Name: direct measurement of kdm1a target engagement using chemoprobe-based immunoassays
Uploaded: 2019-06-13T13:00:00
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이 연구는 오리존 유전체학에 의해 융자되었다. S.A., 호프만 라 로슈, 부분적으로 CIIP-20152001 및 RETOS 협력 프로그램 RTC-2015-3332-1에 의해 지원.

혈액 샘플은 스페인 법률 (Real Decreto de Biobancos 1716/2011)에 따라 인스티투토 드 Investigación Biomédica Sant Pau Biobank에서 얻어졌으며 지역 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 동물 조직을 사용한 연구는 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 제도적 지침에 따라 수행되었습니다(유럽 공동체 위원회 지침 86/609/EEC)에서 동물 실험 윤리위원회가 수립했습니다. PRAAL-PCB.
1. 분석에 대한 ...

<ol>
	<li>Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+demethylation+mediated+by+the+nuclear+amine+oxidase+homolog+LSD1.">Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1.</a> Cell. 119 (7), 941-953 (2004).</li><li>Maiques-Diaz, A., Somervaille, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LSD1:+biologic+roles+and+therapeutic+targeting.">LSD1: biologic roles and therapeutic targeting.</a> Epigenomics. 8 (8), 1103-1116 (2016).</li><li>Maes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORY-1001,+a+Potent+and+Selective+Covalent+KDM1A+Inhibitor,+for+the+Treatment+of+Acute+Leukemia.">ORY-1001, a Potent and Selective Covalent KDM1A Inhibitor, for the Treatment of Acute Leukemia.</a> Cancer Cell. 33 (3), 495-511 (2018).</li><li>Sugino, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+LSD1+inhibitor+NCD38+ameliorates+MDS-related+leukemia+with+complex+karyotype+by+attenuating+leukemia+programs+via+activating+super-enhancers.">A novel LSD1 inhibitor NCD38 ameliorates MDS-related leukemia with complex karyotype by attenuating leukemia programs via activating super-enhancers.</a> Leukemia. 31 (11), 2303-2314 (2017).</li><li>Kleppe, M., Shank, K., Efthymia, P., Riehnhoff, H., Levine, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysine-Specific+Histone+Demethylase,+LSD1,+(KDM1A)+As+a+Novel+Therapeutic+Target+in+Myeloproliferative+Neoplasms.">Lysine-Specific Histone Demethylase, LSD1, (KDM1A) As a Novel Therapeutic Target in Myeloproliferative Neoplasms.</a> Blood. 126, 601 (2015).</li><li>Jutzi, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LSD1+Inhibition+Prolongs+Survival+in+Mouse+Models+of+MPN+by+Selectively+Targeting+the+Disease+Clone.">LSD1 Inhibition Prolongs Survival in Mouse Models of MPN by Selectively Targeting the Disease Clone.</a> HemaSphere. 2 (3), 54 (2018).</li><li>Mohammad, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Hypomethylation+Signature+Predicts+Antitumor+Activity+of+LSD1+Inhibitors+in+SCLC.">DNA Hypomethylation Signature Predicts Antitumor Activity of LSD1 Inhibitors in SCLC.</a> Cancer Cell. 28 (1), 57-69 (2015).</li><li>Rivers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RN-1,+a+potent+and+selective+lysine-specific+demethylase+1+inhibitor,+increases+&#947;-globin+expression,+F+reticulocytes,+and+F+cells+in+a+sickle+cell+disease+mouse+model.">RN-1, a potent and selective lysine-specific demethylase 1 inhibitor, increases &#947;-globin expression, F reticulocytes, and F cells in a sickle cell disease mouse model.</a> Experimental Hematology. 43 (7), 546-553 (2015).</li><li>Rivers, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+administration+of+the+LSD1+inhibitor+ORY-3001+increases+fetal+hemoglobin+in+sickle+cell+mice+and+baboons.">Oral administration of the LSD1 inhibitor ORY-3001 increases fetal hemoglobin in sickle cell mice and baboons.</a> Experimental Hematology. 67, 60-64 (2018).</li><li>Buesa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dual+LSD1/MAO-B+inhibitor+ORY-2001+prevents+the+development+of+the+memory+deficit+in+samp8+mice+through+induction+of+neuronal+plasticity+and+reduction+of+neuroinflammation.">The dual LSD1/MAO-B inhibitor ORY-2001 prevents the development of the memory deficit in samp8 mice through induction of neuronal plasticity and reduction of neuroinflammation.</a> Alzheimer&#8217;s &amp; Dementia. 11 (7), P905 (2015).</li><li>Schmidt, D. M., McCafferty, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-2-Phenylcyclopropylamine+is+a+mechanism-based+inactivator+of+the+histone+demethylase+LSD1.">Trans-2-Phenylcyclopropylamine is a mechanism-based inactivator of the histone demethylase LSD1.</a> Biochemistry. 46 (14), 4408-4416 (2007).</li><li>Forneris, F., Binda, C., Vanoni, M. A., Battaglioli, E., Mattevi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+histone+demethylase+LSD1+reads+the+histone+code.">Human histone demethylase LSD1 reads the histone code.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41360-41365 (2005).</li><li>Gonz#225;lez, E. C., Maes, T., Crusat, C. M., Mu#241;oz, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oryzon+Genomics,+Methods+to+determine+kdm1a+target+engagement+and+chemoprobes+useful+therefor.">Oryzon Genomics, Methods to determine kdm1a target engagement and chemoprobes useful therefor.</a> , (2016).</li><li>Mascaró, C., Ortega, A., Carceller, E., Rruiz Rodriguez, R., Cicero, F., Lunardi, S., Yu, L., Hilbert, M., Maes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoprobe-based+assays+of+histone+lysine+demethylase+1A+target+occupation+enable+in+vivo+pharmacokinetics+and+-dynamics+studies+of+KDM1A+inhibitors.">Chemoprobe-based assays of histone lysine demethylase 1A target occupation enable in vivo pharmacokinetics and -dynamics studies of KDM1A inhibitors.</a> Journal of Biological Chemistry. , (2019).</li><li>Rodriguez-Suarez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Homogeneous+Nonradioactive+Methyltransferase+and+Demethylase+Assays+Targeting+Histone+H3+Lysine+4.">Development of Homogeneous Nonradioactive Methyltransferase and Demethylase Assays Targeting Histone H3 Lysine 4.</a> Journal of Biomolecular Screening. 17 (1), 49-58 (2011).</li><li>Lynch, J. T., Cockerill, M. J., Hitchin, J. R., Wiseman, D. H., Somervaille, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD86+expression+as+a+surrogate+cellular+biomarker+for+pharmacological+inhibition+of+the+histone+demethylase+lysine-specific+demethylase+1.">CD86 expression as a surrogate cellular biomarker for pharmacological inhibition of the histone demethylase lysine-specific demethylase 1.</a> Analytical Biochemistry. 442 (1), 104-106 (2013).</li><li>Schulz-Fincke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-activity+studies+on+N-Substituted+tranylcypromine+derivatives+lead+to+selective+inhibitors+of+lysine+specific+demethylase+1+(LSD1)+and+potent+inducers+of+leukemic+cell+differentiation.">Structure-activity studies on N-Substituted tranylcypromine derivatives lead to selective inhibitors of lysine specific demethylase 1 (LSD1) and potent inducers of leukemic cell differentiation.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 144, 52-67 (2018).</li><li>Ishii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CETSA+quantitatively+verifies+in+vivo+target+engagement+of+novel+RIPK1+inhibitors+in+various+biospecimens.">CETSA quantitatively verifies in vivo target engagement of novel RIPK1 inhibitors in various biospecimens.</a> Scientific Report. 7, 13000 (2017).</li><li>Maes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORY-2001:+An+Epigenetic+drug+for+the+treatment+of+cognition+defects+in+Alzheimer&#8217;s+disease+and+other+neurodegenerative+disorders.">ORY-2001: An Epigenetic drug for the treatment of cognition defects in Alzheimer&#8217;s disease and other neurodegenerative disorders.</a> Alzheimer&#8217;s &amp; Dementia. 12 (7), P1192 (2017).</li></ol>

여기에 제시된 프로토콜은 새로운 KDM1A 화학프로브 포획 기반 ELISA를 사용하여 KDM1A 표적 참여를 직접 측정하기 위해 개발되었다. 이 방법은 인간, 쥐 및 마우스 및 개코원숭이(PBMC, 폐, 뇌, 피부, 종양 포함)에서 배양된 인간 세포주 및 생체 내 샘플에서 검증되었지만, KDM1A 항체 표적 에피토프 및 촉매가 있는 다른 종에 쉽게 적용할 수 있습니다. 센터가 보존됩니다. OG-881은 활성 기반 의 화학 프로브?...

리신 특이적 데메틸라제 1(KDM1A)은 유전자 전사의 조절에 관여하는 데메틸라제이다. 이 단백질은 종양학에서 후보 약리학적 표적 2로 나타났다; 급성 골수성 백혈병을 포함3 (AML), 골수 형성증 증후군 (MDS)4,골수 섬유증 (MF)5,6,소세포 폐암 (SCLC)7; 겸상적혈구 (SCD)8,9,및 알츠하이머 병 (AD), 다발성 경화증 (MS)을 포함한 중추 신경계 질환에서; 그리고 침략10.
임상 개발에서 KDM1A 억제 화합물의 대부분은 사이클로프로필라민 유도체이며 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드(FAD) 보조인자(FAD)에 공유 결합함으로써 단백질을 억제한다. KDM1A의 억제는 유전자 발현 변경을 유도합니다, 그러나 이 변경은 조직, 세포 모형, 또는 질병 케이스에 걸쳐 엄청나게 변화합니다. KDM1A의 억제는 또한 히스톤마크(12)를 변화시지만, 이러한 변화는 일반적으로 게놈내의 특정 부위에서 국소적으로 생성되고, 다시, 고도로 조직 및 세포 특이적이다.
이 프로토콜은 생물학적 샘플에서 KDM1A 표적 참여를 직접 측정하기 위해 개발되었으며 사이클로프로필라민 유래 억제제와 함께 사용하기 위해 최적화되었습니다. 상기 분석은 ELISA 기술을 기반으로 하고, 고체 상 분석에서 생물학적 시료로부터의 네이티브 단백질 추출물에서 총 및 자유(즉, 억제제에 의한 언바운드) KDM1A를 병렬로 분석한다. 첫 번째 단계로서, 생물학적 시료는 생물학적 KDM1A 선택적 화학프로브 OG-88113,14,선택적 KDM1A 억제제 ORY-1001(iadademstat) 임상에서 KDM1A의 강력한 억제제로부터 유래된 생체질화 된 KDM1A의 존재로부터 용해된다. 종양학 질환의 치료를위한 개발. 상기 화학프로브는 120 nM의 KDM1A에 대한 IC 50을 가지며, 생체연화된 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-꼬리에 연결된 FAD 결합 모티프를 포함한다. 화학 프로브는 자유 KDM1A에 독점적으로 결합하지만, 샘플내의 억제제 결합 KDM1A에는 결합하지 않는다. 화학 프로브 결합 후, 샘플에 복합체를 포함하는 KDM1A는 스크렙타비딘 코팅 표면이있는 마이크로 티터 플레이트에서 포착되어 무료 KDM1A를 결정하거나 단일 클론 안티 KDM1A 캡처 항체로 코팅된 플레이트에서 총 KDM1A를 결정합니다. 세척 후, 두 플레이트는 항 KDM1A 검출 항체로 배양되고, 다시 세척하고, 상대적 측정에 의해 발광 기질 및 정량화를 사용하여 검출을 위한 이차 HRP-컨쥬게이트 당나귀 반토끼 IgG 항체로 배양 광도계(그림 1)에서 라이트 유닛(RLU)을 표시합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59390/59390fig1.jpg"> 그림 1. ELISA 효소의 스키마 는 KDM1A 표적 결합을 위한 화학프로브 면역흡수제 분석과 연결: A) 샌드위치 ELISA 및 B를 이용한 총 KDM1A의 측정체ELISA를 이용한 자유 KDM1A의 측정. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59390/59390fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표준 곡선은 각 분석법의 선형성을 확인하기 위해 두 ELISA 플레이트에 포함되어 있습니다. 각 샘플에서 KDM1A 표적 결합의 측정은 사전 투여량 또는 비구시 처리 샘플에 대한 상대값으로 계산된다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0,05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 X Protease Inhibitor Tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>#11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep well storage block</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#734-1679</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well ELISA plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>#436110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive black Film</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>#6050173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive transparent Film</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#60941-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated KDM1A probe OG-881</td>
			<td>Oryzon Genomics S.A.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># 3117057001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#23208)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Protein Assay</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>#500-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lysis buffer 10X</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#9803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for 96- well plates</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>Rotina 420R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full length, enzymatically active human Recombinant LSD1 / KDM1A</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>#31426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 5 Project</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol-Enhacer and Peroxide Solution (Chemiluminescent Substrate)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#37074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader Infinite 200-Tecan</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Infinite 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal capture antibody Anti-KDM1A (N-terminal epitope)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>#ab53269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle G18 gauge blunt</td>
			<td>BD</td>
			<td>#303129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORY-1001 (iadademstat)</td>
			<td>Oryzon Genomics S.A.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBMC separation tubes 10 ml</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>#163288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBMC separation tubes 50 ml</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>#227288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate shaker</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td>Rotamax 120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal detection antibody Anti-KDM1A (C-terminal epitope)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#672184BF-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody Peroxidase-conjugated Donkey Anti-rabbit IgG</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#31458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer cuvette 1.5</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>#302100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer for cuvette</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GeneQuant 1300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>#Z704A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>#303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 1 ultrapure water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Milli-Q Advantage A10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner</td>
			<td>VWR</td>
			<td>USC200T</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct measurement of kdm1a target engagement using chemoprobe-based immunoassays

표적 참여의 평가는, 그것이 디자인된 단백질과 약의 상호 작용으로 정의되고, 약 개발 또는 기초 연구 프로젝트에서 어떤 화합물든지의 생물학 활동의 해석을 위한 기본적인 필요조건입니다. 후성 유전학에서, 표적 약혼은 표적에 화합물의 결합을 측정하는 대신 프록시 마커의 분석에 의해 가장 수시로 평가됩니다. 분석된 다운스트림 생물학적 판독은 히스톤 마크 변조 또는 유전자 발현 변화를 포함한다. KDM1A는 유전자 발현의 침묵과 관련된 변형인 모노-및 디메틸화된 H3K4로부터 메틸기를 제거하는 리신 데메틸라제이다. 프록시 마커의 변조는 조사된 세포의 유전적 구성의 세포 유형 및 기능에 의존하며, 이는 해석 및 교차 사례 비교를 매우 어렵게 만들 수 있다. 이러한 문제를 회피하기 위해, 직접 KDM1A 표적 참여의 투여 량 효과 및 역학을 평가하기 위한 다목적 프로토콜이 제시된다. 기재된 분석시험은 KDM1A 화학프로브를 사용하여 억제되지 않은 효소를 포착하고 정량화하고, 유전자 변형없이 세포 또는 조직 샘플에 광범위하게 적용될 수 있으며, 우수한 검출 창을 가지며, 기초 연구에 모두 사용될 수 있습니다. 임상 샘플의 분석.

총 및 자유 KDM1A 결정의 선형성.
표준 시리즈는 5.3.2.단계에서 기재된 바와 같이, 0~2500 pg의 전길이 인간 재조합 KDM1A 효소를 사용하여 제조하였다. 총 및 자유 rKDM1A의 RLU 값을 평가하여 선형도를 검증하였다(도2A 및 2B). 데이터는 3개의 기술적 복제(n) ± SD를 가진 3개의 실험으로부터...

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Direct Measurement of KDM1A Target Engagement Using Chemoprobe-based Immunoassays

화학 프로브 기반 면역 분석제사용 KDM1A 표적 결합의 직접 측정

여기서, 우리는 KDM1A 억제물로 처리된 인간 또는 동물 세포, 조직 또는 혈액 샘플에서 KDM1A 표적 결합을 측정하는 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 무료 KDM1A 효소의 화학 프로브 태깅및 화학 프로브 기반 면역 검술을 사용하여 표적 직업의 직접 정량화를 채택하고 전임상 및 임상 연구에서 사용될 수 있습니다.

The assessment of the target engagement, defined as the interaction of a drug with the protein it was designed for, is a basic requirement for the ...

표적 참여의 평가, 즉, 약물과의 약물의 상호 작용은 약물 개발또는 기초 연구 프로젝트에서 임의의 화합물의 생물학적 활성해석을 위한 기본 요건이다. 이 기술의 주요 장점은 히스톤 마크 및 발현과 같은 다운스트림 효과의 측정보다는 KDM1A 대상 참여의 용량 효과 및 역학을 직접 측정할 수 있다는 것입니다. 이 기술은 기초 연구및 또한 임상 시험에서, 종양학 CNS 또는 약리학을 공부하기 위하여 KDM1A 억제제로 처리를 받는 그밖 질병에서 적용될 수 있습니다.이 기술은 ORY-1001, iadademstat를 연구하기 위해 개발된 화학 프로브를 기반으로 하지만, 다른 KDM1A 억제제에 실제로 사용될 수 있으며 전략은 다른 표적에 적용될 수 있다. 절차는 Raquel Ruiz에 의해 입증됩니다, 내 실험실에서 PK / PD 발견 플랫폼의 운영 관리자. ORY-1001을 사용하여 세포 치료 하는 동안 화합물은 핵에 존재 하는 KDM1A 단백질에 결합.이 절차를 시작하려면 냉장고에서 20 밀리머 바이오티네이트 프로브 OG-881 스톡 솔루션의 10 마이크로리터 일회용 알리쿼트를 검색하고 실온에서 10 분 동안 따뜻하게하십시오. 필터 팁이 있는 마이크로파이프를 사용하여 재고 용액을 일련적으로 희석하여 두 개의 마이크로몰러 작동 솔루션을 준비합니다. 다음으로, 마이크로센티슈에이처 튜브에 PBS의 1밀리리터에 프로테아제 억제제 1정을 용해한다.화학 프로브와 1x 세포 용해 버퍼의 원하는 부피의 각 밀리리터에 대해, 상업적으로 얻은 10x 세포 용해 버퍼의 100 마이크로리터, 10x 프로테아제 억제제의 150 마이크로리터, 2개의 마이크로몰라 OG-881 작업 용액의 12.5 마이크로리터 및 737.5 마이크로리터를 혼합한다. 세포는 어떤 무료 KDM1A 단백질에 결합하는 화학 프로브의 존재에 1 x lysis 완충제에서 lysed. 조직에서 준비하려면 마른 얼음에 차가운 박격포와 유봉을 사용하여 냉동 조직의 1 입방 센티미터 조각을 분쇄하고 균질화하십시오.Aliquot 는 조직을 일회용 바이알로 인용하여 항상 해동을 피하면서 약 40 밀리그램의 조직 분말을 각 유리병으로 옮기십시오. 처리 준비가 될 때까지 샘플을 섭씨 80도에 저장합니다. 세포 펠릿에서 준비하기 위하여는, 25 나노몰라 OG-881를 포함하는 1x 세포 용해 완충제의 200 마이크로리터에서 대략 1,000만 개의 세포의 펠릿을 재중단합니다.각 샘플을 간략하게 소용돌이시키고 5 분 동안 얼음에 보관하십시오. 초음파 처리기는 각각 20 초 동안 지속되는 45 킬로 헤르츠에서 세 개의 펄스로 샘플을 초음파 처리합니다. 샘플을 펄스 사이에 20초 동안 얼음 위에 놓습니다.샘플을 얼음 위에 5분 더 보관하십시오. 그런 다음, 소용돌이를 짧게 원심분리하고 4°C에서 미리 냉각되는 원심분리기에서 10분 동안 14, 000배 G로 샘플을 원심분리합니다. 1 밀리리터 마이크로파이프를 사용하여 각 체판을 별도의 1.5 밀리리터 미세 원심 분리튜브로 옮기는다.처리하기 전에 2 시간 동안 튜브를 얼음에 둡니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 브래드포드 분석체를 사용하여 네이티브 단백질을 정량화합니다. 총 플레이트는 항 KDM1A 항체로 코팅된다.프리 플레이트는 스트렙타비딘으로 코팅되어 있습니다. 세포 용해는 플레이트 와 KDM1A 복합체모두에 첨가되어 직접 또는 화학 프로브를 통해 포획된다. 플레이트는 안티 KDM1A 검출 항체와 고추냉이 과산화제에 결합된 이차 항체로 세척 및 배양된다.마지막으로 발광 기판이 추가되고 신호가 생성됩니다. 총 KDM1A ELISA의 경우, PBS에서 10밀리리터의 KDM1A 포획 항체를 각 플레이트당 밀리리터당 2마이크로그램의 최종 농도로 준비한다. 100 마이크로리터를 접시의 각 우물로 옮기.무료 KDM1A ELISA의 경우 PBS에서 각 플레이트당 밀리리터당 10 마이크로그램의 농도로 10밀리리터의 스트렙타비딘을 준비하십시오. 100 마이크로리터를 접시의 각 우물로 옮기. 그런 다음 각 플레이트에 접착제 필름으로 상단 을 밀봉하고 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양하십시오.다음 날, 냉장고에서 접시를 제거하고 약 45 분 동안 실온에서 평형하자. 세척 버퍼로 각 접시를 세 번 씻고, 세척 단계마다 접시를 탭하여 잔류 용액을 제거하십시오. 두 플레이트의 각 웰에 200 마이크로리터의 블로킹 버퍼를 추가합니다.상단 접착제 필름으로 접시를 밀봉하고 2 시간 동안 실온에서 배양. 한편, 이전에 획득한 원토단백질 추출물을 PBS로 희석하여 적절한 농도로 희석하고, 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 인간 rKDM1A를 사용하여 표준 곡선을 준비하는 플레이트를 배치한다. 2시간 의 인큐베이션이 완료된 후 블로킹 버퍼를 버리고 세척 버퍼로 접시를 세척하여 세척 버퍼로 세척하여 세척 단계마다 세척 단계마다 플레이트를 탭하여 잔류 용액을 제거하십시오.텍스트 프로토콜의 표 2에서 발견되는 플레이트 분포에 따라 적절한 희석 된 샘플을 냉장 96 깊이 의 저장 블록으로 전송합니다. 텍스트 프로토콜의 표 3에서 발견되는 플레이트 분포에 따라 총 및 무료 ELISA 플레이트에 잘 100 마이크로 리터를 파이펫하는 동안 얼음에이 블록을 유지합니다. 실온에서 1시간 동안 배양한 다음 샘플을 버리고 세척 버퍼로 접시를 5번 세척합니다.밀리리터당 0.125 마이크로그램의 농도로 버퍼를 차단하는 토끼 안티-KDM1A 검출 항체 20 밀리리터를 준비한다. 음극제에 대응하는 것을 제외하고, 검출 항체 용액 100마이크로리터를 두 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 상단 접착제 필름으로 접시를 밀봉하고 1 시간 동안 실온에서 배양.그 후, 검출 항체 용액을 버리고 세척 버퍼로 플레이트를 6번 세척합니다. 블로킹 버퍼에서 1~5, 000의 희석에 이차 염소 안티래빗 항체 HRP의 25 밀리리터를 준비한다. 마이크로티터 플레이트의 각 웰에 이차 항체 용액 100마이크로리터를 추가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.이 인큐베이션이 끝나기 30분 전에, 부드러운 조명 조건에서 앰버 병에 루미놀 인핸서와 과산화수소 용액의 동일한 부분을 혼합합니다. 이 혼합물을 실온에 둡니다. 1시간 배양이 완료되면 이차 항체 용액을 버리고 세척 버퍼로 플레이트를 6번 세척합니다.다음으로, 플레이트의 각 웰에 루미놀 작동 용액의 파이프 100 마이크로리터, 거품 형성을 피하기 위해 매우 느리게 파이프를 해야합니다. 타이머를 사용하여 용액의 첨가와 플레이트의 발광 측정 사이의 시간을 제어하고 좋은 상호 분석 형 재현성을 달성하기 위해이 시간을 일정하게 유지합니다. 상단은 접착제 필름과 원심분리기로 플레이트를 500배 G와 실온에서 45초 동안 밀봉하여 남은 거품을 제거합니다.플레이트 셰이커에 플레이트를 100rpm에 1분간 배양합니다. 그런 다음 접착제 필름을 제거하고 마이크로 플레이트 판독기에 플레이트를 삽입하여 섭씨 25도에서 온도를 안정화하기 위해 3 분 동안 둡니다. 각 ELISA 플레이트 분석기의 상대발광 단위를 읽어보십시오.추가 분석을 위해 원시 데이터 스프레드시트 파일에서 원시 RLU 값을 저장하고 복사합니다. 이 연구에서는, 새로운 KDM1A 화학 프로브 포획 기반 ELISA는 세포 및 조직 샘플에서 KDM1A 표적 참여를 직접 측정하는 데 사용됩니다. 총 RKDM1A의 RLU 값은 선형성을 확인하기 위해 평가됩니다.3명의 독립적인 지원자로부터 인간 PBMC에서 감지된 총 및 무료 KDM1A의 RLU 값이 표준 곡선에 중첩됩니다. AML 세포는 공급자 권고에 따라 배양되고 다른 농도에서 차량 또는 ORY-1001로 처리됩니다. 네이티브 단백질 추출물은 25밀리몰러 OG-881 화학 프로브와 0.5 마이크로그램의 총 단백질이 표적 참여의 분석을 수행하는 데 사용된다.그런 다음 총 KDM1A가 결정되고 ORY-1001에서 KDM1A에 대한 목표 참여비율이 차량에 비해 계산됩니다. 용량 반응형 KDM1A 표적 참여는 PBMC와 ORY-1001을 가진 쥐의 폐 처리에서 경구 개비에 의한, 계산된 상대적인 차량 그룹이 여기에 도시된다. 전 생체 내 비보 인큐베이션은 차량 치료 동물로부터 25 나노몰러 ORY-1001의 폐 단백질 추출물을 함유하고, 아직 전체 TE를 산출하지만, 킬로그램 ORY-1001당 30 마이크로그램으로 4일 동안 치료된 쥐의 샘플에서 TE를 더 이상 증가시키지 못하고, KDM1A가 이미 생체 내에서 완전히 억제되었다는 것을 확인하였다.이 프로토콜은 KDM1A 대상 참여를 무료로 측정하여 KDM1A 대상 참여를 평가합니다. 그것은 네이티브 단백질 추출을 필요로 기억. 이 기술은 특정 억제제를 평가하기 위해 다른 종의 샘플에 사용할 수 있으며 새로운 억제제를 검사할 수도 있습니다.이 연구에서 사용되는 화학 프로브는 또한 KDM1A 상호 작용을 연구하기 위해 화학 요법을 신청할 수 있습니다. KDM1A 억제제와 같은 생물학적 샘플 및 생리 활성 화합물을 취급할 때 항상 안전하고 존중해야 합니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Covalent Binding of Antibodies to Cellulose Paper Discs and Their Applications in Naked-eye Colorimetric Immunoassays

셀룰로오스 종이 디스크와 벌거 벗은 눈 색채 면역 측정법에 그들의 응용 프로그램에 항체의 결합 공유

This report presents two methods for the covalent immobilization of capture antibodies on cellulose filter paper grade No. 1 (medium-flow filter paper) ...

연구

생화학

Measurement of Basal and Forskolin-stimulated Lipolysis in Inguinal Adipose Fat Pads

사타구니 지방 지방 패드에서 기저 및 포스 콜린 자극 된 지방 분해의 측정

Lipolysis is a process by which the lipid stored as triglycerides in adipose tissues are hydrolyzed into glycerol and fatty acids. This article describes ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

대상 단백질에 대 한 내 생 포스트 번역 상 수정 프로필을 식별 하는 포괄적인 Immunoprecipitation 농축 시스템을 활용 하 여

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Simultaneous Measurement of Superoxide/Hydrogen Peroxide and NADH Production by Flavin-containing Mitochondrial Dehydrogenases

초과/수소 과산화 수소와 NADH 생산 미토 콘 드리 아 Dehydrogenases 플 라빈을 포함 하 여 동시 측정

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include ...

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

조직의 최소 금액을 사용 하 여 초파리의 Permeabilized 섬유에 미토 콘 드리 아 산소 소비량의 측정

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

A Direct Force Probe for Measuring Mechanical Integration Between the Nucleus and the Cytoskeleton

핵과 골격 사이 기계적인 통합을 측정 하기 위한 직접적인 힘 프로브

The mechanical properties of the nucleus determine its response to mechanical forces generated in cells. Because the nucleus is molecularly continuous ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

척도 부착 셀에 대상 참여를 이미징 높은 콘텐츠를 사용 하 여

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

경쟁 적정 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 녹음 방송 요인 DNA 바인딩 선호도의 높은 감도 측정

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Cortisol Measurement in Koala (Phascolarctos cinereus) Fur

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코알라의 코티솔 측정(파스콜아크토시네레우스)모피

Optimal methods of hormone extraction used to measure stress in animals across sample types are not always the same. Australia&#39;s iconic marsupial ...

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

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라파마이신/mTOR 상호 작용을 연구하기 위한 반정량적 약물 선호도 반응 형 표적 안정성(DARTS) 분석

Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) is a robust method for detection of novel small molecule protein targets. It can be used to verify known ...