Name: direct measurement of kdm1a target engagement using chemoprobe-based immunoassays
Uploaded: 2019-06-13T13:00:00
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Este estudio fue financiado por Oryzon Genomics. S.A., Hoffman-La Roche, y parcialmente apoyado por el CIIP-20152001 y el programa de colaboración RETOS RTC-2015-3332-1.

Se obtuvieron muestras de sangre del Instituto de Investigación Biomédica Sant Pau Biobank de acuerdo con la legislación española (Real Decreto de Biobancos 1716/2011) y la aprobación de los comités de ética local. Los estudios con tejidos animales se realizaron de conformidad con las directrices institucionales para el cuidado y uso de animales de laboratorio (Directiva 86/609/CEE del Consejo de las Comunidades Europeas) establecidas por el Comité ético para la experimentación animal en el PRAAL-PCB.<...

<ol>
	<li>Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+demethylation+mediated+by+the+nuclear+amine+oxidase+homolog+LSD1.">Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1.</a> Cell. 119 (7), 941-953 (2004).</li><li>Maiques-Diaz, A., Somervaille, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LSD1:+biologic+roles+and+therapeutic+targeting.">LSD1: biologic roles and therapeutic targeting.</a> Epigenomics. 8 (8), 1103-1116 (2016).</li><li>Maes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORY-1001,+a+Potent+and+Selective+Covalent+KDM1A+Inhibitor,+for+the+Treatment+of+Acute+Leukemia.">ORY-1001, a Potent and Selective Covalent KDM1A Inhibitor, for the Treatment of Acute Leukemia.</a> Cancer Cell. 33 (3), 495-511 (2018).</li><li>Sugino, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+LSD1+inhibitor+NCD38+ameliorates+MDS-related+leukemia+with+complex+karyotype+by+attenuating+leukemia+programs+via+activating+super-enhancers.">A novel LSD1 inhibitor NCD38 ameliorates MDS-related leukemia with complex karyotype by attenuating leukemia programs via activating super-enhancers.</a> Leukemia. 31 (11), 2303-2314 (2017).</li><li>Kleppe, M., Shank, K., Efthymia, P., Riehnhoff, H., Levine, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysine-Specific+Histone+Demethylase,+LSD1,+(KDM1A)+As+a+Novel+Therapeutic+Target+in+Myeloproliferative+Neoplasms.">Lysine-Specific Histone Demethylase, LSD1, (KDM1A) As a Novel Therapeutic Target in Myeloproliferative Neoplasms.</a> Blood. 126, 601 (2015).</li><li>Jutzi, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LSD1+Inhibition+Prolongs+Survival+in+Mouse+Models+of+MPN+by+Selectively+Targeting+the+Disease+Clone.">LSD1 Inhibition Prolongs Survival in Mouse Models of MPN by Selectively Targeting the Disease Clone.</a> HemaSphere. 2 (3), 54 (2018).</li><li>Mohammad, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Hypomethylation+Signature+Predicts+Antitumor+Activity+of+LSD1+Inhibitors+in+SCLC.">DNA Hypomethylation Signature Predicts Antitumor Activity of LSD1 Inhibitors in SCLC.</a> Cancer Cell. 28 (1), 57-69 (2015).</li><li>Rivers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RN-1,+a+potent+and+selective+lysine-specific+demethylase+1+inhibitor,+increases+&#947;-globin+expression,+F+reticulocytes,+and+F+cells+in+a+sickle+cell+disease+mouse+model.">RN-1, a potent and selective lysine-specific demethylase 1 inhibitor, increases &#947;-globin expression, F reticulocytes, and F cells in a sickle cell disease mouse model.</a> Experimental Hematology. 43 (7), 546-553 (2015).</li><li>Rivers, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+administration+of+the+LSD1+inhibitor+ORY-3001+increases+fetal+hemoglobin+in+sickle+cell+mice+and+baboons.">Oral administration of the LSD1 inhibitor ORY-3001 increases fetal hemoglobin in sickle cell mice and baboons.</a> Experimental Hematology. 67, 60-64 (2018).</li><li>Buesa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dual+LSD1/MAO-B+inhibitor+ORY-2001+prevents+the+development+of+the+memory+deficit+in+samp8+mice+through+induction+of+neuronal+plasticity+and+reduction+of+neuroinflammation.">The dual LSD1/MAO-B inhibitor ORY-2001 prevents the development of the memory deficit in samp8 mice through induction of neuronal plasticity and reduction of neuroinflammation.</a> Alzheimer&#8217;s &amp; Dementia. 11 (7), P905 (2015).</li><li>Schmidt, D. M., McCafferty, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-2-Phenylcyclopropylamine+is+a+mechanism-based+inactivator+of+the+histone+demethylase+LSD1.">Trans-2-Phenylcyclopropylamine is a mechanism-based inactivator of the histone demethylase LSD1.</a> Biochemistry. 46 (14), 4408-4416 (2007).</li><li>Forneris, F., Binda, C., Vanoni, M. A., Battaglioli, E., Mattevi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+histone+demethylase+LSD1+reads+the+histone+code.">Human histone demethylase LSD1 reads the histone code.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41360-41365 (2005).</li><li>Gonz#225;lez, E. C., Maes, T., Crusat, C. M., Mu#241;oz, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oryzon+Genomics,+Methods+to+determine+kdm1a+target+engagement+and+chemoprobes+useful+therefor.">Oryzon Genomics, Methods to determine kdm1a target engagement and chemoprobes useful therefor.</a> , (2016).</li><li>Mascaró, C., Ortega, A., Carceller, E., Rruiz Rodriguez, R., Cicero, F., Lunardi, S., Yu, L., Hilbert, M., Maes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoprobe-based+assays+of+histone+lysine+demethylase+1A+target+occupation+enable+in+vivo+pharmacokinetics+and+-dynamics+studies+of+KDM1A+inhibitors.">Chemoprobe-based assays of histone lysine demethylase 1A target occupation enable in vivo pharmacokinetics and -dynamics studies of KDM1A inhibitors.</a> Journal of Biological Chemistry. , (2019).</li><li>Rodriguez-Suarez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Homogeneous+Nonradioactive+Methyltransferase+and+Demethylase+Assays+Targeting+Histone+H3+Lysine+4.">Development of Homogeneous Nonradioactive Methyltransferase and Demethylase Assays Targeting Histone H3 Lysine 4.</a> Journal of Biomolecular Screening. 17 (1), 49-58 (2011).</li><li>Lynch, J. T., Cockerill, M. J., Hitchin, J. R., Wiseman, D. H., Somervaille, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD86+expression+as+a+surrogate+cellular+biomarker+for+pharmacological+inhibition+of+the+histone+demethylase+lysine-specific+demethylase+1.">CD86 expression as a surrogate cellular biomarker for pharmacological inhibition of the histone demethylase lysine-specific demethylase 1.</a> Analytical Biochemistry. 442 (1), 104-106 (2013).</li><li>Schulz-Fincke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-activity+studies+on+N-Substituted+tranylcypromine+derivatives+lead+to+selective+inhibitors+of+lysine+specific+demethylase+1+(LSD1)+and+potent+inducers+of+leukemic+cell+differentiation.">Structure-activity studies on N-Substituted tranylcypromine derivatives lead to selective inhibitors of lysine specific demethylase 1 (LSD1) and potent inducers of leukemic cell differentiation.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 144, 52-67 (2018).</li><li>Ishii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CETSA+quantitatively+verifies+in+vivo+target+engagement+of+novel+RIPK1+inhibitors+in+various+biospecimens.">CETSA quantitatively verifies in vivo target engagement of novel RIPK1 inhibitors in various biospecimens.</a> Scientific Report. 7, 13000 (2017).</li><li>Maes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORY-2001:+An+Epigenetic+drug+for+the+treatment+of+cognition+defects+in+Alzheimer&#8217;s+disease+and+other+neurodegenerative+disorders.">ORY-2001: An Epigenetic drug for the treatment of cognition defects in Alzheimer&#8217;s disease and other neurodegenerative disorders.</a> Alzheimer&#8217;s &amp; Dementia. 12 (7), P1192 (2017).</li></ol>

El protocolo presentado aquí fue desarrollado para medir directamente el compromiso objetivo de KDM1A utilizando una nueva captura de quimiosondas KDM1A basada en ELISA. El método ha sido validado en líneas celulares humanas cultivadas y muestras ex vivo de humanos, ratas y ratones y babuinos (incluyendo PPBCM, pulmón, cerebro, piel, tumores), pero se puede aplicar fácilmente a otras especies en las que los epítopos objetivo de anticuerpos KDM1A y catalíticos centro se conservan. Como OG-881 es una quimiosonda bas...

Lisina específica demetilasa 1 (KDM1A)1 es una demetilasa implicada en el control de la transcripción génica. Esta proteína ha surgido como un objetivo farmacológico candidato2 en oncología; incluyendo Leucemia mieloide aguda3 (LMA), Síndrome de mielodisplasia (MdS)4, Mielofibrosis (MF)5,6, Cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC)7; en la enfermedad de células falciformes (SCD)8,9, y en enfermedades del sistema nervioso central incluyendo la enfermedad de Alzheimer (AD), Esclerosis Múltiple (MS); y en agresión10.
La mayoría de los compuestos inhibidores de KDM1A en el desarrollo clínico son derivados de la ciclopropilina e inhiben la proteína mediante la unión covalente a su conucleótido de adenina de flavina (FAD) cofactor11. La inhibición de KDM1A induce cambios en la expresión génica, pero estos cambios varían enormemente entre tejidos, tipos de células o casos de enfermedad. La inhibición de KDM1A también cambia las marcas de histona12,sin embargo, estos cambios generalmente se producen localmente en un sitio específico en el genoma, y son de nuevo, altamente tejido y específico de las células.
El protocolo fue desarrollado para medir directamente la participación objetivo de KDM1A en muestras biológicas y ha sido optimizado para el uso con inhibidores derivados de la ciclopropilina. El ensayo se basa en la tecnología ELISA y analiza, en paralelo, Total y Libre (es decir, no unido por inhibidor) KDM1A en un extracto de proteína nativa de una muestra biológica en un ensayo de fase sólida. Como primer paso, la muestra biológica se lysed en presencia de la quimiosonda selectiva biotinilada KDM1A OG-88113,14, derivada del inhibidor selectivo KDM1A ORY-1001 (iadademstat), un potente inhibidor de KDM1A en clínica desarrollo para el tratamiento de enfermedades oncológicas. La quimiosonda tiene un IC50 para KDM1A de 120 nM e incluye una mitad de unión FAD vinculada a una cola de polietileno glicol biotinilado (PEG). La quimiosonda se une exclusivamente al KDM1A libre, pero no al KDM1A ligado a inhibidores en la muestra. Después de la unión de quimiosonda, el KDM1A que contiene complejos en la muestra se captura nado en placas microtíteres con superficie recubierta de estreptavidina para determinar KDM1A libre, o en placas recubiertas con un anticuerpo de captura monoclonal anti-KDM1A para determinar el Total de KDM1A. Después del lavado, ambas placas se incuban con un anticuerpo de detección anti-KDM1A, se lavan de nuevo, y se incuban con un anticuerpo secundario anticonejo anticonejo conjugado con conjugado con HRP para su detección utilizando un sustrato luminiscente y la cuantificación midiendo unidades de luz (RLU) en un luminómetro (Figura1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59390/59390fig1.jpg"> Figura 1. Esquema de elsay de inmunoabsorbente de quimiosonda ligada a enzimas ELISA para el compromiso objetivo KDM1A: A) Determinación del Total de KDM1A utilizando el sándwich ELISA y B) Determinación de KDM1A libre utilizando quimiosonda ELISA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59390/59390fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Se incluye una curva estándar en ambas placas ELISA para verificar la linealidad de cada ensayo. La determinación de la participación objetivo de KDM1A en cada muestra se calcula entonces como un valor relativo a la muestra predosis o tratada por el vehículo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0,05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 X Protease Inhibitor Tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>#11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep well storage block</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#734-1679</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well ELISA plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>#436110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive black Film</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>#6050173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive transparent Film</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#60941-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated KDM1A probe OG-881</td>
			<td>Oryzon Genomics S.A.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># 3117057001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#23208)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Protein Assay</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>#500-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lysis buffer 10X</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#9803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for 96- well plates</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>Rotina 420R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full length, enzymatically active human Recombinant LSD1 / KDM1A</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>#31426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 5 Project</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol-Enhacer and Peroxide Solution (Chemiluminescent Substrate)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#37074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader Infinite 200-Tecan</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Infinite 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal capture antibody Anti-KDM1A (N-terminal epitope)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>#ab53269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle G18 gauge blunt</td>
			<td>BD</td>
			<td>#303129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORY-1001 (iadademstat)</td>
			<td>Oryzon Genomics S.A.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBMC separation tubes 10 ml</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>#163288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBMC separation tubes 50 ml</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>#227288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate shaker</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td>Rotamax 120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal detection antibody Anti-KDM1A (C-terminal epitope)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#672184BF-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody Peroxidase-conjugated Donkey Anti-rabbit IgG</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#31458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer cuvette 1.5</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>#302100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer for cuvette</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GeneQuant 1300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>#Z704A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>#303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 1 ultrapure water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Milli-Q Advantage A10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner</td>
			<td>VWR</td>
			<td>USC200T</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct measurement of kdm1a target engagement using chemoprobe-based immunoassays

La evaluación de la participación objetivo, definida como la interacción de un medicamento con la proteína para la que fue diseñado, es un requisito básico para la interpretación de la actividad biológica de cualquier compuesto en el desarrollo de fármacos o en proyectos de investigación básica. En la epigenética, la participación objetivo se evalúa con mayor frecuencia mediante el análisis de marcadores proxy en lugar de medir la unión del compuesto con el objetivo. Las lecturas biológicas aguas abajo que se han analizado incluyen la modulación de la marca de histona o los cambios en la expresión génica. KDM1A es una lisina demetilasa que elimina los grupos metilo de H3K4 mono y dimetilado, una modificación asociada con el silenciamiento de la expresión génica. La modulación de los marcadores proxy depende del tipo de célula y la función de la composición genética de las células investigadas, lo que puede dificultar la interpretación y la comparación entre mayúsculas y minúsculas. Para evitar estos problemas, se presenta un protocolo versátil para evaluar los efectos de la dosis y la dinámica de la participación directa de la meta de KDM1A. El ensayo descrito hace uso de una quimiosonda KDM1A para capturar y cuantificar enzimas desinhibidas, se puede aplicar ampliamente a células o muestras de tejido sin necesidad de modificación genética, tiene una excelente ventana de detección, y se puede utilizar tanto para la investigación básica y análisis de muestras clínicas.

La linealidad de la determinación Total y Libre de KDM1A.
Se preparó una serie estándar como se describe en el paso 5.3.2., utilizando 0 a 2500 pg de enzima KDM1A recombinante humana de longitud completa. Los valores RLU de Total y Free rKDM1A se evaluaron para verificar la linealidad (Figura2A y 2B). Los datos se representan como media de 3 experimentos con 3 r?...

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Direct Measurement of KDM1A Target Engagement Using Chemoprobe-based Immunoassays

Medición directa del compromiso objetivo de KDM1A mediante inmunoensayos basados en chemoprobe

Aquí, presentamos un protocolo para medir el compromiso objetivo de KDM1A en una célula humana o animal, muestras de tejido o sangre tratadas con inhibidores de KDM1A. El protocolo emplea el etiquetado quimioprobe de la enzima KDM1A libre y la cuantificación directa de la ocupación objetivo mediante inmunoensayos basados en quimiosondas y se puede utilizar en estudios preclínicos y clínicos.

The assessment of the target engagement, defined as the interaction of a drug with the protein it was designed for, is a basic requirement for the ...

La evaluación del compromiso objetivo, es decir, la interacción de un medicamento con la proteína para la que fue diseñado, es un requisito básico para la interpretación de la actividad biológica de cualquier compuesto en el desarrollo de fármacos, o en proyectos de investigación básica. La principal ventaja de esta técnica es que permite la medición directa del efecto de la dosis y la dinámica del compromiso objetivo de KDM1A, en lugar de mediciones de efectos posteriores como las marcas de histonas y la expresión. Esta técnica se puede aplicar en la investigación básica y también en ensayos clínicos, en EL SNC oncológico u otras enfermedades sujetas al tratamiento con inhibidor de KDM1A para estudiar la farmacodinámica.Esta técnica se basa en una quimioprobeba desarrollada para estudiar ORY-1001, iadademstat, pero se puede utilizar realmente para otros inhibidores de KDM1A y la estrategia se puede aplicar a otros objetivos. El procedimiento lo demostrará Raquel Ruiz, gerente de operaciones de la plataforma de descubrimiento PK/PD de mi laboratorio. Durante el tratamiento celular con ORY-1001 el compuesto se une a la proteína KDM1A presente en el núcleo.Para comenzar este procedimiento, recupere de la nevera una alícuota de un solo uso de 10 microlitrolitios de 20 sondas biotiniladas mililitros de solución en stock y deje que se caliente a temperatura ambiente durante 10 minutos. Usando un micropipet con puntas de filtro, diluya en serie la solución de stock para preparar las dos soluciones de trabajo micromolares. A continuación, disolver un comprimido de inhibidor de la proteasa en un mililitro de PBS en un tubo de microcentrífuga.Para cada mililitro del volumen deseado de tampón de lisis de 1 celda con la quimioprobeda, mezclar 100 microlitros de tampón de lisis de 10 células obtenido comercialmente, 150 microlitros del inhibidor de 10x proteasa, 12,5 microlitros de las dos micromolares OG-881 y 737,5 microlitros de agua doble destilada tipo 1. Las células se lisan en tampón de lisis 1x en presencia de la quimioprobada que se une a cualquier proteína KDM1A libre. Para prepararlos a partir de tejidos, utilice un mortero y un mortero que se enfríen sobre hielo seco para pulverizar y homogeneizar un pedazo de tejido congelado de un centímetro cúbico.Aliquot el tejido en viales de un solo uso, asegurándose de transferir aproximadamente 40 miligramos de polvo de tejido en cada vial, evitando la descongelación en todo momento. Almacene las muestras a 80 grados centígrados hasta que estén listas para procesarse. Para preparar a partir de pellets celulares, resuspendir el pellet de aproximadamente 10 millones de células en 200 microlitros de tampón de 1x lisis celular que contiene 25 nanomolarES OG-881.Vórtice cada muestra brevemente y mantenerlos en hielo durante cinco minutos. Usando un sonicador, sonicar las muestras con tres pulsos a 45 kilohercios que duran 20 segundos cada uno. Coloque las muestras sobre hielo durante 20 segundos entre pulsos.Mantenga las muestras en hielo durante cinco minutos adicionales. Luego, el vórtice se retuerza brevemente y centrifuga las muestras a 14.000 veces G durante 10 minutos en una centrífuga que se enfría antes de los cuatro grados centígrados. Usando un micropipet de un mililitro transfiera cada sobrenadante en un tubo de microcentrífuga separado de 1,5 mililitros.Deje los tubos sobre hielo durante dos horas antes del procesamiento. A continuación, cuantifique la proteína nativa utilizando el ensayo de Bradford como se describe en el protocolo de texto. Una placa total está recubierta con anticuerpos anti-KDM1A.La placa libre está recubierta con estreptavidina. El linsado celular se agrega a ambas placas y el complejo KDM1A se captura directamente o a través de la quimioprobada. Las placas se lavan e incuban con el anticuerpo de detección anti-KDM1A y un anticuerpo secundario acoplado a la peroxidasa de rábano picante.Finalmente, se añade sustrato luminiscente y se genera la señal. Para el ELISA total de KDM1A, prepare 10 mililitros de anticuerpos de captura KDM1A en PBS a una concentración final de dos microgramos por mililitro para cada placa. Transfiera 100 microlitros a cada pozo de la placa.Para KDM1A ELISA libre, preparar 10 mililitros de estreptavidina en PBS como una concentración de 10 microgramos por mililitro para cada placa. Transfiera 100 microlitros a cada pozo de la placa. A continuación, selle la parte superior de cada placa con película adhesiva e incubar durante la noche a cuatro grados centígrados.Al día siguiente, retire las placas del refrigerador y deje que se equilibren a temperatura ambiente durante aproximadamente 45 minutos. Lave cada plato tres veces con tampón de lavado, asegurándose de tocar la placa en toallas de papel después de cada paso de lavado para eliminar cualquier solución residual. Agregue 200 microlitros de tampón de bloqueo a cada pozo de ambas placas.Enscinda las placas con película adhesiva e incubar a temperatura ambiente durante dos horas. Mientras tanto, diluir los extractos de proteína nativa previamente obtenidos con PBS a la concentración adecuada y establecer la placa para preparar una curva estándar utilizando rKDM1A humana como se describe en el protocolo de texto. Una vez completada la incubación de dos horas, deseche el tampón de bloqueo y lave las placas con tampón de lavado, asegurándose de tocar la placa en toallas de papel después de cada paso de lavado para eliminar cualquier solución residual.Transfiera las muestras diluidas apropiadas a un bloque de almacenamiento de pozos refrigerados de 96 aguas profundas siguiendo la distribución de la placa que se encuentra en la tabla dos del protocolo de texto. Mantenga este bloque sobre hielo mientras pipetea 100 microlitros por pozo en las placas ELISA totales y libres siguiendo la distribución de la placa que se encuentra en la tabla tres del protocolo de texto. Incubar a temperatura ambiente durante una hora, luego desechar las muestras y lavar las placas cinco veces con tampón de lavado.Preparar 20 mililitros de anticuerpos anti-KDM1A de conejo en el tampón de bloqueo a una concentración de 0,125 microgramos por mililitro. Añadir 100 microlitros de la solución de anticuerpos de detección a cada pozo de ambas placas, excepto las correspondientes a los controles negativos. Enscinda las placas con película adhesiva e incubar a temperatura ambiente durante una hora.Después de esto, deseche la solución de anticuerpos de detección y lave las placas seis veces con el tampón de lavado. Preparar 25 mililitros de anticuerpos anti-conejo de cabra secundario, HRP, a una dilución de uno a 5.000 en tampón de bloqueo. Añadir 100 microlitros de la solución de anticuerpos secundarios a cada pozo de las placas de microtíter e incubar a temperatura ambiente durante una hora.30 minutos antes del final de esta incubación, mezclar partes iguales de potenciador de luminol y solución de peróxido en una botella de ámbar en condiciones de luz suave. Deje esta mezcla a temperatura ambiente. Cuando se complete la incubación de una hora, deseche la solución de anticuerpos secundaria y lave las placas seis veces con el tampón de lavado.A continuación, pipetear 100 microlitros de la solución de trabajo luminol a cada pozo de las placas, asegurándose de pipetear muy lentamente para evitar la formación de burbujas. Utilice un temporizador para controlar el tiempo entre la adición de la solución y la medición de luminiscencia de las placas y mantener este tiempo constante para lograr una buena reproducibilidad entre ensayos. Cierren las placas con película adhesiva y centrífuga a 500 veces G y a temperatura ambiente durante 45 segundos para eliminar las burbujas restantes.Incubar las placas en una coctelera de placa a 100 rpm durante un minuto. A continuación, retire la película adhesiva e inserte la placa en un lector de microplacas y déjela durante tres minutos para estabilizar la temperatura a 25 grados centígrados. Lea las unidades de luminiscencia relativas de cada ensayo de placa ELISA.Guarde y copie los valores RLU sin procesar de los archivos de hoja de cálculo de datos sin procesar para su posterior análisis. En este estudio, se utiliza un nuevo ELISA basado en la captura de quimioprobe de KDM1A para medir directamente el compromiso objetivo de KDM1A en células y muestras de tejido. Los valores RLU de rKDM1A total y libre se evalúan para verificar la linealidad.Los valores RLU de KDM1A total y libre detectados en PBMC humanos de tres voluntarios independientes se superponen en la curva estándar. Las células AML se cultivan siguiendo las recomendaciones del proveedor y se tratan con vehículo u ORY-1001 a diferentes concentraciones. El extracto de proteína nativa se obtiene en presencia de 25 mililitros OG-881 quimioprobeo y 0,5 microgramos de proteína total se utiliza para realizar el análisis de compromiso objetivo.A continuación, se determinan los KDM1A totales y libres y los porcentajes de participación objetivo de ORY-1001 a KDM1A se calculan en relación con el vehículo. Aquí se muestra el compromiso objetivo KDM1A con dosis sensible en PBMC y en el tratamiento pulmonar de ratas con ORY-1001 por gavage oral, calculado en relación con el grupo de vehículos. La incubación ex vivo con 25 ory-1001 nanomolares de extractos de proteína pulmonar de los animales tratados con vehículo, produce TE completa, sin embargo, pero no aumenta aún más la TE en muestras de ratas tratadas durante cuatro días con 30 microgramos por kilogramo DE ORY-1001, confirmando que KDM1A ya estaba completamente inhibido in vivo.Este protocolo evalúa la contratación objetivo de KDM1A midiendo KDM1A libre y total. Recuerde que requiere extracción de proteínas nativas. Esta técnica se puede utilizar en muestras de diferentes especies para evaluar un inhibidor específico, también para detectar nuevos inhibidores.La quimioprobeba utilizada en este estudio también se puede aplicar para la quimioproteómica para estudiar el interactum KDM1A. Recuerde trabajar con seguridad y respetar en todo momento las medidas preventivas al manipular muestras biológicas y compuestos bioactivos como el inhibidor de la KDM1A.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Covalent Binding of Antibodies to Cellulose Paper Discs and Their Applications in Naked-eye Colorimetric Immunoassays

Covalente La unión de anticuerpos a los discos de papel de celulosa y sus aplicaciones en-simple vista colorimétricos inmunoensayos

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Investigación

Bioquímica

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