Name: direct measurement of kdm1a target engagement using chemoprobe-based immunoassays
Uploaded: 2019-06-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Measurement of KDM1A Target Engagement Using Chemoprobe-based Immunoassays at JoVE.com

Denna studie finansierades av Oryzon Genomics. S.A., Hoffman-La Roche, och delvis med stöd av CIIP-20152001 och RETOS Collaboration program RTC-2015-3332-1.

Blodprov erhölls från Instituto de Investigación Biomédica Sant Pau Biobank enligt spansk lagstiftning (Real Decreto de Biobancos 1716/2011) och godkännande av de lokala etikkommittéerna. Studier med djurvävnader utfördes i enlighet med de institutionella riktlinjer för skötsel och användning av försöksdjur (Europeiska gemenskapernas rådsdirektiv 86/609/EEG) som fastställts av etikkommittén för djurförsök vid PRAAL-PCB.
1. beredning av biologiska prover för analysen....

<ol>
	<li>Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+demethylation+mediated+by+the+nuclear+amine+oxidase+homolog+LSD1.">Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1.</a> Cell. 119 (7), 941-953 (2004).</li><li>Maiques-Diaz, A., Somervaille, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LSD1:+biologic+roles+and+therapeutic+targeting.">LSD1: biologic roles and therapeutic targeting.</a> Epigenomics. 8 (8), 1103-1116 (2016).</li><li>Maes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORY-1001,+a+Potent+and+Selective+Covalent+KDM1A+Inhibitor,+for+the+Treatment+of+Acute+Leukemia.">ORY-1001, a Potent and Selective Covalent KDM1A Inhibitor, for the Treatment of Acute Leukemia.</a> Cancer Cell. 33 (3), 495-511 (2018).</li><li>Sugino, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+LSD1+inhibitor+NCD38+ameliorates+MDS-related+leukemia+with+complex+karyotype+by+attenuating+leukemia+programs+via+activating+super-enhancers.">A novel LSD1 inhibitor NCD38 ameliorates MDS-related leukemia with complex karyotype by attenuating leukemia programs via activating super-enhancers.</a> Leukemia. 31 (11), 2303-2314 (2017).</li><li>Kleppe, M., Shank, K., Efthymia, P., Riehnhoff, H., Levine, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysine-Specific+Histone+Demethylase,+LSD1,+(KDM1A)+As+a+Novel+Therapeutic+Target+in+Myeloproliferative+Neoplasms.">Lysine-Specific Histone Demethylase, LSD1, (KDM1A) As a Novel Therapeutic Target in Myeloproliferative Neoplasms.</a> Blood. 126, 601 (2015).</li><li>Jutzi, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LSD1+Inhibition+Prolongs+Survival+in+Mouse+Models+of+MPN+by+Selectively+Targeting+the+Disease+Clone.">LSD1 Inhibition Prolongs Survival in Mouse Models of MPN by Selectively Targeting the Disease Clone.</a> HemaSphere. 2 (3), 54 (2018).</li><li>Mohammad, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Hypomethylation+Signature+Predicts+Antitumor+Activity+of+LSD1+Inhibitors+in+SCLC.">DNA Hypomethylation Signature Predicts Antitumor Activity of LSD1 Inhibitors in SCLC.</a> Cancer Cell. 28 (1), 57-69 (2015).</li><li>Rivers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RN-1,+a+potent+and+selective+lysine-specific+demethylase+1+inhibitor,+increases+&#947;-globin+expression,+F+reticulocytes,+and+F+cells+in+a+sickle+cell+disease+mouse+model.">RN-1, a potent and selective lysine-specific demethylase 1 inhibitor, increases &#947;-globin expression, F reticulocytes, and F cells in a sickle cell disease mouse model.</a> Experimental Hematology. 43 (7), 546-553 (2015).</li><li>Rivers, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+administration+of+the+LSD1+inhibitor+ORY-3001+increases+fetal+hemoglobin+in+sickle+cell+mice+and+baboons.">Oral administration of the LSD1 inhibitor ORY-3001 increases fetal hemoglobin in sickle cell mice and baboons.</a> Experimental Hematology. 67, 60-64 (2018).</li><li>Buesa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dual+LSD1/MAO-B+inhibitor+ORY-2001+prevents+the+development+of+the+memory+deficit+in+samp8+mice+through+induction+of+neuronal+plasticity+and+reduction+of+neuroinflammation.">The dual LSD1/MAO-B inhibitor ORY-2001 prevents the development of the memory deficit in samp8 mice through induction of neuronal plasticity and reduction of neuroinflammation.</a> Alzheimer&#8217;s &amp; Dementia. 11 (7), P905 (2015).</li><li>Schmidt, D. M., McCafferty, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-2-Phenylcyclopropylamine+is+a+mechanism-based+inactivator+of+the+histone+demethylase+LSD1.">Trans-2-Phenylcyclopropylamine is a mechanism-based inactivator of the histone demethylase LSD1.</a> Biochemistry. 46 (14), 4408-4416 (2007).</li><li>Forneris, F., Binda, C., Vanoni, M. A., Battaglioli, E., Mattevi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+histone+demethylase+LSD1+reads+the+histone+code.">Human histone demethylase LSD1 reads the histone code.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41360-41365 (2005).</li><li>Gonz#225;lez, E. C., Maes, T., Crusat, C. M., Mu#241;oz, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oryzon+Genomics,+Methods+to+determine+kdm1a+target+engagement+and+chemoprobes+useful+therefor.">Oryzon Genomics, Methods to determine kdm1a target engagement and chemoprobes useful therefor.</a> , (2016).</li><li>Mascaró, C., Ortega, A., Carceller, E., Rruiz Rodriguez, R., Cicero, F., Lunardi, S., Yu, L., Hilbert, M., Maes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoprobe-based+assays+of+histone+lysine+demethylase+1A+target+occupation+enable+in+vivo+pharmacokinetics+and+-dynamics+studies+of+KDM1A+inhibitors.">Chemoprobe-based assays of histone lysine demethylase 1A target occupation enable in vivo pharmacokinetics and -dynamics studies of KDM1A inhibitors.</a> Journal of Biological Chemistry. , (2019).</li><li>Rodriguez-Suarez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Homogeneous+Nonradioactive+Methyltransferase+and+Demethylase+Assays+Targeting+Histone+H3+Lysine+4.">Development of Homogeneous Nonradioactive Methyltransferase and Demethylase Assays Targeting Histone H3 Lysine 4.</a> Journal of Biomolecular Screening. 17 (1), 49-58 (2011).</li><li>Lynch, J. T., Cockerill, M. J., Hitchin, J. R., Wiseman, D. H., Somervaille, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD86+expression+as+a+surrogate+cellular+biomarker+for+pharmacological+inhibition+of+the+histone+demethylase+lysine-specific+demethylase+1.">CD86 expression as a surrogate cellular biomarker for pharmacological inhibition of the histone demethylase lysine-specific demethylase 1.</a> Analytical Biochemistry. 442 (1), 104-106 (2013).</li><li>Schulz-Fincke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-activity+studies+on+N-Substituted+tranylcypromine+derivatives+lead+to+selective+inhibitors+of+lysine+specific+demethylase+1+(LSD1)+and+potent+inducers+of+leukemic+cell+differentiation.">Structure-activity studies on N-Substituted tranylcypromine derivatives lead to selective inhibitors of lysine specific demethylase 1 (LSD1) and potent inducers of leukemic cell differentiation.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 144, 52-67 (2018).</li><li>Ishii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CETSA+quantitatively+verifies+in+vivo+target+engagement+of+novel+RIPK1+inhibitors+in+various+biospecimens.">CETSA quantitatively verifies in vivo target engagement of novel RIPK1 inhibitors in various biospecimens.</a> Scientific Report. 7, 13000 (2017).</li><li>Maes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORY-2001:+An+Epigenetic+drug+for+the+treatment+of+cognition+defects+in+Alzheimer&#8217;s+disease+and+other+neurodegenerative+disorders.">ORY-2001: An Epigenetic drug for the treatment of cognition defects in Alzheimer&#8217;s disease and other neurodegenerative disorders.</a> Alzheimer&#8217;s &amp; Dementia. 12 (7), P1192 (2017).</li></ol>

Det protokoll som presenteras här utvecklades för att direkt mäta KDM1A mål engagemang med hjälp av en roman KDM1A chemoprobe Capture baserade ELISA. Metoden har validerats på odlade humana cellinjer och ex vivo prover från människa, råtta och mus och babian (inklusive pbmcs, lung, hjärna, hud, tumörer), men kan lätt appliceras på andra arter där KDM1A antikropp mål epitoper och katalytisk Center bevaras. Som OG-881 är en verksamhet baserad chemoprobe, provet kvalitet är viktigt och korrekt manipulation ...

Lysin-specifika demetyleras 1 (KDM1A)1 är en demetyleras inblandade i kontrollen av gentranskription. Detta protein har vuxit fram som en kandidat farmakologisk mål2 i onkologi; inklusive akut myeloisk leukemi3 (AML), myelodysplasia syndrom (MDS)4, myelofibros (MF)5,6, småcellig Lung cancer (SCLC)7; i sicklecellanemi (SCD)8,9, och i centralanervsystemet sjukdomar inklusive Alzheimers sjukdom (AD), multipel skleros (MS); och i aggression10.
De flesta av de KDM1A hämmande föreningar i klinisk utveckling är cyklopropylamin derivat och hämmar proteinet genom kovalenta bindning till dess Flavin adenin--dinukleotid (FAD) kofaktor11. Hämning av KDM1A inducerar förändringar av genuttryck, men dessa förändringar varierar enormt mellan vävnader, celltyper eller sjukdoms fall. Hämning av KDM1A ändrar också Histon Marks12, men dessa förändringar är i allmänhet produceras lokalt på en specifik plats i genomet, och är återigen, mycket vävnad och cell specifika.
Protokollet utvecklades för att direkt mäta KDM1A mål engagemang i biologiska prover och har optimerats för användning med cyklopropylamin härledda hämmare. Analysen är baserad på ELISA-teknik och analyserar, parallellt, totalt och gratis (dvs. obunden av inhibitor) KDM1A i ett inhemskt proteinextrakt från ett biologiskt prov i en solid fas analys. Som ett första steg, är det biologiska provet lyserat i närvaro av en KDM1A selektiva chemoprobe og-88113,14, härrör från selektiv KDM1A inhibitor ORY-1001 (iadademstat), en potent hämmare av KDM1A i kliniska utveckling för behandling av onkologisk sjukdom. Den chemoprobe har en IC50 för KDM1A av 120 Nm och innehåller en modefluga bindande del kopplad till en en polyetylenglykol (PEG)-svans. Chemosonden binder exklusivt till den fria KDM1A, men inte till inhibitoren-begränsar KDM1A i ta prov. Efter chemoprobe bindning, de KDM1A som innehåller komplex i provet fångas på mikrotiterplattor med konjugerat belagd yta för att bestämma fri KDM1A, eller på plattor belagda med en monoklonal anti-KDM1A Capture antikropp för att bestämma totala KDM1A. Efter tvättning inkuberas båda plattorna med en anti-KDM1A detektionsantikropp, tvättas igen, och inkuberas med en sekundär HRP-konjugerad åsna anti-kanin IgG antikropp för detektion med hjälp av ett självlysande substrat och kvantifiering genom att mäta relativa ljusenheter (RLU) i en luminometern (figur 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59390/59390fig1.jpg"> Figur 1. Schema för ELISA enzym länkade chemoprobe immunoabsorberande test för KDM1A Target Engagement: A) bestämning av total KDM1A med Sandwich-Elisa och B) bestämning av fri KDM1A med hjälp av chemoprobe Elisa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59390/59390fig1large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
En standardkurva ingår i båda ELISA-plattorna för att kontrollera Lineariteten hos varje analys. Bestämning av KDM1A-målengagemang i varje prov beräknas sedan som ett relativt värde för det före dos-eller vehikel-behandlade provet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0,05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 X Protease Inhibitor Tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>#11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep well storage block</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#734-1679</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well ELISA plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>#436110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive black Film</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>#6050173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive transparent Film</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#60941-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated KDM1A probe OG-881</td>
			<td>Oryzon Genomics S.A.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># 3117057001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#23208)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Protein Assay</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>#500-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lysis buffer 10X</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#9803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for 96- well plates</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>Rotina 420R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full length, enzymatically active human Recombinant LSD1 / KDM1A</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>#31426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 5 Project</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol-Enhacer and Peroxide Solution (Chemiluminescent Substrate)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#37074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader Infinite 200-Tecan</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Infinite 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal capture antibody Anti-KDM1A (N-terminal epitope)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>#ab53269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle G18 gauge blunt</td>
			<td>BD</td>
			<td>#303129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORY-1001 (iadademstat)</td>
			<td>Oryzon Genomics S.A.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBMC separation tubes 10 ml</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>#163288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBMC separation tubes 50 ml</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>#227288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate shaker</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td>Rotamax 120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal detection antibody Anti-KDM1A (C-terminal epitope)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#672184BF-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody Peroxidase-conjugated Donkey Anti-rabbit IgG</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#31458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer cuvette 1.5</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>#302100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer for cuvette</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GeneQuant 1300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>#Z704A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>#303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 1 ultrapure water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Milli-Q Advantage A10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner</td>
			<td>VWR</td>
			<td>USC200T</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct measurement of kdm1a target engagement using chemoprobe-based immunoassays

Bedömningen av målet engagemang, definierad som samspelet mellan ett läkemedel med proteinet det utformades för, är ett grundläggande krav för tolkningen av den biologiska aktiviteten hos någon förening i läkemedelsutveckling eller i grundläggande forskningsprojekt. I epigenetik bedöms mål engagemanget oftast av analysen av proxymarkörer istället för att mäta föreningen av substansen till målet. Nedströms biologiska avläsningar som har analyserats inkluderar Histon mark modulering eller genuttryck förändringar. KDM1A är en lysin-demetyleras som avlägsnar metylgrupper från mono-och dimetylerade H3K4, en modifiering som är förknippad med ljuddämpning av genuttryck. Modulering av proxy markörer är beroende av celltyp och funktion av den genetiska make-up av de undersökta cellerna, som kan göra tolkning och Cross-Case jämförelse ganska svårt. För att kringgå dessa problem, ett mångsidigt protokoll presenteras för att bedöma dos effekter och dynamik i direkt KDM1A mål engagemang. Analysen beskrivs gör användning av en KDM1A chemoprobe att fånga och kvantifiera ohämmade enzym, kan i stort sett tillämpas på celler eller vävnadsprover utan behov av genetisk modifiering, har ett utmärkt fönster för detektion, och kan användas både för grundforskning och analys av kliniska prover.

Lineariteten av total och fri KDM1A beslutsamhet.
En standard serie utarbetades enligt beskrivningen i steg 5.3.2., med hjälp av 0 till 2500 PG av fullängds humant rekombinant KDM1A enzym. RLU-värdena för total och Free rKDM1A bedömdes för att kontrollera Lineariteten (figur 2A och 2b). Data representeras som medelvärde från 3 experiment med 3 tekniska repli...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Measurement of KDM1A Target Engagement Using Chemoprobe-based Immunoassays at JoVE.com

Direct Measurement of KDM1A Target Engagement Using Chemoprobe-based Immunoassays

Direkt mätning av KDM1A mål engagemang med Chemoprobe-baserade Immunoassays

Här presenterar vi ett protokoll för att mäta KDM1A mål engagemang i en människa eller djur cell, vävnad eller blodprov som behandlats med KDM1A-hämmare. Protokollet sysselsätter chemoprobe märkning av den fria KDM1A enzym och direkt kvantifiering av mål ockupationen med chemoprobe-baserade immunanalyser och kan användas i prekliniska och kliniska studier.

The assessment of the target engagement, defined as the interaction of a drug with the protein it was designed for, is a basic requirement for the ...

Bedömningen av målet engagemang, det vill säga samspelet mellan ett läkemedel med proteinet den var avsedd för, är ett grundläggande krav för tolkning av den biologiska aktiviteten av någon förening i läkemedelsutveckling, eller i grundläggande forskningsprojekt. Den största fördelen med denna teknik är att det tillåter direkt mätning av dos effekt och dynamiken i KDM1A mål engagemang, snarare än mätningar av nedströms effekter såsom histonmärken och uttryck. Denna teknik kan tillämpas i grundforskning och även i kliniska prövningar, i onkologisk CNS eller andra sjukdomar som är föremål för behandling med KDM1A-hämmare för att studera farmakodynamik.Denna teknik är baserad på en kemoprobe som utvecklats för att studera ORY-1001, iadademstat, men kan verkligen användas för andra KDM1A-hämmare och strategin kan tillämpas på andra mål. Proceduren kommer att demonstreras av Raquel Ruiz, driftchef för PK/PD discovery platform från mitt labb. Under cellbehandling med ORY-1001 föreningen binder till KDM1A protein som finns i kärnan.För att börja detta förfarande, hämta en 10 microliter engångs alikvot på 20 millimolar biotinylerade sond OG-881 stamlösning från kylskåpet och låt den värma upp vid rumstemperatur i 10 minuter. Med hjälp av ett mikropipet med filterspetsar späds stamlösningen seriellt för att förbereda den två mikromolararbetslösningen. Därefter löser du upp en tablett proteashämmare i en milliliter PBS i ett mikrocentrifugrör.För varje milliliter av den önskade volymen 1x celllysbuffert med kemoproben, mix 100 mikroliter av kommersiell erhållna 10x cell lysbuffert, 150 mikroliter av 10x proteashämmare, 12,5 mikroliter av den två mikromolar OG-881 arbetslösning och 737,5 mikroliter av typ-1 dubbeldestillerat vatten. Celler är lysed i 1x lys buffert i närvaro av chemoprobe som binder till någon fri KDM1A protein. För att förbereda från vävnader, använd en mortel och mortel som kyls på torris för att pulverisera och homogenisera en en kubikcentimeter bit fryst vävnad.Aliquot vävnaden i engångsbruk injektionsflaska, se till att överföra cirka 40 milligram vävnad pulver i varje injektionsflaska, samtidigt som man undviker upptining hela tiden. Förvara proverna på 80 grader Celsius tills de är klara att bearbeta. För att förbereda från cell pellets, resuspend pelleten av cirka 10 miljoner celler i 200 mikroliter av 1x cell lys buffert som innehåller 25 nanomolar OG-881.Vortex varje prov kort och hålla dem på is i fem minuter. Med hjälp av en sonicator, sonikera proverna med tre pulser på 45 kilohertz varar i 20 sekunder vardera. Placera proverna på is i 20 sekunder mellan pulserna.Förvara proverna på is i ytterligare fem minuter. Sedan, vortex kort och centrifugproverna på 14, 000 gånger G i 10 minuter i en centrifug som är pre-kyld vid fyra grader Celsius. Med hjälp av en milliliter mikropipet överföra varje supernatant till en separat 1,5 milliliter mikrocentrifugrör.Låt tuberna vara på is i två timmar före bearbetning. Kvantifiera sedan det inhemska proteinet med hjälp av Bradford-analysen som beskrivs i textprotokollet. En totalplatta är belagd med anti-KDM1A-antikropp.Gratis plåt är belagd med streptavidin. Cell lysate tillsätts sedan till båda plattorna och KDM1A komplexa fångas direkt eller genom chemoprobe. Plattor tvättas och inkuberas med anti-KDM1A detektionsantikroppen och en sekundär antikropp i kombination med pepparrotsperoxidas.Slutligen läggs självlysande substrat till och signal genereras. För total KDM1A ELISA, preparera 10 milliliter KDM1A capture-antikropp i PBS till en slutkoncentration på två mikrogram per milliliter för varje platta. Överför 100 mikroliter i varje brunn av plattan.För fri KDM1A ELISA, preparera 10 milliliter streptavidin i PBS som en koncentration på 10 mikrogram per milliliter för varje platta. Överför 100 mikroliter i varje brunn av plattan. Sedan, topp försegla varje platta med självhäftande film och inkubera över natten vid fyra grader Celsius.Nästa dag, ta ut plattorna från kylskåpet och låt dem jämvikt i rumstemperatur i cirka 45 minuter. Tvätta varje platta tre gånger med tvättbuffert, se till att knacka på plattan på hushållspapper efter varje tvättsteg för att ta bort eventuell restlösning. Lägg till 200 mikroliter av blockerande buffert till varje brunn av båda plattorna.Toppförslut plattorna med självhäftande film och inkubera i rumstemperatur i två timmar. Under tiden späd de tidigare erhållna inhemska proteinextrakt med PBS till lämplig koncentration och lägga ut plattan för att förbereda en standard kurva med hjälp av mänskliga rKDM1A som beskrivs i textprotokollet. Efter två timmars inkubation är klar, kassera blockeringsbufferten och tvätta plattorna med tvättbuffert, se till att knacka på plattan på hushållspapper efter varje tvättsteg för att avlägsna eventuell restlösning.Överför de lämpliga utspädda proverna till ett kylt 96 djup brunnslagringsblock efter den plattfördelning som finns i tabell två i textprotokollet. Håll detta block på is medan pipettering 100 mikroliter per väl in i den totala och fria ELISA plattorna efter plattan distribution finns i tabell tre av textprotokollet. Inkubera i rumstemperatur i en timme, kassera sedan proverna och tvätta plattorna fem gånger med tvättbuffert.Förbered 20 milliliter kanin anti-KDM1A detekteringsantikropp i blockerande buffert vid en koncentration av 0,125 mikrogram per milliliter. Tillsätt 100 mikroliter av detektionsantikroppslösningen till varje brunn av båda plattorna, utom de som motsvarar de negativa kontrollerna. Toppförslut plattorna med klisterfilm och inkubera i rumstemperatur i en timme.Efter detta, kassera detektionsantikroppslösningen och tvätta plattorna sex gånger med tvättbuffert. Förbered 25 milliliter sekundär get anti-kanin antikropp, HRP, till en spädning av en till 5, 000 i blockerande buffert. Tillsätt 100 mikroliter av den sekundära antikroppslösningen till varje brunn av mikrotiterplattorna och inkubera i rumstemperatur i en timme.30 minuter före slutet av denna inkubation, blanda lika delar av luminolförstärkare och peroxidlösning i en bärnstensflaska under mjuka ljusförhållanden. Lämna denna blandning i rumstemperatur. När inkubationen på en timme är klar, kassera den sekundära antikroppslösningen och tvätta plattorna sex gånger med tvättbuffert.Därefter pipet 100 mikroliter av luminol arbetslösning till varje brunn av plattorna, se till att pipet mycket långsamt för att undvika bubbla bildning. Använd en timer för att styra tiden mellan tillsats av lösningen och luminestansmätningen av plattorna och håll denna tid konstant för att uppnå en god inter-assay reproducerbarhet. Toppförslut plattorna med självhäftande film och centrifug vid 500 gånger G och vid rumstemperatur i 45 sekunder för att eliminera eventuella kvarvarande bubblor.Inkubera plattorna på en tallriksskakmaskin med 100 rpm i en minut. Ta sedan bort den självhäftande filmen och för in plattan i en mikroplatta läsare och lämna den i tre minuter för att stabilisera temperaturen vid 25 grader Celsius. Läs av de relativa luminecisenheterna i varje ELISA-plattanalys.Spara och kopiera de råa RLU-värdena från raw-data-kalkylbladsfilerna för vidare analys. I denna studie, en ny KDM1A chemoprobe fånga baserade ELISA används för att direkt mäta KDM1A mål engagemang i celler och vävnadsprover. RLU-värdena för total och fri rKDM1A bedöms för att verifiera linjäriteten.RLU-värdena för total och fri KDM1A som detekterats i mänskliga PBMC från tre oberoende frivilliga läggs sedan ovanpå standardkurvan. AML-celler odlas efter leverantörsrekommendationer och behandlas med antingen fordon eller ORY-1001 vid olika koncentrationer. Det inhemska proteinextraktet erhålls i närvaro av 25 millimolar OG-881 kemoprobe och 0,5 mikrogram totalt protein används för att utföra målengagemangets analys.Totalt och fritt KDM1A bestäms sedan och procenttalen för målengagemang av ORY-1001 till KDM1A beräknas i förhållande till fordonet. Den dos-responsiva KDM1A-målengagemanget i PBMCs och vid lungbehandling av råttor med ORY-1001 genom oral sondmatning, beräknad släkting fordonsgruppen visas här. Den ex vivo inkubation med 25 nanomolar ORY-1001 av lungprotein extrakt från fordonet behandlade djur, ger full TE, ännu, men inte ytterligare öka TE i prover från råttor som behandlats i fyra dagar med 30 mikrogram per kilo ORY-1001, bekräftar KDM1A var redan helt hämmas i vivo.Detta protokoll bedöma KDM1A mål engagemang genom att mäta fri och totalt KDM1A. Kom ihåg det kräver inhemska protein extraktion. Denna teknik kan användas på prover från olika arter för att bedöma en specifik hämmare, även för att screena efter nya hämmare.Den kemoprobe som används i denna studie kan också tillämpas för chemoproteomics att studera KDM1A interactum. Kom ihåg att arbeta säkert och respektera hela tiden förebyggande åtgärder vid hantering av biologiska prover och bioaktiva föreningar som KDM1A-hämmare.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Covalent Binding of Antibodies to Cellulose Paper Discs and Their Applications in Naked-eye Colorimetric Immunoassays

Kovalent bindning av antikroppar till cellulosapapper skivor och deras tillämpningar inom blotta ögat Kolorimetriska Immun

This report presents two methods for the covalent immobilization of capture antibodies on cellulose filter paper grade No. 1 (medium-flow filter paper) ...

Measurement of Basal and Forskolin-stimulated Lipolysis in Inguinal Adipose Fat Pads

Mätning av basal och forskolinstimulerad lipolys i fettkorgar i fettad adiposa

Lipolysis is a process by which the lipid stored as triglycerides in adipose tissues are hydrolyzed into glycerol and fatty acids. This article describes ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

Använda ett omfattande Immunoprecipitation berikning System för att identifiera en endogen posttranslationella modifieringen profil för målproteiner

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Simultaneous Measurement of Superoxide/Hydrogen Peroxide and NADH Production by Flavin-containing Mitochondrial Dehydrogenases

Samtidig mätning av superoxid-och/eller väteperoxid och NADH produktion av Flavin-innehållande mitokondriell mellan östradiol och östron

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include ...

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

Mätning av mitokondriell syreförbrukning i Permeabilized fibrer av Drosophila använder minimala mängder av vävnad

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

A Direct Force Probe for Measuring Mechanical Integration Between the Nucleus and the Cytoskeleton

En direkt tvång sond för mätning av mekaniska Integration mellan kärnan och cytoskelettet

The mechanical properties of the nucleus determine its response to mechanical forces generated in cells. Because the nucleus is molecularly continuous ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Med hög halt Imaging att kvantifiera mål engagemang i vidhäftande celler

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hög känslighet mätning av transkription faktorn-DNA bindande samhörighet genom konkurrenskraftiga titrering med fluorescensmikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Cortisol Measurement in Koala (Phascolarctos cinereus) Fur

Cortisol Measurement in Koala Phascolarctos cinereus Fur

Kortisol mätning i Koala (Phascolarctos cinereus) päls

Optimal methods of hormone extraction used to measure stress in animals across sample types are not always the same. Australia&#39;s iconic marsupial ...

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability DARTS assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

En semi-kvantitativ Läkemedelstillhörighet lyhörd mål stabilitet (Dart) test för att studera rapamycin/mTOR interaktion

Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) is a robust method for detection of novel small molecule protein targets. It can be used to verify known ...