Name: direct measurement of kdm1a target engagement using chemoprobe-based immunoassays
Uploaded: 2019-06-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Measurement of KDM1A Target Engagement Using Chemoprobe-based Immunoassays at JoVE.com

Это исследование было профинансировано Oryzon Genomics. S.A., Hoffman-La Roche, и частично поддерживается CIIP-20152001 и RETOS программы сотрудничества RTC-2015-3332-1.

Образцы крови были получены из Института investigacion Biom'dica Sant Pau Biobank в соответствии с испанским законодательством (Real Decreto de Biobancos 1716/2011) и одобрения местных комитетов по этике. Исследования с тканями животных проводились в соответствии с институциональными руководящими принципами по у...

<ol>
	<li>Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+demethylation+mediated+by+the+nuclear+amine+oxidase+homolog+LSD1.">Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1.</a> Cell. 119 (7), 941-953 (2004).</li><li>Maiques-Diaz, A., Somervaille, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LSD1:+biologic+roles+and+therapeutic+targeting.">LSD1: biologic roles and therapeutic targeting.</a> Epigenomics. 8 (8), 1103-1116 (2016).</li><li>Maes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORY-1001,+a+Potent+and+Selective+Covalent+KDM1A+Inhibitor,+for+the+Treatment+of+Acute+Leukemia.">ORY-1001, a Potent and Selective Covalent KDM1A Inhibitor, for the Treatment of Acute Leukemia.</a> Cancer Cell. 33 (3), 495-511 (2018).</li><li>Sugino, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+LSD1+inhibitor+NCD38+ameliorates+MDS-related+leukemia+with+complex+karyotype+by+attenuating+leukemia+programs+via+activating+super-enhancers.">A novel LSD1 inhibitor NCD38 ameliorates MDS-related leukemia with complex karyotype by attenuating leukemia programs via activating super-enhancers.</a> Leukemia. 31 (11), 2303-2314 (2017).</li><li>Kleppe, M., Shank, K., Efthymia, P., Riehnhoff, H., Levine, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysine-Specific+Histone+Demethylase,+LSD1,+(KDM1A)+As+a+Novel+Therapeutic+Target+in+Myeloproliferative+Neoplasms.">Lysine-Specific Histone Demethylase, LSD1, (KDM1A) As a Novel Therapeutic Target in Myeloproliferative Neoplasms.</a> Blood. 126, 601 (2015).</li><li>Jutzi, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LSD1+Inhibition+Prolongs+Survival+in+Mouse+Models+of+MPN+by+Selectively+Targeting+the+Disease+Clone.">LSD1 Inhibition Prolongs Survival in Mouse Models of MPN by Selectively Targeting the Disease Clone.</a> HemaSphere. 2 (3), 54 (2018).</li><li>Mohammad, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Hypomethylation+Signature+Predicts+Antitumor+Activity+of+LSD1+Inhibitors+in+SCLC.">DNA Hypomethylation Signature Predicts Antitumor Activity of LSD1 Inhibitors in SCLC.</a> Cancer Cell. 28 (1), 57-69 (2015).</li><li>Rivers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RN-1,+a+potent+and+selective+lysine-specific+demethylase+1+inhibitor,+increases+&#947;-globin+expression,+F+reticulocytes,+and+F+cells+in+a+sickle+cell+disease+mouse+model.">RN-1, a potent and selective lysine-specific demethylase 1 inhibitor, increases &#947;-globin expression, F reticulocytes, and F cells in a sickle cell disease mouse model.</a> Experimental Hematology. 43 (7), 546-553 (2015).</li><li>Rivers, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+administration+of+the+LSD1+inhibitor+ORY-3001+increases+fetal+hemoglobin+in+sickle+cell+mice+and+baboons.">Oral administration of the LSD1 inhibitor ORY-3001 increases fetal hemoglobin in sickle cell mice and baboons.</a> Experimental Hematology. 67, 60-64 (2018).</li><li>Buesa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dual+LSD1/MAO-B+inhibitor+ORY-2001+prevents+the+development+of+the+memory+deficit+in+samp8+mice+through+induction+of+neuronal+plasticity+and+reduction+of+neuroinflammation.">The dual LSD1/MAO-B inhibitor ORY-2001 prevents the development of the memory deficit in samp8 mice through induction of neuronal plasticity and reduction of neuroinflammation.</a> Alzheimer&#8217;s &amp; Dementia. 11 (7), P905 (2015).</li><li>Schmidt, D. M., McCafferty, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-2-Phenylcyclopropylamine+is+a+mechanism-based+inactivator+of+the+histone+demethylase+LSD1.">Trans-2-Phenylcyclopropylamine is a mechanism-based inactivator of the histone demethylase LSD1.</a> Biochemistry. 46 (14), 4408-4416 (2007).</li><li>Forneris, F., Binda, C., Vanoni, M. A., Battaglioli, E., Mattevi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+histone+demethylase+LSD1+reads+the+histone+code.">Human histone demethylase LSD1 reads the histone code.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41360-41365 (2005).</li><li>Gonz#225;lez, E. C., Maes, T., Crusat, C. M., Mu#241;oz, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oryzon+Genomics,+Methods+to+determine+kdm1a+target+engagement+and+chemoprobes+useful+therefor.">Oryzon Genomics, Methods to determine kdm1a target engagement and chemoprobes useful therefor.</a> , (2016).</li><li>Mascaró, C., Ortega, A., Carceller, E., Rruiz Rodriguez, R., Cicero, F., Lunardi, S., Yu, L., Hilbert, M., Maes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoprobe-based+assays+of+histone+lysine+demethylase+1A+target+occupation+enable+in+vivo+pharmacokinetics+and+-dynamics+studies+of+KDM1A+inhibitors.">Chemoprobe-based assays of histone lysine demethylase 1A target occupation enable in vivo pharmacokinetics and -dynamics studies of KDM1A inhibitors.</a> Journal of Biological Chemistry. , (2019).</li><li>Rodriguez-Suarez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Homogeneous+Nonradioactive+Methyltransferase+and+Demethylase+Assays+Targeting+Histone+H3+Lysine+4.">Development of Homogeneous Nonradioactive Methyltransferase and Demethylase Assays Targeting Histone H3 Lysine 4.</a> Journal of Biomolecular Screening. 17 (1), 49-58 (2011).</li><li>Lynch, J. T., Cockerill, M. J., Hitchin, J. R., Wiseman, D. H., Somervaille, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD86+expression+as+a+surrogate+cellular+biomarker+for+pharmacological+inhibition+of+the+histone+demethylase+lysine-specific+demethylase+1.">CD86 expression as a surrogate cellular biomarker for pharmacological inhibition of the histone demethylase lysine-specific demethylase 1.</a> Analytical Biochemistry. 442 (1), 104-106 (2013).</li><li>Schulz-Fincke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-activity+studies+on+N-Substituted+tranylcypromine+derivatives+lead+to+selective+inhibitors+of+lysine+specific+demethylase+1+(LSD1)+and+potent+inducers+of+leukemic+cell+differentiation.">Structure-activity studies on N-Substituted tranylcypromine derivatives lead to selective inhibitors of lysine specific demethylase 1 (LSD1) and potent inducers of leukemic cell differentiation.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 144, 52-67 (2018).</li><li>Ishii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CETSA+quantitatively+verifies+in+vivo+target+engagement+of+novel+RIPK1+inhibitors+in+various+biospecimens.">CETSA quantitatively verifies in vivo target engagement of novel RIPK1 inhibitors in various biospecimens.</a> Scientific Report. 7, 13000 (2017).</li><li>Maes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORY-2001:+An+Epigenetic+drug+for+the+treatment+of+cognition+defects+in+Alzheimer&#8217;s+disease+and+other+neurodegenerative+disorders.">ORY-2001: An Epigenetic drug for the treatment of cognition defects in Alzheimer&#8217;s disease and other neurodegenerative disorders.</a> Alzheimer&#8217;s &amp; Dementia. 12 (7), P1192 (2017).</li></ol>

Представленный здесь протокол был разработан для непосредственного измерения целевого взаимодействия KDM1A с помощью нового хемозонда KDM1A, основанного на ELISA. Метод был проверен на культивированных человеческих клеточных линий и ex vivo образцов из человека, крысы и мыши и бабуина (в том чи?...

Лизин специфическая деметилаза 1 (KDM1A)1 является деметилазой, участвующих в контроле транскрипции генов. Этот белок стал кандидатом фармакологических целевой2 в онкологии; в том числе острый миелоидный лейкоз3 (AML), Синдром миелодисплазии (MDS)4, миелофиброз (MF)5,6, Малый рак легких (SCLC)7; при серповидно-клеточной болезни (SCD)8,9, и при заболеваниях центральной нервной системы, включая болезнь Альцгеймера (Ад), рассеянный склероз (Ms); и в агрессии10.
Большинство ингибирующих соединений KDM1A в клиническом развитии являются производными циклопропиламина и ингибируют белок ковалентным связыванием с его лавина аденин динуклеотид (FAD) кофактор11. Ингибирование KDM1A вызывает изменения экспрессии генов, но эти изменения сильно различаются по тканям, типам клеток или случаям заболевания. Ингибиция KDM1A также изменяет признаки гистона12, но эти изменения, как правило, производятся локально на определенном участке в геноме, и снова, высоко ткани и клеток конкретных.
Протокол был разработан для непосредственного измерения целевого участия KDM1A в биологических образцах и был оптимизирован для использования с ингибиторами производных циклопропиламина. Анализ основан на технологии ELISA и анализирует, параллельно, Total и Free (т.е. не связанный ингибитором) KDM1A в родном белковом экстракте из биологического образца в твердой фазе анализа. В качестве первого шага, биологический образец лизируется в присутствии биотинилапопром KDM1A селективного хемозонда OG-88113,14, полученных из селективного ингибитора KDM1A ORY-1001 (iadademstat), мощный ингибитор KDM1A в клинических развитие для лечения онкологических заболеваний. Химиозонд имеет IC50 для KDM1A 120 нм и включает в себя ФАД связывающий муаети, связанный с биотинилатированным полиэтиленовым гликолем (PEG).-хвост. Химиозонд исключительно связывается с свободным KDM1A, но не с ингибитором KDM1A в образце. После привязки хемозонда, KDM1A, содержащие комплексы в образце, фиксируются на микротитерных пластинах с стрептавидиновой поверхностью с покрытием для определения свободного KDM1A, или на пластинах, покрытых моноклональным анти-KDM1A захвата антитела для определения общего KDM1A. После мытья, обе пластины инкубируются антителами обнаружения к KDM1A, промывают снова и инкубируются вторичным HRP-конъюгированным антикроликом IgG антитела для обнаружения с помощью люминесцентного субстрата и количественной оценки путем измерения относительного световые единицы (RLU) в люминометре(рисунок 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59390/59390fig1.jpg"> Рисунок 1. Схема ELISA Enzyme связана химиозонд иммуноабсорбент анализа для KDM1A целевого участия: A) Определение общего KDM1A с использованием бутерброда ELISA и B) Определение бесплатного KDM1A с использованием химиозонда ELISA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59390/59390fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
Стандартная кривая включена в обе пластины ELISA для проверки линейности каждого анализа. Определение целевого участия KDM1A в каждой выборке затем рассчитывается как относительная стоимость предварительной дозы или образца, обработанного транспортным средством.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0,05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 X Protease Inhibitor Tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>#11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep well storage block</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#734-1679</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well ELISA plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>#436110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive black Film</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>#6050173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive transparent Film</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#60941-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated KDM1A probe OG-881</td>
			<td>Oryzon Genomics S.A.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># 3117057001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#23208)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Protein Assay</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>#500-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lysis buffer 10X</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#9803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for 96- well plates</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>Rotina 420R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full length, enzymatically active human Recombinant LSD1 / KDM1A</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>#31426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 5 Project</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol-Enhacer and Peroxide Solution (Chemiluminescent Substrate)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#37074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader Infinite 200-Tecan</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Infinite 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal capture antibody Anti-KDM1A (N-terminal epitope)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>#ab53269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle G18 gauge blunt</td>
			<td>BD</td>
			<td>#303129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORY-1001 (iadademstat)</td>
			<td>Oryzon Genomics S.A.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBMC separation tubes 10 ml</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>#163288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBMC separation tubes 50 ml</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>#227288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate shaker</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td>Rotamax 120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal detection antibody Anti-KDM1A (C-terminal epitope)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#672184BF-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody Peroxidase-conjugated Donkey Anti-rabbit IgG</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#31458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer cuvette 1.5</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>#302100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer for cuvette</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GeneQuant 1300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>#Z704A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>#303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 1 ultrapure water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Milli-Q Advantage A10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner</td>
			<td>VWR</td>
			<td>USC200T</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct measurement of kdm1a target engagement using chemoprobe-based immunoassays

Оценка целевого взаимодействия, определяемого как взаимодействие препарата с разработанным для него белком, является основным требованием для интерпретации биологической активности любого соединения при разработке лекарств или в фундаментальных исследовательских проектах. В эпигенетике целевое взаимодействие чаще всего оценивается путем анализа прокси-маркеров вместо измерения соединения с целью. Ниже по течению биологических считывания, которые были проанализированы включают гистон знак модуляции или изменения экспрессии генов. KDM1A является лизин деметилаза, которая удаляет метиловые группы из моно- и диметилированного H3K4, модификация, связанная с глушинием экспрессии генов. Модуляция прокси-маркеров зависит от типа клеток и функции генетического состава исследуемых клеток, что может сделать интерпретацию и сравнение кросс-кейса довольно трудным. Для обхода этих проблем представлен универсальный протокол для оценки эффектов дози и динамики прямого целевого взаимодействия КДМ1А. Анализ описано использует KDM1A хемозонд для захвата и количественно раскованный фермент, может быть широко применяется к клеткам или образцам тканей без необходимости генетической модификации, имеет отличное окно обнаружения, и может быть использован как для фундаментальных исследований и анализ клинических образцов.

Линейность определения Total и Free KDM1A.
Стандартная серия была подготовлена, как описано в шаге 5.3.2., используя от 0 до 2500 пг полнометражного человеческого рекомбинантного фермента KDM1A. Значения RLU Total и Free rKDM1A были оценены для провер...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Measurement of KDM1A Target Engagement Using Chemoprobe-based Immunoassays at JoVE.com

Direct Measurement of KDM1A Target Engagement Using Chemoprobe-based Immunoassays

Прямое измерение целевого взаимодействия KDM1A с использованием иммуноанализов на основе хемозондов

Здесь мы представляем протокол для измерения участия kDM1A в клетках человека или животного, тканях или образцах крови, обработанных ингибиторами KDM1A. Протокол использует хемозонд маркировки свободного фермента KDM1A и прямой количественной оценки целевого занятия с использованием химиозонда на основе иммуноанализов и могут быть использованы в доклинических и клинических исследованиях.

The assessment of the target engagement, defined as the interaction of a drug with the protein it was designed for, is a basic requirement for the ...

Оценка целевого взаимодействия, то есть взаимодействия препарата с белком, для которого он был разработан, является основным требованием для интерпретации биологической активности любого соединения в разработке лекарственных препаратов или в проектах фундаментальных исследований. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет прямо измерять эффект дозы и динамику целевого взаимодействия KDM1A, а не измерения эффектов ниже по течению, таких как следы и экспрессия гистона. Этот метод может быть применен в фундаментальных исследованиях, а также в клинических испытаниях, в онкологических ЦНС или других заболеваний, подлежащих лечению ингибитором KDM1A для изучения фармакодинамики.Этот метод основан на хемопробе, разработанном для изучения ORY-1001, iadademstat, но может быть действительно использован для других ингибиторов KDM1A и стратегия может быть применена к другим целям. Процедура будет продемонстрирована Ракель Руис, менеджер по эксплуатации платформы обнаружения PK/PD из моей лаборатории. Во время клеточной обработки ORY-1001 соединение связывается с белком KDM1A, присутствующим в ядре.Чтобы начать эту процедуру, получить 10 микролитр одноразовый aliquot 20 миллимолярный биотинилированный зонд OG-881 фондовый раствор из холодильника и дайте ему прогреться при комнатной температуре в течение 10 минут. Используя микропайп с фильтром советы, последовательно разбавить фондовый раствор для подготовки двух микромоляных рабочих решений. Затем растворите одну таблетку ингибитора протеазы в одном миллилитре PBS в микроцентрифугной трубке.Для каждого миллилитра желаемого объема буфера лизиса 1x клеток с хемопробом смешайте 100 микролитров коммерческих полученных 10x буфера лизиса клеток, 150 микролитров ингибитора протеазы 10x, 12,5 микролитров двух микромоляных OG-881 рабочего раствора и 737,5 микролитров двойной дистилляции воды типа-1. Клетки лизированы в буфере лизиса 1x в присутствии хемопроба, который связывается с любым свободным белком KDM1A. Чтобы подготовиться из тканей, используйте раствор и пестик, которые охлаждаются на сухом льду, чтобы распылить и гомогенизировать один кубический сантиметр кусок замороженных тканей.Aliquot ткани в одноразовые флаконы, убедившись, что для передачи около 40 миллиграммов порошка ткани в каждый флакон, избегая при этом оттаивания во все времена. Храните образцы при 80 градусах цельсия до готовности к обработке. Чтобы подготовиться к клеточным гранулам, повторно наполнив гранулы примерно 10 миллионов клеток в 200 микролитров буфера лиза 1x клеток, содержащего 25 наномолярных OG-881.Vortex каждый образец кратко и держать их на льду в течение пяти минут. Используя звуковой, sonicate образцы с тремя импульсами на 45 килогерц продолжительностью 20 секунд каждый. Поместите образцы на лед в течение 20 секунд между импульсами.Храните образцы на льду еще пять минут. Затем вихрь кратко и центрифуга образцов на 14000 раз G в течение 10 минут в центрифуге, которая предварительно охлаждается при четырех градусах по Цельсию. С помощью одного миллилитров микропайпера перенесите каждый супернатант в отдельную микроцентрифугную трубку на 1,5 миллилитров.Оставьте трубки на льду на два часа перед обработкой. Затем, количественно родной белок с помощью Bradford анализ, как указано в текстовом протоколе. Общая пластина покрыта антителами против КДМ1А.Бесплатная тарелка покрыта стрептавидином. Сотовый лизат затем добавляется к обеим пластинам и KDM1A комплекс захвачен непосредственно или через chemoprobe. Пластины промывают и инкубируется анти-KDM1A обнаружения антител и вторичного антитела в сочетании с пероксидазом хрена.Наконец, добавляется люминесцентный субстрат и генерируется сигнал. Для общей KDM1A ELISA, подготовить 10 миллилитров KDM1A захвата антитела в PBS к окончательной концентрации двух микрограмм на миллилитр для каждой пластины. Перенесите 100 микролитров в каждый колодец пластины.Бесплатно KDM1A ELISA, подготовить 10 миллилитров стрептавидина в PBS в концентрации 10 микрограмм на миллилитр для каждой пластины. Перенесите 100 микролитров в каждый колодец пластины. Затем, верхняя печать каждой пластины с клейкой пленкой и инкубировать на ночь при четырех градусах по Цельсию.На следующий день, удалить пластины из холодильника и пусть они равноденствия при комнатной температуре в течение примерно 45 минут. Вымойте каждую тарелку три раза с помощью буфера для мытья, убедившись, что нажмите пластину на бумажные полотенца после каждого шага стирки, чтобы удалить любой остаточный раствор. Добавьте 200 микролитров блокирующего буфера к каждой пластине обеих пластин.Сверху запечатывают пластины клейкой пленкой и инкубируют при комнатной температуре в течение двух часов. Между тем, разбавить ранее полученные местные экстракты белка с PBS к соответствующей концентрации и выложить пластину для подготовки стандартной кривой с использованием человека rKDM1A, как указано в текстовом протоколе. После двухчасовой инкубации завершена, отбросить блокирующий буфер и мыть пластины с буфером мытья, убедившись, что нажмите пластину на бумажные полотенца после каждого шага стирки, чтобы удалить любой остаточный раствор.Перенесите соответствующие разбавленные образцы в охлажденный блок хранения 96 глубоких колодец после распределения пластин, найденных в таблице 2 текстового протокола. Держите этот блок на льду в то время как трубопроводы 100 микролитров на колодец в общей и свободной пластины ELISA после распределения пластины найти в таблице три текста протокола. Инкубировать при комнатной температуре в течение одного часа, затем отказаться от образцов и мыть пластины пять раз с мыть буфера.Подготовка 20 миллилитров кролика анти-KDM1A обнаружения антител в блокировании буфера в концентрации 0,125 микрограмм на миллилитр. Добавьте 100 микролитров раствора антител обнаружения к каждой пластине обеих пластин, за исключением тех, которые соответствующи отрицательному контролю. Сверху запечатывают пластины клейкой пленкой и инкубируют при комнатной температуре в течение одного часа.После этого отбросьте раствор антител обнаружения и промыть пластины шесть раз буфером для мытья. Подготовь 25 миллилитров вторичного козьего антиколичного антитела, HRP, к разбавлению от одного до 5 000 в блокирующий буфер. Добавьте 100 микролитров вторичного раствора антител к каждой пластине микротитров и инкубировать при комнатной температуре в течение одного часа.За 30 минут до окончания этой инкубации смешайте равные части усилителя люминола и раствор перекиси в янтарной бутылке в условиях мягкого освещения. Оставьте эту смесь при комнатной температуре. Когда один час инкубации завершена, отказаться от вторичного раствора антитела и мыть пластины шесть раз с мыть буфера.Далее, пипетки 100 микролитров люминола рабочий раствор для каждой колодец пластин, убедившись, что труба очень медленно, чтобы избежать образования пузыря. Используйте таймер, чтобы контролировать время между добавлением раствора и измерением люминесценции пластин и держать это время постоянным для достижения хорошей воспроизводимости между анализами. Топ уплотнения пластин с клейкой пленкой и центрифугой в 500 раз G и при комнатной температуре в течение 45 секунд, чтобы устранить все оставшиеся пузырьки.Инкубировать тарелки на тарелке шейкер при 100 об/мин в течение одной минуты. Затем снимите клейкую пленку и вставьте пластину в считыватель микроплатформ и оставьте ее на три минуты, чтобы стабилизировать температуру при температуре 25 градусов по Цельсию. Прочитайте относительные единицы люминесценции каждого анализа пластины ELISA.Сохранить и скопировать необработанные значения RLU из необработанных файлов электронной таблицы данных для дальнейшего анализа. В этом исследовании, новый KDM1A хемопроб захвата на основе ELISA используется для непосредственного измерения KDM1A целевого взаимодействия в клетках и образцах тканей. Значения RLU общего и бесплатного rKDM1A оцениваются для проверки линейности.Значения RLU общего и бесплатного KDM1A, обнаруженные в человеческих ПКМК от трех независимых добровольцев, затем накладываются на стандартную кривую. Ячейки AML культуриются в соответствии с рекомендациями поставщика и обрабатываются либо транспортным средством, либо ORY-1001 в различных концентрациях. Экстракт родного белка получен в присутствии 25 миллимоляров ОГ-881 хемопроб и 0,5 микрограмма общего белка используется для выполнения анализа целевого взаимодействия.Затем определяются общие и бесплатные KDM1A, и процент целевого участия ORY-1001 в KDM1A рассчитывается по отношению к транспортному средству. Доза-реакции KDM1A целевого участия в ПХМС и в легких лечения крыс с ORY-1001 устные gavage, рассчитывается относительно группы транспортных средств показано здесь. Ex vivo инкубации с 25 наномолярных ORY-1001 экстрактов белка легких из транспортного средства лечение животных, дает полный TE, но не дальнейшее увеличение TE в образцах от крыс, обработанных в течение четырех дней с 30 микрограммов на килограмм ORY-1001, подтверждающие KDM1A уже полностью ингибируется in vivo.В этом протоколе оценивается целевое взаимодействие KDM1A путем измерения свободного и полного KDM1A. Помните, что это требует экстракции родного белка. Этот метод может быть использован на образцах различных видов для оценки конкретного ингибитора, а также для проверки на новые ингибиторы.Хемопроб, используемый в этом исследовании, также может быть применен для химиопротемии для изучения взаимодействия KDM1A. Не забудьте работать безопасно и уважать во все времена профилактические меры при обработке биологических образцов и биологически активных соединений, таких как ингибитор KDM1A.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Covalent Binding of Antibodies to Cellulose Paper Discs and Their Applications in Naked-eye Colorimetric Immunoassays

Ковалентного связывания антител с целлюлозой дисков бумаги и их применение в видимую невооруженным глазом колориметрические иммуноанализа

This report presents two methods for the covalent immobilization of capture antibodies on cellulose filter paper grade No. 1 (medium-flow filter paper) ...

Measurement of Basal and Forskolin-stimulated Lipolysis in Inguinal Adipose Fat Pads

Измерение базального и форсколин-стимулированного липолиза в паховых жировых жировых подушечках

Lipolysis is a process by which the lipid stored as triglycerides in adipose tissues are hydrolyzed into glycerol and fatty acids. This article describes ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

Используя систему обогащения всеобъемлющего иммунопреципитации для определения профиля эндогенных столб-поступательные изменения целевых белков

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Simultaneous Measurement of Superoxide/Hydrogen Peroxide and NADH Production by Flavin-containing Mitochondrial Dehydrogenases

Одновременное измерение супероксид/водорода пероксида и НАДН производства флавинсодержащих митохондриальной дегидрогеназ

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include ...

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

Измерение потребления кислорода митохондрий в Permeabilized волокнах дрозофилы, используя минимальное количество ткани

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

A Direct Force Probe for Measuring Mechanical Integration Between the Nucleus and the Cytoskeleton

Прямое действие зонд для измерения механических интеграции между ядром и Цитоскелет

The mechanical properties of the nucleus determine its response to mechanical forces generated in cells. Because the nucleus is molecularly continuous ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Используя высокое содержание Imaging для количественного определения целевых участия в адэрентных клеток

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Высокая чувствительность измерение транскрипции фактор ДНК привязки родство по конкурентоспособным титрования, с помощью микроскопии флуоресцирования

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Cortisol Measurement in Koala (Phascolarctos cinereus) Fur

Cortisol Measurement in Koala Phascolarctos cinereus Fur

Кортизол Измерение в Коала (Phascolarctos cinereus) Мех

Optimal methods of hormone extraction used to measure stress in animals across sample types are not always the same. Australia&#39;s iconic marsupial ...

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability DARTS assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

Полуколичественный препарат affinity Ответственный Целевой стабильности (DARTS) спросить для изучения Rapamycin / mTOR взаимодействия

Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) is a robust method for detection of novel small molecule protein targets. It can be used to verify known ...