY-1001, a Potent and Selective Covalent KDM1A Inhibitor, for the Treatment of Acute Leukemia.</a> Cancer Cell. 33 (3), 495-511 (2018).</li><li>Sugino, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+LSD1+inhibitor+NCD38+ameliorates+MDS-related+leukemia+with+complex+karyotype+by+attenuating+leukemia+programs+via+activating+super-enhancers.">A novel LSD1 inhibitor NCD38 ameliorates MDS-related leukemia with complex karyotype by attenuating leukemia programs via activating super-enhancers.</a> Leukemia. 31 (11), 2303-2314 (2017).</li><li>Kleppe, M., Shank, K., Efthymia, P., Riehnhoff, H., Levine, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysine-Specific+Histone+Demethylase,+LSD1,+(KDM1A)+As+a+Novel+Therapeutic+Target+in+Myeloproliferative+Neoplasms.">Lysine-Specific Histone Demethylase, LSD1, (KDM1A) As a Novel Therapeutic Target in Myeloproliferative Neoplasms.</a> Blood. 126, 601 (2015).</li><li>Jutzi, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LSD1+Inhibition+Prolongs+Survival+in+Mouse+Models+of+MPN+by+Selectively+Targeting+the+Disease+Clone.">LSD1 Inhibition Prolongs Survival in Mouse Models of MPN by Selectively Targeting the Disease Clone.</a> HemaSphere. 2 (3), 54 (2018).</li><li>Mohammad, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Hypomethylation+Signature+Predicts+Antitumor+Activity+of+LSD1+Inhibitors+in+SCLC.">DNA Hypomethylation Signature Predicts Antitumor Activity of LSD1 Inhibitors in SCLC.</a> Cancer Cell. 28 (1), 57-69 (2015).</li><li>Rivers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RN-1,+a+potent+and+selective+lysine-specific+demethylase+1+inhibitor,+increases+&#947;-globin+expression,+F+reticulocytes,+and+F+cells+in+a+sickle+cell+disease+mouse+model.">RN-1, a potent and selective lysine-specific demethylase 1 inhibitor, increases &#947;-globin expression, F reticulocytes, and F cells in a sickle cell disease mouse model.</a> Experimental Hematology. 43 (7), 546-553 (2015).</li><li>Rivers, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+administration+of+the+LSD1+inhibitor+ORY-3001+increases+fetal+hemoglobin+in+sickle+cell+mice+and+baboons.">Oral administration of the LSD1 inhibitor ORY-3001 increases fetal hemoglobin in sickle cell mice and baboons.</a> Experimental Hematology. 67, 60-64 (2018).</li><li>Buesa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dual+LSD1/MAO-B+inhibitor+ORY-2001+prevents+the+development+of+the+memory+deficit+in+samp8+mice+through+induction+of+neuronal+plasticity+and+reduction+of+neuroinflammation.">The dual LSD1/MAO-B inhibitor ORY-2001 prevents the development of the memory deficit in samp8 mice through induction of neuronal plasticity and reduction of neuroinflammation.</a> Alzheimer&#8217;s &amp; Dementia. 11 (7), P905 (2015).</li><li>Schmidt, D. M., McCafferty, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-2-Phenylcyclopropylamine+is+a+mechanism-based+inactivator+of+the+histone+demethylase+LSD1.">Trans-2-Phenylcyclopropylamine is a mechanism-based inactivator of the histone demethylase LSD1.</a> Biochemistry. 46 (14), 4408-4416 (2007).</li><li>Forneris, F., Binda, C., Vanoni, M. A., Battaglioli, E., Mattevi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+histone+demethylase+LSD1+reads+the+histone+code.">Human histone demethylase LSD1 reads the histone code.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41360-41365 (2005).</li><li>Gonz#225;lez, E. C., Maes, T., Crusat, C. M., Mu#241;oz, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oryzon+Genomics,+Methods+to+determine+kdm1a+target+engagement+and+chemoprobes+useful+therefor.">Oryzon Genomics, Methods to determine kdm1a target engagement and chemoprobes useful therefor.</a> , (2016).</li><li>Mascaró, C., Ortega, A., Carceller, E., Rruiz Rodriguez, R., Cicero, F., Lunardi, S., Yu, L., Hilbert, M., Maes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoprobe-based+assays+of+histone+lysine+demethylase+1A+target+occupation+enable+in+vivo+pharmacokinetics+and+-dynamics+studies+of+KDM1A+inhibitors.">Chemoprobe-based assays of histone lysine demethylase 1A target occupation enable in vivo pharmacokinetics and -dynamics studies of KDM1A inhibitors.</a> Journal of Biological Chemistry. , (2019).</li><li>Rodriguez-Suarez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Homogeneous+Nonradioactive+Methyltransferase+and+Demethylase+Assays+Targeting+Histone+H3+Lysine+4.">Development of Homogeneous Nonradioactive Methyltransferase and Demethylase Assays Targeting Histone H3 Lysine 4.</a> Journal of Biomolecular Screening. 17 (1), 49-58 (2011).</li><li>Lynch, J. T., Cockerill, M. J., Hitchin, J. R., Wiseman, D. H., Somervaille, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD86+expression+as+a+surrogate+cellular+biomarker+for+pharmacological+inhibition+of+the+histone+demethylase+lysine-specific+demethylase+1.">CD86 expression as a surrogate cellular biomarker for pharmacological inhibition of the histone demethylase lysine-specific demethylase 1.</a> Analytical Biochemistry. 442 (1), 104-106 (2013).</li><li>Schulz-Fincke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-activity+studies+on+N-Substituted+tranylcypromine+derivatives+lead+to+selective+inhibitors+of+lysine+specific+demethylase+1+(LSD1)+and+potent+inducers+of+leukemic+cell+differentiation.">Structure-activity studies on N-Substituted tranylcypromine derivatives lead to selective inhibitors of lysine specific demethylase 1 (LSD1) and potent inducers of leukemic cell differentiation.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 144, 52-67 (2018).</li><li>Ishii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CETSA+quantitatively+verifies+in+vivo+target+engagement+of+novel+RIPK1+inhibitors+in+various+biospecimens.">CETSA quantitatively verifies in vivo target engagement of novel RIPK1 inhibitors in various biospecimens.</a> Scientific Report. 7, 13000 (2017).</li><li>Maes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORY-2001:+An+Epigenetic+drug+for+the+treatment+of+cognition+defects+in+Alzheimer&#8217;s+disease+and+other+neurodegenerative+disorders.">ORY-2001: An Epigenetic drug for the treatment of cognition defects in Alzheimer&#8217;s disease and other neurodegenerative disorders.</a> Alzheimer&#8217;s &amp; Dementia. 12 (7), P1192 (2017).</li></ol>

ここで提示されたプロトコルは、新しいKDM1Aケモプローブ捕捉ベースのELISAを用いてKDM1Aターゲットエンゲージメントを直接測定するために開発された。この方法は、ヒト、ラット、マウスおよびヒヒ(PBMC、肺、脳、皮膚、腫瘍を含む)からの培養ヒト細胞株およびex vivoサンプルで検証されたが、KDM1A抗体標的エピトープおよび触媒を有する他の種に容易に適用することができる。中央は保存さ?...

リジン特異的デメチラーゼ1(KDM1A)1は、遺伝子転写の制御に関与するデメチラーゼである。このタンパク質は、腫瘍学における候補薬理学的標的2として出現した。急性骨髄性白血病3(AML)、骨髄異形成症候群(MDS)4、骨髄線維症(MF)5、6、小細胞肺癌(SCLC)7を含む; 鎌状赤血球病(SCD)8、9、およびアルツハイマー病(AD)、多発性硬化症(MS)を含む中枢神経系疾患において。そして侵略10で.
臨床開発におけるKDM1A阻害化合物のほとんどは、シクロプロピラミン誘導体であり、そのフラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)共因子11に共価結合することによってタンパク質を阻害する。KDM1Aの阻害は遺伝子発現変化を誘発するが、これらの変化は組織、細胞型、または疾患の場合によって大きく異なる。KDM1Aの阻害はまたヒストンマーク12を変化させ、しかもこれらの変化は一般にゲノム内の特定の部位で局所的に産生され、再び、高度な組織および細胞特異的である。
このプロトコルは、生体試料におけるKDM1A標的関与を直接測定するために開発され、シクロプロピラミン由来阻害剤との使用に最適化されています。アッセイはELISA技術に基づいており、相物由来アッセイ中の生体タンパク質抽出物中のKDM1Aを並行して、トータルおよびフリー(阻害剤によって結合しない)を分析する。第一段階として、生体試料は、ビオチン化KDM1A選択的化学プローブOG-88113,14の存在下で、臨床におけるKDM1Aの強力な阻害剤である選択的KDM1A阻害剤ORY-1001(iadademstat)に由来する。オンコジカル疾患の治療のための開発。化学プローブは120 nMのKDM1AのためのIC50を有し、生物化ポリエチレングリコール(PEG)-尾にリンクされたFAD結合部分を含んでいる。化学プローブは、自由なKDM1Aに排他的に結合しますが、サンプル中の阻害剤結合KDM1Aには結合しません。化学プローブ結合後、試料中の複合体を含むKDM1Aは、ストレプトアビジンコーティング面を有するマイクロチタプレート上で捕捉され、遊値KDM1Aを決定するか、またはモノクローナル抗KDM1A捕捉抗体で被覆されたプレート上で、全KDM1Aを決定する。洗浄後、両方のプレートを抗KDM1A検出抗体でインキュベートし、再度洗浄し、二次HRP結合ロバ抗ウサギIgG抗体でインキュベートし、相対測定による発光基板と定量を用いて検出した。照明計の光単位(RLU)(図1)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59390/59390fig1.jpg"> 図 1.ELISA酵素のスキーマは、KDM1A標的関与に対する化学プローブ免疫吸収性アッセイを連結した:A)サンドイッチELISAおよびBを用いて全KDM1Aの決定)ケモプローブELISAを用いて自由KDM1Aの決定を行った。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59390/59390fig1large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
標準曲線は、各アッセイの直線性を検証するために、両方のELISAプレートに含まれています。各サンプルにおけるKDM1Aターゲットエンゲージメントの決定は、次いで、前用量または車両処理サンプルに対する相対値として計算される。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0,05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 X Protease Inhibitor Tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>#11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep well storage block</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#734-1679</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well ELISA plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>#436110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive black Film</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>#6050173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive transparent Film</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#60941-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated KDM1A probe OG-881</td>
			<td>Oryzon Genomics S.A.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># 3117057001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#23208)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Protein Assay</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>#500-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lysis buffer 10X</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#9803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for 96- well plates</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>Rotina 420R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full length, enzymatically active human Recombinant LSD1 / KDM1A</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>#31426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 5 Project</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol-Enhacer and Peroxide Solution (Chemiluminescent Substrate)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#37074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader Infinite 200-Tecan</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Infinite 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal capture antibody Anti-KDM1A (N-terminal epitope)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>#ab53269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle G18 gauge blunt</td>
			<td>BD</td>
			<td>#303129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORY-1001 (iadademstat)</td>
			<td>Oryzon Genomics S.A.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBMC separation tubes 10 ml</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>#163288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBMC separation tubes 50 ml</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>#227288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate shaker</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td>Rotamax 120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal detection antibody Anti-KDM1A (C-terminal epitope)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#672184BF-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody Peroxidase-conjugated Donkey Anti-rabbit IgG</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#31458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer cuvette 1.5</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>#302100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer for cuvette</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GeneQuant 1300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>#Z704A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>#303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 1 ultrapure water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Milli-Q Advantage A10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner</td>
			<td>VWR</td>
			<td>USC200T</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct measurement of kdm1a target engagement using chemoprobe-based immunoassays

標的エンゲージメントの評価は、それが設計されたタンパク質との薬物の相互作用として定義され、医薬品開発または基礎研究プロジェクトにおける任意の化合物の生物学的活性の解釈のための基本的な要件である。エピジェネティクスでは、ターゲットエンゲージメントは、化合物の標的との結合を測定するのではなく、プロキシマーカーの分析によって最も頻繁に評価されます。分析された下流の生物学的読み出しには、ヒストンマーク変調または遺伝子発現の変化が含まれる。KDM1Aは、モノラルおよびジメチル化H3K4からメチル基を除去するリジンデメチラーゼであり、遺伝子発現のサイレンシングに関連する修飾である。プロキシマーカーの変調は、調査された細胞の遺伝的構成の細胞の種類と機能に依存し、解釈と大文字と小文字の比較を非常に困難にすることができます。これらの問題を回避するために、直接KDM1Aターゲットエンゲージメントの線量効果およびダイナミクスを評価する汎用性の高いプロトコルが提示される。記載されたアッセイは、KDM1Aケモプローブを使用して、非抑制酵素を捕捉し、定量化し、遺伝子改変を必要とせずに細胞や組織サンプルに広く適用することができ、検出の優れた窓を有し、基礎研究の両方に使用することができます臨床サンプルの分析。

合計および自由KDM1A決定の直線性。
標準シリーズは、ステップ5.3.2.で説明したように、全長ヒト組換えKDM1A酵素の0〜2500 pgを用いて調製された。合計および自由rKDM1AのRLU値を評価し、直線性を検証した(図2Aおよび2B)。 データは、3つの技術的反復(n)±SDを用いる3つの実験からの...

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Direct Measurement of KDM1A Target Engagement Using Chemoprobe-based Immunoassays

ケモプローブベースの免疫アッセイを用いてKDM1A標的エンゲージメントを直接測定

ここでは、KDM1A阻害剤で処理したヒトまたは動物細胞、組織または血液試料におけるKDM1A標的関与を測定するプロトコルを提示する。このプロトコルは、自由なKDM1A酵素の化学療法タグ付けと、化学プローブベースの免疫アッセイを用いた標的職業の直接定量を採用し、前臨床および臨床研究で使用することができます。

The assessment of the target engagement, defined as the interaction of a drug with the protein it was designed for, is a basic requirement for the ...

標的関与の評価、すなわち、それが設計されたタンパク質との薬物の相互作用は、薬物開発における、または基礎研究プロジェクトにおけるあらゆる化合物の生物学的活性の解釈のための基本的な要件である。この技術の主な利点は、ヒストンマークや発現などの下流効果の測定ではなく、KDM1Aターゲットエンゲージメントの用量効果とダイナミクスを直接測定できる点です。この技術は、基礎研究および臨床試験、腫瘍学的CNSまたはKDM1A阻害剤による治療を受ける他の疾患において薬力学を研究するために適用することができる。この技術は、ORY-1001、iadademstatを研究するために開発されたケモプローブに基づいていますが、実際には他のKDM1A阻害剤に使用することができ、戦略は他のターゲットに適用することができます。この手順は、私の研究室のPK/PD発見プラットフォームのオペレーションマネージャーであるRaquel Ruizによって実証されます。ORY-1001での細胞処理の間に、化合物は核内に存在するKDM1Aタンパク質に結合する。この手順を開始するには、冷蔵庫から20ミリモルビチン化プローブOG-881ストック溶液の10マイクロリットルの単独使用アリコートを冷蔵庫から取り出し、室温で10分間温めます。フィルターチップを含むマイクロパイプを使用して、ストック溶液を連続して希釈し、2つのマイクロモル作動溶液を調製します。次に、1錠のプロテアーゼ阻害剤をPBSの1ミリリットルにマイクロ遠心分離チューブに溶解する。1x細胞溶解バッファーの所望量の各ミリリットルに対して、10x細胞溶解バッファーを得た市販の100マイクロリットル、10xプロテアーゼ阻害剤の150マイクロリットル、2つのマイクロモルOG-881作業溶液の12.5マイクロモルOG-881の12.5マイクロリットルおよび737.5マイクロリットルの二重蒸留水を混合する。細胞は、任意の遊離KDM1Aタンパク質に結合するケモプローブの存在下で1xリシスバッファーにリセ化される。組織から準備するには、乾燥氷の上で冷やされたモルタルと害虫を使用して、1立方センチメートルの凍結組織を粉砕し、均質化します。アリクォートは、組織を使い捨てバイアルに入れ、常に解凍を避けながら、各バイアルに約40ミリグラムの組織粉末を確実に移す。処理の準備ができるまで、サンプルを摂氏80度で保存します。細胞ペレットから調製するために、25ナノモルOG-881を含む1x細胞のライシス緩衝液の200マイクロリットルで約1000万個の細胞のペレットを再懸濁する。各サンプルを短く渦を出し、5分間氷の上に置いておきます。超音波処理器を使用して、それぞれ20秒間持続する45キロヘルツで3パルスでサンプルを超音波処理します。パルスの間に20秒間氷の上にサンプルを置きます。さらに5分間氷の上にサンプルを保管してください。その後、摂氏4度で予冷した遠心分離機で14,000倍Gのサンプルを14,000倍にして遠心分離する。1ミリリットルマイクロピペットを使用して、各上清を別々の1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移す。チューブを氷の上に2時間放置してから処理します。次に、テキストプロトコルに概説されているように、ブラッドフォードアッセイを用いて天然タンパク質を定量化する。全板は抗KDM1A抗体でコーティングされています。フリープレートはストレプトアビジンでコーティングされています。細胞ライセートは、その後、両方のプレートに添加され、KDM1A複合体は直接またはケモプローブを介して捕捉される。プレートを洗浄し、抗KDM1A検出抗体と二次抗体を西洋ワサビペルオキシダーゼに結合してインキュベートします。最後に、発光基材を添加し、信号を生成する。総KDM1A ELISAの場合、PBSで10ミリリットルのKDM1A捕捉抗体を、各プレートに対して1ミリリットル当たり2マイクログラムの最終濃度に調製します。プレートの各ウェルに100マイクロリットルを移します。遊離KDM1A ELISAの場合、各プレートに対して1ミリリットル当たり10マイクログラムの濃度としてPBSでストレプトアビジン10ミリリットルを調製します。プレートの各ウェルに100マイクロリットルを移します。その後、各プレートを粘着フィルムで上部密封し、摂氏4度で一晩インキュベートする。翌日、冷蔵庫からプレートを取り出し、室温で約45分間平衡させます。各プレートを洗浄バッファーで3回洗浄し、洗浄ステップごとにペーパータオルのプレートをタップして残留液を取り除きます。両方のプレートの各ウェルに200マイクロリットルのブロッキングバッファを追加します。上部は、粘着フィルムでプレートを密封し、室温で2時間インキュベートします。一方、先に得られた天然タンパク質抽出物をPBSで適切な濃度に希釈し、テキストプロトコルで概説されているようにヒトrKDM1Aを用いて標準曲線を調製するプレートをレイアウトする。2時間のインキュベーションが完了したら、ブロッキングバッファを捨てて洗浄バッファでプレートを洗い、洗浄ステップの後にペーパータオルのプレートをタップして残留液を取り除きます。テキストプロトコルの表2にあるプレート分布に従って、適切な希釈サンプルを冷蔵96深井戸貯蔵ブロックに移します。このブロックを氷の上に置き、テキストプロトコルの表3に見られるプレート分布に続いて、1ウェル当たり100マイクロリットルを合計および無料のELISAプレートにピペット化します。室温で1時間インキュベートし、サンプルを捨てて洗浄バッファーで5回洗浄します。1ミリリットル当たり0.125マイクログラムの濃度でブロッキングバッファーにウサギの抗KDM1A検出抗体の20ミリリットルを調製します。陰性対照に対応するものを除き、検出抗体溶液の100マイクロリットルを両方のプレートの各ウェルに加える。上部は、粘着フィルムでプレートを密封し、室温で1時間インキュベートします。この後、検出抗体溶液を廃棄し、洗浄バッファーでプレートを6回洗浄します。25ミリリットルの二次ヤギ抗ウサギ抗体を調製し、HRP、ブロッキング緩衝液中の1〜5,000の希釈にする。マイクロタイタープレートの各ウェルに二次抗体溶液100マイクロリットルを加え、室温で1時間インキュベートします。このインキュベーション終了の30分前に、柔らかい光の条件下でアンバーボトルにルミノールエンハンサーと過酸化物溶液の等しい部分を混ぜます。この混合物は室温のままにしておきます。1時間のインキュベーションが完了したら、二次抗体溶液を捨て、洗浄バッファーでプレートを6回洗浄します。次に、100マイクロリットルのルミノール作動液をプレートの各ウェルにピペットし、気泡形成を避けるために非常にゆっくりとピペット化することを確認する。タイマーを使用して、溶液の添加とプレートの発光測定までの時間を制御し、この時間を一定に保ち、アッセイ間の再現性を高めます。上部は、接着剤フィルムと遠心分離機でプレートを500倍Gで、室温で45秒間シールし、残りの気泡を除去します。プレートを100 rpmでプレートシェーカーに1分間インキュベートします。その後、粘着フィルムを取り出し、プレートをマイクロプレートリーダーに挿入し、3分間放置して摂氏25度で温度を安定させます。各ELISAプレートアッセイの相対発光単位を読み取る。詳細な分析のために、生の RLU 値を生データ・スプレッドシート・ファイルから保存してコピーします。本研究では、新しいKDM1Aケモプローブ捕捉ベースのELISAを使用して、細胞および組織サンプルにおけるKDM1A標的関与を直接測定する。合計およびフリー rKDM1A の RLU 値が評価され、直線性が検証されます。その後、3人の独立したボランティアからヒトのPBMCで検出された合計および遊離KDM1AのRLU値が標準曲線に重ね合わされます。AML細胞は、プロバイダの推奨に従って培養され、異なる濃度で車両またはORY-1001のいずれかで処理されます。天然タンパク質抽出物は、25ミリモルのOG-881ケモプローブの存在下で得られ、0.5マイクログラムの全タンパク質が標的エンゲージメントの分析を行うために使用されます。その後、合計および無料のKDM1Aが決定され、ORY-1001からKDM1Aへの目標関与の割合が車両に対して相対的に計算されます。PBMCsにおける用量応答性KDM1A標的関与および経口ギャバジによるORY-1001を有するラットの肺治療において、その車両群に対して計算された相対値がここに示されている。このエクスビボインキュベーションは、車両処理動物からの肺タンパク質抽出物25ナノモルORY-1001を用いて、完全なTEを生み出すが、それでも、1キログラム当たり30マイクログラムで4日間治療されたラットからのサンプル中のTEをさらに増加させないが、KDM1Aが既に生体内で完全に阻害されたことを確認した。このプロトコルは、KDM1Aの目標を、無料および合計KDM1Aを測定することによって評価します。それはネイティブタンパク質抽出を必要とします覚えておいてください.この技術は、特定の阻害剤を評価するために異なる種からのサンプルに使用することができ、また、新しい阻害剤をスクリーニングする。この研究で使用されるケモプローブは、KDM1A相互作用を研究するためにケモプロテオミクスに適用することもできる。KDM1A阻害剤のような生体試料や生物活性化合物を取り扱う際には、常に安全に作業し、常に予防策を尊重することを忘れないでください。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Covalent Binding of Antibodies to Cellulose Paper Discs and Their Applications in Naked-eye Colorimetric Immunoassays

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This report presents two methods for the covalent immobilization of capture antibodies on cellulose filter paper grade No. 1 (medium-flow filter paper) ...

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Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

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コアラでのコルチゾール測定(ファスコラルコトス・シネレウス)毛皮

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A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

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