Name: direct measurement of kdm1a target engagement using chemoprobe-based immunoassays
Uploaded: 2019-06-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Measurement of KDM1A Target Engagement Using Chemoprobe-based Immunoassays at JoVE.com

Denne studien ble finansiert av Oryzon Genomics. S.A., Hoffman-La Roche, og delvis støttes av CIIP-20152001 og RETOS samarbeid programmet RTC-2015-3332-1.

Blodprøvene ble innhentet fra Instituto de Investigación Biomédica Sant Pau biobank i henhold til spansk lovgivning (Real Decreto de Biobancos 1716/2011) og godkjennelse av lokale etikk komiteer. Studier med animalsk vev ble utført i samsvar med de institusjonelle retningslinjer for omsorg og bruk av forsøksdyr (det europeiske fellesskap rådsdirektiv 86/609/EØF) etablert av etisk komité for dyre eksperimentering ved PRAAL-PCB.
1. utarbeidelse av biologiske prøver for analysen.<...

<ol>
	<li>Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+demethylation+mediated+by+the+nuclear+amine+oxidase+homolog+LSD1.">Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1.</a> Cell. 119 (7), 941-953 (2004).</li><li>Maiques-Diaz, A., Somervaille, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LSD1:+biologic+roles+and+therapeutic+targeting.">LSD1: biologic roles and therapeutic targeting.</a> Epigenomics. 8 (8), 1103-1116 (2016).</li><li>Maes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORY-1001,+a+Potent+and+Selective+Covalent+KDM1A+Inhibitor,+for+the+Treatment+of+Acute+Leukemia.">ORY-1001, a Potent and Selective Covalent KDM1A Inhibitor, for the Treatment of Acute Leukemia.</a> Cancer Cell. 33 (3), 495-511 (2018).</li><li>Sugino, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+LSD1+inhibitor+NCD38+ameliorates+MDS-related+leukemia+with+complex+karyotype+by+attenuating+leukemia+programs+via+activating+super-enhancers.">A novel LSD1 inhibitor NCD38 ameliorates MDS-related leukemia with complex karyotype by attenuating leukemia programs via activating super-enhancers.</a> Leukemia. 31 (11), 2303-2314 (2017).</li><li>Kleppe, M., Shank, K., Efthymia, P., Riehnhoff, H., Levine, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysine-Specific+Histone+Demethylase,+LSD1,+(KDM1A)+As+a+Novel+Therapeutic+Target+in+Myeloproliferative+Neoplasms.">Lysine-Specific Histone Demethylase, LSD1, (KDM1A) As a Novel Therapeutic Target in Myeloproliferative Neoplasms.</a> Blood. 126, 601 (2015).</li><li>Jutzi, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LSD1+Inhibition+Prolongs+Survival+in+Mouse+Models+of+MPN+by+Selectively+Targeting+the+Disease+Clone.">LSD1 Inhibition Prolongs Survival in Mouse Models of MPN by Selectively Targeting the Disease Clone.</a> HemaSphere. 2 (3), 54 (2018).</li><li>Mohammad, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Hypomethylation+Signature+Predicts+Antitumor+Activity+of+LSD1+Inhibitors+in+SCLC.">DNA Hypomethylation Signature Predicts Antitumor Activity of LSD1 Inhibitors in SCLC.</a> Cancer Cell. 28 (1), 57-69 (2015).</li><li>Rivers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RN-1,+a+potent+and+selective+lysine-specific+demethylase+1+inhibitor,+increases+&#947;-globin+expression,+F+reticulocytes,+and+F+cells+in+a+sickle+cell+disease+mouse+model.">RN-1, a potent and selective lysine-specific demethylase 1 inhibitor, increases &#947;-globin expression, F reticulocytes, and F cells in a sickle cell disease mouse model.</a> Experimental Hematology. 43 (7), 546-553 (2015).</li><li>Rivers, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+administration+of+the+LSD1+inhibitor+ORY-3001+increases+fetal+hemoglobin+in+sickle+cell+mice+and+baboons.">Oral administration of the LSD1 inhibitor ORY-3001 increases fetal hemoglobin in sickle cell mice and baboons.</a> Experimental Hematology. 67, 60-64 (2018).</li><li>Buesa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dual+LSD1/MAO-B+inhibitor+ORY-2001+prevents+the+development+of+the+memory+deficit+in+samp8+mice+through+induction+of+neuronal+plasticity+and+reduction+of+neuroinflammation.">The dual LSD1/MAO-B inhibitor ORY-2001 prevents the development of the memory deficit in samp8 mice through induction of neuronal plasticity and reduction of neuroinflammation.</a> Alzheimer&#8217;s &amp; Dementia. 11 (7), P905 (2015).</li><li>Schmidt, D. M., McCafferty, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-2-Phenylcyclopropylamine+is+a+mechanism-based+inactivator+of+the+histone+demethylase+LSD1.">Trans-2-Phenylcyclopropylamine is a mechanism-based inactivator of the histone demethylase LSD1.</a> Biochemistry. 46 (14), 4408-4416 (2007).</li><li>Forneris, F., Binda, C., Vanoni, M. A., Battaglioli, E., Mattevi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+histone+demethylase+LSD1+reads+the+histone+code.">Human histone demethylase LSD1 reads the histone code.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41360-41365 (2005).</li><li>Gonz#225;lez, E. C., Maes, T., Crusat, C. M., Mu#241;oz, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oryzon+Genomics,+Methods+to+determine+kdm1a+target+engagement+and+chemoprobes+useful+therefor.">Oryzon Genomics, Methods to determine kdm1a target engagement and chemoprobes useful therefor.</a> , (2016).</li><li>Mascaró, C., Ortega, A., Carceller, E., Rruiz Rodriguez, R., Cicero, F., Lunardi, S., Yu, L., Hilbert, M., Maes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoprobe-based+assays+of+histone+lysine+demethylase+1A+target+occupation+enable+in+vivo+pharmacokinetics+and+-dynamics+studies+of+KDM1A+inhibitors.">Chemoprobe-based assays of histone lysine demethylase 1A target occupation enable in vivo pharmacokinetics and -dynamics studies of KDM1A inhibitors.</a> Journal of Biological Chemistry. , (2019).</li><li>Rodriguez-Suarez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Homogeneous+Nonradioactive+Methyltransferase+and+Demethylase+Assays+Targeting+Histone+H3+Lysine+4.">Development of Homogeneous Nonradioactive Methyltransferase and Demethylase Assays Targeting Histone H3 Lysine 4.</a> Journal of Biomolecular Screening. 17 (1), 49-58 (2011).</li><li>Lynch, J. T., Cockerill, M. J., Hitchin, J. R., Wiseman, D. H., Somervaille, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD86+expression+as+a+surrogate+cellular+biomarker+for+pharmacological+inhibition+of+the+histone+demethylase+lysine-specific+demethylase+1.">CD86 expression as a surrogate cellular biomarker for pharmacological inhibition of the histone demethylase lysine-specific demethylase 1.</a> Analytical Biochemistry. 442 (1), 104-106 (2013).</li><li>Schulz-Fincke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-activity+studies+on+N-Substituted+tranylcypromine+derivatives+lead+to+selective+inhibitors+of+lysine+specific+demethylase+1+(LSD1)+and+potent+inducers+of+leukemic+cell+differentiation.">Structure-activity studies on N-Substituted tranylcypromine derivatives lead to selective inhibitors of lysine specific demethylase 1 (LSD1) and potent inducers of leukemic cell differentiation.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 144, 52-67 (2018).</li><li>Ishii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CETSA+quantitatively+verifies+in+vivo+target+engagement+of+novel+RIPK1+inhibitors+in+various+biospecimens.">CETSA quantitatively verifies in vivo target engagement of novel RIPK1 inhibitors in various biospecimens.</a> Scientific Report. 7, 13000 (2017).</li><li>Maes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORY-2001:+An+Epigenetic+drug+for+the+treatment+of+cognition+defects+in+Alzheimer&#8217;s+disease+and+other+neurodegenerative+disorders.">ORY-2001: An Epigenetic drug for the treatment of cognition defects in Alzheimer&#8217;s disease and other neurodegenerative disorders.</a> Alzheimer&#8217;s &amp; Dementia. 12 (7), P1192 (2017).</li></ol>

Protokollen som presenteres her ble utviklet for å direkte måle KDM1A mål engasjement ved hjelp av en roman KDM1A chemoprobe fangst basert ELISA. Metoden har blitt validert for kulturperler menneskelige cellelinjer og ex vivo prøver fra menneske, rotte og mus og bavian (inkludert Pbmc, lunge, hjerne, hud, svulster), men kan lett brukes til andre arter der KDM1A antistoff målet epitopes og katalysator senteret er bevart. AS OG-881 er en aktivitet basert chemoprobe, er utvalget kvaliteten viktig og forsvarlig manipula...

Lysin spesifikke demethylase 1 (KDM1A)1 er en demethylase involvert i kontroll av genet transkripsjon. Dette proteinet har dukket opp som en kandidat farmakologisk mål2 i onkologi; inkludert akutt myelogen leukemi3 (AML), myelodysplasi syndrom (MDS)4, myelofibrose (MF)5,6, liten celle lungekreft (SCLC)7; i sigdcellesykdom (SCD)8,9, og i sentrale nervesystemet sykdommer inkludert Alzheimers sykdom (AD), multippel sklerose (MS); og i aggresjon10.
Mesteparten av KDM1A hemme forbindelser i klinisk utvikling er cyclopropylamine derivater og hemme proteinet ved kovalente binding til sin Flavin adenine dinucleotide (FAD) kofaktor11. Hemming av KDM1A induserer genuttrykk endringer, men disse endringene varierer enormt på tvers av vev, celletyper, eller sykdomstilfeller. Hemming av KDM1A også endringer histone merker12, men disse endringene er vanligvis produsert lokalt på et bestemt sted i Genova, og er igjen, svært vev og celle spesifikke.
Protokollen ble utviklet for å direkte måle KDM1A mål engasjement i biologiske prøver og har blitt optimalisert for bruk med cyclopropylamine avledet hemmere. Analysen er basert på ELISA teknologi og analyser, parallelt, total og gratis (dvs. ubundet av inhibitor) KDM1A i en innfødt protein ekstrakt fra en biologisk prøve i en solid fase analysen. Som et første skritt er den biologiske prøven lysert i nærvær av biotinylated KDM1A selektive chemoprobe og-88113,14, avledet fra den selektive KDM1A inhibitor ORY-1001 (iadademstat), en potent hemmer av KDM1A i klinisk utvikling for behandling av onkologiske sykdom. Den chemoprobe har en IC50 for KDM1A av 120 nM og inkluderer en kjepphest bindende moiety knyttet til en biotinylated polyetylen GLYKOL (PEG)-tail. Chemoprobe binder utelukkende til den frie KDM1A, men ikke til den hemmer-bundne KDM1A i prøven. Etter den chemoprobe bindingen blir KDM1A som inneholder komplekser i prøven fanget opp på mikrotiterbrønnene plater med streptavidin belagt overflate for å bestemme fri KDM1A, eller på plater belagt med et monoklonale anti-KDM1A fangst antistoff for å fastslå total KDM1A. Etter vask er begge platene inkubert med et anti-KDM1A deteksjon antistoff, vasket igjen, og inkubert med et sekundært HRP-bøyd esel anti-kanin IgG antistoff for påvisning ved hjelp av et selvlysende substrat og kvantifisering ved å måle relative lys enheter (RLU) i en luminometeret (figur 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59390/59390fig1.jpg"> Figur 1. Skjema av ELISA enzym knyttet chemoprobe immunoabsorbent analysen for KDM1A Target engasjement: A) fastsettelse av total KDM1A bruker sandwich Elisa og B) fastsettelse av gratis KDM1A bruker CHEMOPROBE Elisa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59390/59390fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
En standard kurve er inkludert i begge ELISA-platene for å verifisere linearitet til hver analyse. Fastsettelse av KDM1A mål engasjement i hver prøve blir deretter beregnet som en relativ verdi til pre-dose eller kjøretøy behandlet prøven.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0,05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 X Protease Inhibitor Tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>#11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep well storage block</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#734-1679</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well ELISA plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>#436110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive black Film</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>#6050173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive transparent Film</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#60941-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated KDM1A probe OG-881</td>
			<td>Oryzon Genomics S.A.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># 3117057001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#23208)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Protein Assay</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>#500-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lysis buffer 10X</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#9803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for 96- well plates</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>Rotina 420R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full length, enzymatically active human Recombinant LSD1 / KDM1A</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>#31426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 5 Project</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol-Enhacer and Peroxide Solution (Chemiluminescent Substrate)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#37074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader Infinite 200-Tecan</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Infinite 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal capture antibody Anti-KDM1A (N-terminal epitope)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>#ab53269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle G18 gauge blunt</td>
			<td>BD</td>
			<td>#303129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORY-1001 (iadademstat)</td>
			<td>Oryzon Genomics S.A.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBMC separation tubes 10 ml</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>#163288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBMC separation tubes 50 ml</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>#227288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate shaker</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td>Rotamax 120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal detection antibody Anti-KDM1A (C-terminal epitope)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#672184BF-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody Peroxidase-conjugated Donkey Anti-rabbit IgG</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#31458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer cuvette 1.5</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>#302100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer for cuvette</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GeneQuant 1300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>#Z704A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>#303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 1 ultrapure water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Milli-Q Advantage A10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner</td>
			<td>VWR</td>
			<td>USC200T</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct measurement of kdm1a target engagement using chemoprobe-based immunoassays

Vurderingen av målet engasjement, definert som samspillet av et medikament med proteinet den ble utformet for, er et grunnleggende krav for tolkningen av biologisk aktivitet av enhver forbindelse i narkotika utvikling eller i grunnleggende forskningsprosjekter. I epigenetikk, mål engasjement er oftest vurdert av analysen av proxy markører i stedet for å måle foreningen av sammensatte til målet. Nedstrøms biologiske readouts som har blitt analysert inkluderer histone merke modulering eller genuttrykk endringer. KDM1A er en lysin-demethylase som fjerner metyl-grupper fra mono-og dimethylated H3K4, en modifikasjon knyttet til deaktivering av genuttrykk. Modulering av proxy markører er avhengig av celle type og funksjon av genetisk make-up av cellene undersøkt, som kan gjøre tolkning og kryss-saken sammenligning ganske vanskelig. For å omgå disse problemene, presenteres en allsidig protokoll for å vurdere dose effekter og dynamikk av direkte KDM1A mål engasjement. Analysen beskrevet gjør bruk av en KDM1A chemoprobe å fange og kvantifisere uhemmet enzym, kan grovt brukes på celler eller vevsprøver uten behov for genetisk modifisering, har et utmerket vindu for deteksjon, og kan brukes både for grunnleggende forskning analyse av kliniske prøver.

Den linearitet av total og gratis KDM1A besluttsomhet.
En standard serie ble utarbeidet som beskrevet i trinn 5.3.2., bruker 0 til 2500 PG av full-lengde humant rekombinant KDM1A enzym. RLU-verdiene til total og Free rKDM1A ble vurdert for å verifisere linearitet (figur 2a og 2b). Data representeres som gjennomsnittet fra 3 eksperimenter med 3 tekniske replikerer (...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Measurement of KDM1A Target Engagement Using Chemoprobe-based Immunoassays at JoVE.com

Direct Measurement of KDM1A Target Engagement Using Chemoprobe-based Immunoassays

Direkte måling av KDM1A Target Engagement ved hjelp av Chemoprobe-baserte immunanalyser

Her presenterer vi en protokoll for å måle KDM1A mål engasjement i et menneske eller dyr celle, vev eller blodprøver behandlet med KDM1A-hemmere. Protokollen sysselsetter chemoprobe merking av det frie KDM1A-enzymet og direkte kvantifisering av mål okkupasjonen ved hjelp av chemoprobe-baserte immunanalyser og kan brukes i prekliniske og kliniske studier.

The assessment of the target engagement, defined as the interaction of a drug with the protein it was designed for, is a basic requirement for the ...

Vurderingen av målengasjementet, det vil si samspillet mellom et stoff med proteinet det ble designet for, er et grunnleggende krav for tolkning av den biologiske aktiviteten til enhver forbindelse i narkotikautvikling, eller i grunnleggende forskningsprosjekter. Den største fordelen med denne teknikken er at den tillater direkte måling av doseeffekt og dynamikk i KDM1A målengasjement, i stedet for målinger av nedstrøms effekter som histonemerker og uttrykk. Denne teknikken kan brukes i grunnleggende forskning og også i kliniske studier, i onkologiske CNS eller andre sykdommer som er utsatt for behandling med KDM1A-hemmer for å studere farmakodynamikk.Denne teknikken er basert på en kjemoprobe utviklet for å studere ORY-1001, iadademstat, men kan virkelig brukes til andre KDM1A-hemmere og strategien kan brukes på andre mål. Prosedyren vil bli demonstrert av Raquel Ruiz, operasjonsleder for PK / PD discovery plattform fra laboratoriet mitt. Under cellebehandling med ORY-1001 forbindelsen binder seg til KDM1A protein som finnes i kjernen.For å starte denne prosedyren, hent en 10 mikroliter engangs aliquot av 20 millimolar biotinyated sonde OG-881 lagerløsning fra kjøleskapet og la den varme opp ved romtemperatur i 10 minutter. Bruk en mikropipet med filterspisser, fortynn lagerløsningen for å klargjøre de to mikromosalære arbeidsløsningen. Deretter oppløser du en tablett proteasehemmer i en milliliter PBS i et mikrocentrifugerør.For hver milliliter av ønsket volum av 1x cellelysbuffer med kjemoproben, bland 100 mikroliter kommersielle oppnådde 10x cellelysbuffer, 150 mikroliter av 10x proteasehemmeren, 12,5 mikroliter av de to mikromolar OG-881 arbeidsløsning og 737,5 mikroliter av type-1 dobbelt destillert vann. Celler lyses i 1x lysisbuffer i nærvær av kjemoproben som binder seg til ethvert fritt KDM1A-protein. For å forberede seg fra vev, bruk en mørtel og pestle som er kjølt på tørris for å pulverisere og homogenisere et en kubikkcentimeter stykke frosset vev.Aliquot vevet i engangs hetteglass, sørg for å overføre ca 40 milligram vev pulver til hvert hetteglass, samtidig unngå tining til enhver tid. Oppbevar prøvene ved 80 grader Celsius til de er klare til å behandle. For å forberede seg fra cellepellets, resuspend pellet av ca 10 millioner celler i 200 mikroliter av 1x celle lysis buffer som inneholder 25 nanomolar OG-881.Vortex hver prøve kort og holde dem på is i fem minutter. Bruk en sonicator til å sonikere prøvene med tre pulser på 45 kilohertz som varer i 20 sekunder hver. Plasser prøvene på is i 20 sekunder mellom pulser.Oppbevar prøvene på is i ytterligere fem minutter. Deretter, vortex kort og sentrifuge prøvene på 14,000 ganger G i 10 minutter i en sentrifuge som er pre-kjølt ved fire grader Celsius. Ved hjelp av en ett milliliter mikropipet overføre hver supernatant til en separat 1,5 milliliter mikrocentrifuge rør.La rørene stå på is i to timer før behandling. Deretter kvantifiserer du det opprinnelige proteinet ved hjelp av Bradford-analysen som beskrevet i tekstprotokollen. En total plate er belagt med anti-KDM1A antistoff.Fri plate er belagt med streptavidin. Cellelylat legges deretter til begge platene og KDM1A-komplekset fanges direkte eller gjennom kjemoproben. Plater vaskes og inkuberes med anti-KDM1A deteksjonsantistoffet og et sekundært antistoff kombinert med pepperrotperoksidase.Til slutt legges selvlysende substrat til og signalgenereres. For totalt KDM1A ELISA, klargjør 10 milliliter KDM1A-opptaksantistoff i PBS til en endelig konsentrasjon på to mikrogram per milliliter for hver plate. Overfør 100 mikroliter til hver brønn av platen.For gratis KDM1A ELISA, klargjør 10 milliliter streptavidin i PBS som en konsentrasjon på 10 mikrogram per milliliter for hver plate. Overfør 100 mikroliter til hver brønn av platen. Deretter topp forsegle hver plate med selvklebende film og inkubere over natten på fire grader Celsius.Neste dag, fjern platene fra kjøleskapet og la dem likevekt ved romtemperatur i ca 45 minutter. Vask hver plate tre ganger med vaskebuffer, og pass på å trykke på platen på papirhåndklær etter hvert vasketrinn for å fjerne eventuelle rester. Tilsett 200 mikroliter blokkerer buffer til hver brønn av begge platene.Topp forsegle platene med selvklebende film og inkubere ved romtemperatur i to timer. I mellomtiden fortynner de tidligere oppnådde innfødte proteinekstraktene med PBS til riktig konsentrasjon og legger ut platen for å forberede en standardkurve ved hjelp av menneskelig rKDM1A som beskrevet i tekstprotokollen. Når den to timer lange inkubasjonen er fullført, kast blokkeringsbufferen og vask platene med vaskebuffer, og pass på å trykke på platen på papirhåndklær etter hvert vasketrinn for å fjerne eventuelle rester.Overfør de riktige fortynnede prøvene til en nedkjølt 96 dypbrønnlagringsblokk etter platedistribusjonen som ble funnet i tabell to av tekstprotokollen. Hold denne blokken på is mens du pipetter 100 mikroliter per brønn inn i de totale og gratis ELISA-platene etter platefordelingen som finnes i tabell tre av tekstprotokollen. Inkuber ved romtemperatur i en time, kast deretter prøvene og vask platene fem ganger med vaskebuffer.Forbered 20 milliliter kaninanti-KDM1A deteksjonsantistoff i blokkeringsbufferen med en konsentrasjon på 0,125 mikrogram per milliliter. Tilsett 100 mikroliter av deteksjonsantistoffløsningen til hver brønn av begge platene, bortsett fra de som tilsvarer de negative kontrollene. Topp forsegle platene med selvklebende film og inkubere ved romtemperatur i en time.Etter dette, kast deteksjonsantistoffoppløsningen og vask platene seks ganger med vaskebuffer. Forbered 25 milliliter sekundært geitantikaninantistoff, HRP, til en fortynning av en til 5000 i blokkeringsbuffer. Tilsett 100 mikroliter av den sekundære antistoffløsningen til hver brønn av mikrotiterplatene og inkuber ved romtemperatur i en time.30 minutter før slutten av denne inkubasjonen, bland like deler av luminolforsterkningen og peroksidoppløsningen i en gul flaske under myke lysforhold. La denne blandingen stå ved romtemperatur. Når en times inkubasjon er fullført, kast den sekundære antistoffoppløsningen og vask platene seks ganger med vaskebuffer.Deretter pipet 100 mikroliter av luminol arbeidsløsning til hver brønn av platene, og sørg for å pipet veldig sakte for å unngå bobledannelse. Bruk en timer til å kontrollere tiden mellom tilsetning av løsningen og luminescence måling av platene og holde denne gangen konstant for å oppnå en god inter-analyse reproduserbarhet. Topp forsegle platene med selvklebende film og sentrifuge ved 500 ganger G og ved romtemperatur i 45 sekunder for å eliminere eventuelle gjenværende bobler.Inkuber platene på en plateshaker ved 100 o/min i ett minutt. Deretter fjerner du klebefilmen og setter platen inn i en mikroplateleser og lar den stå i tre minutter for å stabilisere temperaturen ved 25 grader Celsius. Les de relative luminescenceenhetene for hver ELISA-plateanalyse.Lagre og kopier rå RLU-verdiene fra rådataregnearkfilene for videre analyse. I denne studien brukes en ny KDM1A kjemoprobefangstbasert ELISA til å måle KDM1A-målengasjement direkte i celler og vevsprøver. RLU-verdiene for total og fri rKDM1A vurderes for å bekrefte lineariteten.RLU-verdiene av total og gratis KDM1A som oppdages i menneskelige PBMCer fra tre uavhengige frivillige, legges deretter over standardkurven. AML-celler dyrkes etter leverandøranbefalinger og behandles enten med kjøretøy eller ORY-1001 ved ulike konsentrasjoner. Det opprinnelige proteinekstraktet oppnås i nærvær av 25 millimolar OG-881 kjemoprobe og 0,5 mikrogram totalt protein brukes til å utføre målengasjementets analyse.Total og gratis KDM1A bestemmes deretter, og prosentandelene av målengasjementet til ORY-1001 til KDM1A beregnes i forhold til kjøretøyet. Den doseresponsive KDM1A-målengasjementet i PBMCer og ved lungebehandling av rotter med ORY-1001 ved oral gavage, beregnet i forhold til kjøretøygruppen er vist her. Den ex vivo inkubasjonen med 25 nanomolar ORY-1001 av lungeproteinekstrakter fra de kjøretøybehandlede dyrene, gir full TE, ennå, men øker ikke TE i prøver fra rotter behandlet i fire dager med 30 mikrogram per kilo ORY-1001, noe som bekrefter at KDM1A allerede var fullt hemmet i vivo.Denne protokollen vurderer KDM1A-målengasjement ved å måle gratis og total KDM1A. Husk at det krever innfødt proteinekstraksjon. Denne teknikken kan brukes på prøver fra forskjellige arter for å vurdere en bestemt hemmer, også for å screene for nye inhibitorer.Kjemoproben som brukes i denne studien kan også brukes til kjemoproteomics for å studere KDM1A interactum. Husk å arbeide trygt og respekt til enhver tid forebyggende tiltak ved håndtering av biologiske prøver og bioaktive forbindelser som KDM1A-hemmer.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Covalent Binding of Antibodies to Cellulose Paper Discs and Their Applications in Naked-eye Colorimetric Immunoassays

Kovalent Binding av antistoffer til cellulosepapir plater og deres applikasjoner i Naked-eye Kolorimetriske Immunoassays

This report presents two methods for the covalent immobilization of capture antibodies on cellulose filter paper grade No. 1 (medium-flow filter paper) ...

Measurement of Basal and Forskolin-stimulated Lipolysis in Inguinal Adipose Fat Pads

Måling av basal og forskolinstimulert lipolyse i fettputer

Lipolysis is a process by which the lipid stored as triglycerides in adipose tissues are hydrolyzed into glycerol and fatty acids. This article describes ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

Bruker en omfattende Immunoprecipitation berikelse System for å identifisere en endogen post-translasjonell modifikasjon profil for målet proteiner

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Simultaneous Measurement of Superoxide/Hydrogen Peroxide and NADH Production by Flavin-containing Mitochondrial Dehydrogenases

Samtidig måling av Superoxide/Hydrogen Peroxide og NADH produksjon av Flavin inneholder mitokondrie Dehydrogenases

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include ...

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

Måling av mitokondrie oksygenforbruk i Permeabilized fiber av Drosophila med minimale mengder vev

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

A Direct Force Probe for Measuring Mechanical Integration Between the Nucleus and the Cytoskeleton

En direkte Force Probe for å måle mekanisk integrasjon mellom kjernen og Cytoskeleton

The mechanical properties of the nucleus determine its response to mechanical forces generated in cells. Because the nucleus is molecularly continuous ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Bruke høyt innhold å kvantifisere målet engasjement i tilhenger celler

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Høy følsomhet måling av transkripsjon faktor-DNA Binding slektskap av konkurransedyktige titrering bruker fluorescens mikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Cortisol Measurement in Koala (Phascolarctos cinereus) Fur

Cortisol Measurement in Koala Phascolarctos cinereus Fur

Kortisol måling i Koala (Phascolarctos cinereus) fur

Optimal methods of hormone extraction used to measure stress in animals across sample types are not always the same. Australia&#39;s iconic marsupial ...

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability DARTS assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

En semi-kvantitativ narkotika affinitet responsiv Target stabilitet (dart)-analysen for å studere Rapamycin/mTOR interaksjon

Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) is a robust method for detection of novel small molecule protein targets. It can be used to verify known ...