Name: direct measurement of kdm1a target engagement using chemoprobe-based immunoassays
Uploaded: 2019-06-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Measurement of KDM1A Target Engagement Using Chemoprobe-based Immunoassays at JoVE.com

Bu çalışmada Oryzon Genomics tarafından finanse edilmiştir. S.A., Hoffman-La Roche ve CIıP-20152001 ve RETOS işbirliği programı RTC-2015-3332-1 tarafından kısmen desteklenmektedir.

Kan numuneleri, Ispanyolca mevzuatına (Real Decreto de Biobancos 1716/2011) ve yerel etik komitelerinin onayı uyarınca Instituto de Investis Biomédica Sant Pau biobank 'tan alınmıştır. Hayvansal dokularla yapılan çalışmalar, laboratuar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için kurumsal yönergelere uygun olarak (Avrupa Toplulukları Konseyi Direktifi 86/609/EEC), Hayvan deneyi Etik Komitesi tarafından kurulan PRAAL-PCB.
1. tahlil için biyolojik numunelerin hazırlanmas...

<ol>
	<li>Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+demethylation+mediated+by+the+nuclear+amine+oxidase+homolog+LSD1.">Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1.</a> Cell. 119 (7), 941-953 (2004).</li><li>Maiques-Diaz, A., Somervaille, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LSD1:+biologic+roles+and+therapeutic+targeting.">LSD1: biologic roles and therapeutic targeting.</a> Epigenomics. 8 (8), 1103-1116 (2016).</li><li>Maes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORY-1001,+a+Potent+and+Selective+Covalent+KDM1A+Inhibitor,+for+the+Treatment+of+Acute+Leukemia.">ORY-1001, a Potent and Selective Covalent KDM1A Inhibitor, for the Treatment of Acute Leukemia.</a> Cancer Cell. 33 (3), 495-511 (2018).</li><li>Sugino, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+LSD1+inhibitor+NCD38+ameliorates+MDS-related+leukemia+with+complex+karyotype+by+attenuating+leukemia+programs+via+activating+super-enhancers.">A novel LSD1 inhibitor NCD38 ameliorates MDS-related leukemia with complex karyotype by attenuating leukemia programs via activating super-enhancers.</a> Leukemia. 31 (11), 2303-2314 (2017).</li><li>Kleppe, M., Shank, K., Efthymia, P., Riehnhoff, H., Levine, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysine-Specific+Histone+Demethylase,+LSD1,+(KDM1A)+As+a+Novel+Therapeutic+Target+in+Myeloproliferative+Neoplasms.">Lysine-Specific Histone Demethylase, LSD1, (KDM1A) As a Novel Therapeutic Target in Myeloproliferative Neoplasms.</a> Blood. 126, 601 (2015).</li><li>Jutzi, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LSD1+Inhibition+Prolongs+Survival+in+Mouse+Models+of+MPN+by+Selectively+Targeting+the+Disease+Clone.">LSD1 Inhibition Prolongs Survival in Mouse Models of MPN by Selectively Targeting the Disease Clone.</a> HemaSphere. 2 (3), 54 (2018).</li><li>Mohammad, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Hypomethylation+Signature+Predicts+Antitumor+Activity+of+LSD1+Inhibitors+in+SCLC.">DNA Hypomethylation Signature Predicts Antitumor Activity of LSD1 Inhibitors in SCLC.</a> Cancer Cell. 28 (1), 57-69 (2015).</li><li>Rivers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RN-1,+a+potent+and+selective+lysine-specific+demethylase+1+inhibitor,+increases+&#947;-globin+expression,+F+reticulocytes,+and+F+cells+in+a+sickle+cell+disease+mouse+model.">RN-1, a potent and selective lysine-specific demethylase 1 inhibitor, increases &#947;-globin expression, F reticulocytes, and F cells in a sickle cell disease mouse model.</a> Experimental Hematology. 43 (7), 546-553 (2015).</li><li>Rivers, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+administration+of+the+LSD1+inhibitor+ORY-3001+increases+fetal+hemoglobin+in+sickle+cell+mice+and+baboons.">Oral administration of the LSD1 inhibitor ORY-3001 increases fetal hemoglobin in sickle cell mice and baboons.</a> Experimental Hematology. 67, 60-64 (2018).</li><li>Buesa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dual+LSD1/MAO-B+inhibitor+ORY-2001+prevents+the+development+of+the+memory+deficit+in+samp8+mice+through+induction+of+neuronal+plasticity+and+reduction+of+neuroinflammation.">The dual LSD1/MAO-B inhibitor ORY-2001 prevents the development of the memory deficit in samp8 mice through induction of neuronal plasticity and reduction of neuroinflammation.</a> Alzheimer&#8217;s &amp; Dementia. 11 (7), P905 (2015).</li><li>Schmidt, D. M., McCafferty, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-2-Phenylcyclopropylamine+is+a+mechanism-based+inactivator+of+the+histone+demethylase+LSD1.">Trans-2-Phenylcyclopropylamine is a mechanism-based inactivator of the histone demethylase LSD1.</a> Biochemistry. 46 (14), 4408-4416 (2007).</li><li>Forneris, F., Binda, C., Vanoni, M. A., Battaglioli, E., Mattevi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+histone+demethylase+LSD1+reads+the+histone+code.">Human histone demethylase LSD1 reads the histone code.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41360-41365 (2005).</li><li>Gonz#225;lez, E. C., Maes, T., Crusat, C. M., Mu#241;oz, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oryzon+Genomics,+Methods+to+determine+kdm1a+target+engagement+and+chemoprobes+useful+therefor.">Oryzon Genomics, Methods to determine kdm1a target engagement and chemoprobes useful therefor.</a> , (2016).</li><li>Mascaró, C., Ortega, A., Carceller, E., Rruiz Rodriguez, R., Cicero, F., Lunardi, S., Yu, L., Hilbert, M., Maes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoprobe-based+assays+of+histone+lysine+demethylase+1A+target+occupation+enable+in+vivo+pharmacokinetics+and+-dynamics+studies+of+KDM1A+inhibitors.">Chemoprobe-based assays of histone lysine demethylase 1A target occupation enable in vivo pharmacokinetics and -dynamics studies of KDM1A inhibitors.</a> Journal of Biological Chemistry. , (2019).</li><li>Rodriguez-Suarez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Homogeneous+Nonradioactive+Methyltransferase+and+Demethylase+Assays+Targeting+Histone+H3+Lysine+4.">Development of Homogeneous Nonradioactive Methyltransferase and Demethylase Assays Targeting Histone H3 Lysine 4.</a> Journal of Biomolecular Screening. 17 (1), 49-58 (2011).</li><li>Lynch, J. T., Cockerill, M. J., Hitchin, J. R., Wiseman, D. H., Somervaille, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD86+expression+as+a+surrogate+cellular+biomarker+for+pharmacological+inhibition+of+the+histone+demethylase+lysine-specific+demethylase+1.">CD86 expression as a surrogate cellular biomarker for pharmacological inhibition of the histone demethylase lysine-specific demethylase 1.</a> Analytical Biochemistry. 442 (1), 104-106 (2013).</li><li>Schulz-Fincke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-activity+studies+on+N-Substituted+tranylcypromine+derivatives+lead+to+selective+inhibitors+of+lysine+specific+demethylase+1+(LSD1)+and+potent+inducers+of+leukemic+cell+differentiation.">Structure-activity studies on N-Substituted tranylcypromine derivatives lead to selective inhibitors of lysine specific demethylase 1 (LSD1) and potent inducers of leukemic cell differentiation.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 144, 52-67 (2018).</li><li>Ishii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CETSA+quantitatively+verifies+in+vivo+target+engagement+of+novel+RIPK1+inhibitors+in+various+biospecimens.">CETSA quantitatively verifies in vivo target engagement of novel RIPK1 inhibitors in various biospecimens.</a> Scientific Report. 7, 13000 (2017).</li><li>Maes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORY-2001:+An+Epigenetic+drug+for+the+treatment+of+cognition+defects+in+Alzheimer&#8217;s+disease+and+other+neurodegenerative+disorders.">ORY-2001: An Epigenetic drug for the treatment of cognition defects in Alzheimer&#8217;s disease and other neurodegenerative disorders.</a> Alzheimer&#8217;s &amp; Dementia. 12 (7), P1192 (2017).</li></ol>

Burada sunulan protokol doğrudan KDM1A hedef nişan bir roman KDM1A chemoprobe yakalama tabanlı ELISA kullanarak ölçmek için geliştirilmiştir. Yöntem, insan, sıçan ve fare ve babun (pbmcs, akciğer, beyin, cilt, tümörler dahil), ama kolayca diğer türler için uygulanabilir hangi KDM1A antikor hedef epitopları ve katalitik olarak kültürlü insan hücresi hatları ve ex vivo örnekleri üzerinde doğrulandı Merkezi temin edilmektedir. OG-881 bir aktivite bazlı chemoprobe olduğu için, örnek kalite öne...

Lizin spesifik demethylase 1 (KDM1A)1 Gen transkripsiyonu kontrolünde yer alan bir demethylase 'dir. Bu protein, Onkoloji 'de bir aday farmakolojik hedef2 olarak ortaya çıkmıştır; Akut myeloid lösemi3 (ayl), myelodisplazi Sendromu (MDS)4, myelofibroz (MF)5,6, küçük hücreli akciğer kanseri (sclc)7; orak hücre hastalığı (SCD)8,9ve Alzheimer hastalığı (reklam), multipl skleroz (MS) dahil olmak üzere merkezi sinir sistemi hastalıklarında; ve saldırganlık10.
Klinik gelişiminde KDM1A inhibe bileşiklerin çoğu siklopropilamin türevleri ve flavin adenin dinükleotid (FAD) kofaktör11için kovalent bağlayıcı tarafından protein inhibe. KDM1A inhibisyonu gen ifade değişikliklerini indükler, ancak bu değişiklikler, doku, hücre türleri veya hastalık vakaları arasında muazzam farklılık gösterir. KDM1A inhibisyonu da histon işaretleri değiştirir12, henüz bu değişiklikler genellikle genom belirli bir sitede yerel olarak üretilir, ve yine, yüksek doku ve hücre spesifik.
Protokol, biyolojik örneklerde KDM1A hedef etkileşimi doğrudan ölçmek için geliştirilmiştir ve siklopropilamin türev inhibitörleri ile kullanılmak üzere optimize edilmiştir. Tahlil ELISA teknolojisi dayanmaktadır ve analiz, paralel olarak, Total ve ücretsiz (yani inhibitör tarafından ilişkisiz) KDM1A bir doğal protein özü bir biyolojik örnek bir katı faz tahlil. İlk adım olarak, biyolojik numune biyotinlenmiş KDM1A seçici chemoprobe OG-881, seçici KDM1A inhibitörü ORY-1001 (ıadademstat), KDM1A klinik olarak güçlü bir inhibitör türetilmiştir, varlığı içinde lysed onkolojik hastalığın tedavisi için gelişme. Chemoprobe bir IC50 için KDM1A 120 nm ve bir FAD bağlayıcı kısım bir biyotinlenmiş Polietilen glikol (PEG)-kuyruk bağlı içerir. Chemoprobe özel olarak ücretsiz KDM1A bağlar, ancak numunenin inhibitörü bağlı KDM1A. Chemoprobe bağladıktan sonra, örnekteki kompleksleri içeren KDM1A, ücretsiz KDM1A belirlemek için streptavidin kaplamalı yüzeyli mikrotiter plaklarda veya toplam KDM1A belirlemek için monoklonal Anti-KDM1A yakalama antikor ile kaplanmış plaklarda yakalanır. Yıkandıktan sonra, her iki plaka bir anti-KDM1A algılama antikor ile inkübe, tekrar yıkanır, ve göreli ölçüm tarafından bir Işıksaçan substrat ve Ölçüleme kullanarak algılama için ikincil bir HRP-konjuate eşek Anti-tavşan IgG antikor ile inkübe ışık ünitelerinin (RLU) bir Luminometre (Şekil 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59390/59390fig1.jpg"> Şekil 1. KDM1A hedef nişan için ELıSA enzim bağlantılı chemoprobe immunemici tahlil şeması: A) Toplam KDM1A sandviç ELISA ve B kullanarak belirlenmesi) ÜCRETSIZ KDM1A chemoprobe ELıSA kullanarak belirlenmesi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59390/59390fig1large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
Her testin doğrusallık doğrulamak için her iki ELıSA plakaları standart bir eğrisi dahil edilir. Her örnekteki KDM1A hedef etkileşimi belirlenmesi daha sonra ön doz veya araç tedavi örnek göreli bir değer olarak hesaplanır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0,05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 X Protease Inhibitor Tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>#11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep well storage block</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#734-1679</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well ELISA plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>#436110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive black Film</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>#6050173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive transparent Film</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#60941-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated KDM1A probe OG-881</td>
			<td>Oryzon Genomics S.A.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># 3117057001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#23208)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Protein Assay</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>#500-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lysis buffer 10X</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#9803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for 96- well plates</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>Rotina 420R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full length, enzymatically active human Recombinant LSD1 / KDM1A</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>#31426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 5 Project</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol-Enhacer and Peroxide Solution (Chemiluminescent Substrate)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#37074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader Infinite 200-Tecan</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Infinite 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal capture antibody Anti-KDM1A (N-terminal epitope)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>#ab53269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle G18 gauge blunt</td>
			<td>BD</td>
			<td>#303129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORY-1001 (iadademstat)</td>
			<td>Oryzon Genomics S.A.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBMC separation tubes 10 ml</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>#163288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBMC separation tubes 50 ml</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>#227288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate shaker</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td>Rotamax 120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal detection antibody Anti-KDM1A (C-terminal epitope)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#672184BF-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody Peroxidase-conjugated Donkey Anti-rabbit IgG</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#31458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer cuvette 1.5</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>#302100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer for cuvette</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GeneQuant 1300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>#Z704A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>#303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 1 ultrapure water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Milli-Q Advantage A10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner</td>
			<td>VWR</td>
			<td>USC200T</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct measurement of kdm1a target engagement using chemoprobe-based immunoassays

Bir ilacın, tasarlandığı protein ile etkileşimi olarak tanımlanan hedef etkileşiminin değerlendirilmesi, ilaç gelişiminde veya temel araştırma projelerinde herhangi bir bileşiğin biyolojik aktivitesinin yorumlanmasında temel bir gerekliliktir. Epigenetik olarak, hedef nişan en sık hedef bileşik Birliği ölçmek yerine vekil işaretçileri analizi ile değerlendirilir. Analiz edilmiş olan akım biyolojik okuymalar histon işareti modülasyonu veya gen ifadesi değişikliklerini içerir. KDM1A, metil gruplarını Mono-ve dimethylated H3K4, Gen ifadesinin susturulması ile ilişkili bir modifikasyondan kaldıran bir lizin demethylase 'dir. Vekil işaretçileri modülasyonu hücre türü ve fonksiyon genetik makyaj, incelenen hücreleri bağlıdır, hangi yorumlama ve çapraz durum karşılaştırma oldukça zor yapabilirsiniz. Bu sorunları aşmak için, doğrudan KDM1A hedef etkileşimi doz etkilerini ve dinamiklerini değerlendirmek için çok yönlü bir protokol sunulmaktadır. Tahlil açıklanan bir KDM1A chemoprobe yakalamak ve Unin, enzim ölçmek için yaygın olarak hücreler veya doku örnekleri genetik modifikasyon için gerek kalmadan uygulanabilir, algılama mükemmel bir pencere vardır ve kullanımı yapar temel araştırma için hem de kullanılabilir ve klinik numunelerin analizi.

Toplam ve serbest KDM1A belirlenmesinde doğrusallık.
A standart serisi adım 5.3.2 açıklandığı gibi hazırlanmıştır., kullanarak 0 için 2500 pg tam uzunlukta insan rekombinant KDM1A enzim. Toplam ve ücretsiz rKDM1A RLU değerleri doğrusallık doğrulamak için değerlendirildi (Şekil 2a ve 2B). Veriler 3 Teknik çoğaltır (n) ± SD ile 3 deneyden orta...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Measurement of KDM1A Target Engagement Using Chemoprobe-based Immunoassays at JoVE.com

Direct Measurement of KDM1A Target Engagement Using Chemoprobe-based Immunoassays

Chemoprobe tabanlı bağışıklık sistemini kullanarak KDM1A hedef etkileşimi doğrudan ölçümü

Burada, bir insan veya hayvan hücresi, KDM1A inhibitörleri ile tedavi edilen doku veya kan örneklerinde KDM1A hedef etkileşimi ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Protokol, serbest KDM1A enziminin chemoprobe etiketlemesini ve hedef işgali kemoprob bazlı immünozit kullanarak doğrudan ölçülmesini kullanır ve preklinik ve klinik çalışmalarda kullanılabilir.

The assessment of the target engagement, defined as the interaction of a drug with the protein it was designed for, is a basic requirement for the ...

Hedef katılımın değerlendirilmesi, yani bir ilacın tasarladığı proteinle etkileşimi, ilaç geliştirmede veya temel araştırma projelerinde herhangi bir bileşiğin biyolojik aktivitesinin yorumlanması için temel bir gerekliliktir. Bu tekniğin en büyük avantajı, histon işaretleri ve ekspresyonu gibi downstream etkilerinin ölçümleri yerine, doz etkisinin ve KDM1A hedef etkileşiminin dinamiklerinin doğrudan ölçülmeye izin vermedir. Bu teknik temel araştırmalarda ve klinik çalışmalarda, farmakodinamik çalışması için KDM1A inhibitörü ile tedaviye tabi onkolojik CNS veya diğer hastalıklarda da uygulanabilir.Bu teknik, ORY-1001, iadademstat çalışmak için geliştirilen bir kemoprob dayanmaktadır, ancak gerçekten diğer KDM1A inhibitörleri için kullanılabilir ve strateji diğer hedeflere uygulanabilir. Prosedür Raquel Ruiz, pk / PD keşif platformu benim laboratuvar operasyon yöneticisi tarafından gösterilecek. ORY-1001 ile hücre tedavisi sırasında bileşik çekirdekmevcut KDM1A protein bağlanır.Bu prosedürü başlatmak için, buzdolabından 20 milimolar biyotinylated prob OG-881 stok çözeltisi 10 mikrolitre tek kullanımlık aliquot almak ve 10 dakika oda sıcaklığında ısınmaya bırakın. Filtre uçları ile bir micropipet kullanarak, seri iki mikromolar çalışma çözümü hazırlamak için stok çözeltisi seyreltmek. Daha sonra, bir mikrosantrifüj tüpppüşafat bir mililitre proteaz inhibitörü tabletini çözün.Kemoprob ile istenilen 1x hücre lisis tamponunun istenilen hacminin her mililitresi için, elde edilen 100 mikrolitre ticari 10x hücre lisis tamponu, 10x proteaz inhibitörü150 mikrolitre, iki mikromolar OG-881 çalışma çözeltisinin 12,5 mikrolitresi ve 737,5 mikrolitre tip-1 çift distile su karıştırın. Hücreler herhangi bir serbest KDM1A proteinine bağlanan kemoprob varlığında 1x lysis tamponu içinde lysed edilir. Dokulardan hazırlanmak için, dondurulmuş doku bir santimetrekküp parçası pulverize ve homojenize kuru buz üzerinde soğutulmuş bir harç ve havaneli kullanın.Aliquot tek kullanımlık şişeler içine doku, her şişe içine doku tozu yaklaşık 40 miligram aktarmak için emin olun, her zaman erime kaçınarak. Numuneleri işleme hazır olana kadar 80 derecede saklayın. Hücre peletlerinden hazırlanmak için, 25 nanomolar OG-881 içeren 1x hücreli lis tamponunun 200 mikrolitresinde yaklaşık 10 milyon hücrenin peletini yeniden askıya alın.Girdap her örnek kısaca ve beş dakika buz üzerinde tutun. Bir sonicator kullanarak, her biri 20 saniye süren 45 kilohertz üç darbeler ile örnekleri sonicate. Darbeler arasında 20 saniye boyunca buz üzerinde örnekleri yerleştirin.Örnekleri beş dakika daha buzda tutun. Daha sonra, girdap kısa bir süre ve 14, 000 kez G dört derece önceden soğutulmuş bir santrifüj 10 dakika için örnekleri santrifüj. Ayrı bir 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüp içine her supernatant bir mililitre mikropipet transferi kullanarak.İşlemeden önce tüpleri iki saat buzüzerinde bırakın. Daha sonra, metin protokolünde belirtildiği gibi Bradford testini kullanarak yerli proteini ölçün. Toplam plaka anti-KDM1A antikor ile kaplanır.Serbest plaka streptavidin ile kaplanır. Hücre lisate sonra her iki plaka eklenir ve KDM1A kompleksi doğrudan veya kemoprob yoluyla yakalanır. Plakalar yıkanır ve anti-KDM1A algılama antikor ve horseradish peroksidaz ile birleştiğinde ikincil bir antikor ile inkübe edilir.Son olarak, Parlak substrat eklenir ve sinyal oluşturulur. Toplam KDM1A ELISA için, PBS'de 10 mililitre KDM1A yakalama antikorını her plaka için mililitre başına iki mikrogramlık son konsantrasyona hazırlayın. Plakanın her kuyuya 100 mikrolitre aktarın.Ücretsiz KDM1A ELISA için, pbs streptavidin 10 mililitre her plaka için mililitre başına 10 mikrogram konsantrasyon olarak hazırlayın. Plakanın her kuyuya 100 mikrolitre aktarın. Daha sonra, yapıştırıcı film ile her plaka üst mühür ve dört derece santigrat gecede kuluçka.Ertesi gün, buzdolabından tabakları çıkarın ve yaklaşık 45 dakika oda sıcaklığında dengesağlar. Her plakayı yıkama tamponuyla üç kez yıkayın, her yıkama adımından sonra plakayı kağıt havlulara değdirerek artık çözümü çıkarın. Her iki plakanın her kuyusu için engelleme tampon 200 mikrolitre ekleyin.Üst yapışkan film ile plakaları mühür ve iki saat boyunca oda sıcaklığında kuluçka. Bu arada, uygun konsantrasyonp PBS ile daha önce elde edilen yerli protein özleri seyreltmek ve metin protokolünde belirtildiği gibi insan rKDM1A kullanarak standart bir eğri hazırlamak için plaka ortaya koyun. İki saatlik kuluçka süresi tamamlandıktan sonra, engelleme tamponunu atın ve plakaları yıkama tamponuyla yıkayın, her yıkama adımından sonra plakayı kağıt havluların üzerine dokunarak artık çözümü çıkarın.Metin protokolünün ikinci tablosunda bulunan plaka dağılımını takiben uygun seyreltilmiş numuneleri buzdolabında 96 derin kuyu depolama bloğuna aktarın. Metin protokolünün üçüncü tablosunda bulunan plaka dağılımını takiben, her biri 100 mikrolitreyi toplam ve serbest ELISA plakalarına pipetleme sırasında bu bloğu buz üzerinde tutun. Bir saat boyunca oda sıcaklığında kuluçka, sonra örnekleri atın ve yıkama tampon ile beş kez plakaları yıkayın.Mililitre başına 0,125 mikrogram konsantrasyonda tamponu bloke ederek 20 mililitre tavşan anti-KDM1A algılama antikorhazırlayın. Negatif kontrollere karşılık gelenler hariç, her iki plakanın her bir kuyusuna 100 mikrolitre algılama antikor çözeltisi ekleyin. Üst yapışkan film ile plakaları mühür ve bir saat oda sıcaklığında kuluçka.Bundan sonra, algılama antikor çözeltisi atın ve yıkama tampon ile altı kez plakaları yıkayın. İkincil keçi anti-tavşan antikor, HRP, bir 5, 000 engelleme tampon bir seyreltme için 25 mililitre hazırlayın. Mikrotiter plakaların her kuyusuna ikincil antikor çözeltisinin 100 mikrolitresini ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın.Bu kuluçka süresinin bitiminden 30 dakika önce, yumuşak ışık koşullarında kehribar şişesinde eşit miktarda luminol arttırıcı ve peroksit çözeltisini karıştırın. Bu karışımı oda sıcaklığında bırakın. Bir saatlik kuluçka tamamlandığında, ikincil antikor çözeltisini atın ve plakaları yıkama tamponuyla altı kez yıkayın.Daha sonra, pipet 100 luminol çalışma çözeltisi plakaların her bir kuyuiçin, kabarcık oluşumunu önlemek için çok yavaş pipet emin olun. Çözeltinin eklenmesi ile plakaların parlaklık ölçümü arasındaki süreyi kontrol etmek için bir zamanlayıcı kullanın ve iyi bir karşılıklı tekrarlanabilirlik elde etmek için bu zamanı sabit tutun. Kalan kabarcıkları ortadan kaldırmak için 500 kez G ve oda sıcaklığında 45 saniye boyunca yapışkan film ve santrifüj ile plakaları üst mühür.Bir dakika için 100 rpm bir plaka shaker plakaları kuluçka. Daha sonra yapışkan filmi çıkarın ve plakayı bir mikroplaka okuyucuya takın ve sıcaklığı 25 santigrat derecede sabitlemek için üç dakika bekletin. Her ELISA plaka titreşinin göreli parlaklık ünitelerini okuyun.Daha fazla analiz için ham RLU değerlerini ham veri elektronik tablosu dosyalarından kaydedin ve kopyalayın. Bu çalışmada, yeni bir KDM1A kemoprob yakalama tabanlı ELISA doğrudan hücre ve doku örneklerinde KDM1A hedef nişan ölçmek için kullanılır. Toplam ve serbest rKDM1A'nın RLU değerleri doğrusallığı doğrulamak için değerlendirilir.Üç bağımsız gönüllünün insan PBMC'lerinde tespit edilen toplam ve serbest KDM1A'nın RLU değerleri standart eğriye yerleştirilir. AML hücreleri sağlayıcı önerileri ne göre kültürlenir ve farklı konsantrasyonlarda araç veya ORY-1001 ile tedavi edilir. Yerli protein ekstresi 25 milimolar OG-881 kemoprob varlığında elde edilir ve toplam protein 0.5 mikrogram hedef nişan analizi gerçekleştirmek için kullanılır.Daha sonra toplam ve ücretsiz KDM1A belirlenir ve ORY-1001'in KDM1A'ya hedef katılım yüzdeleri araca göre hesaplanır. PBMCs ve ORY-1001 oral gavaj ile sıçanların akciğer tedavisinde doz duyarlı KDM1A hedef nişan, hesaplanan göreceli araç grubu burada gösterilmiştir. Tedavi edilen araçlardan alınan 25 nanomolar ORY-1001 akciğer proteini özünün bulunduğu ex vivo kuluçka, tam TE verir, ancak dört gün boyunca tedavi edilen sıçanlardan alınan numunelerde kilogram ORY-1001 başına 30 mikrogram ile TE'yi daha da artırmaz ve KDM1A'nın invivo olarak tamamen inhibe edildiğini doğrular.Bu protokol, kdm1A hedef katılımını ücretsiz ve toplam KDM1A ölçerek değerlendirir. Yerli protein ekstraksiyonu gerektirdiğini unutmayın. Bu teknik, belirli bir inhibitörü değerlendirmek için farklı türlerden örnekler de kullanılabilir, ayrıca yeni inhibitörleri taramak için.Bu çalışmada kullanılan kemoprob da KDM1A etkileşimçalışması için kemoproteomics için uygulanabilir. KDM1A inhibitörü gibi biyolojik numuneleri ve biyoaktif bileşikleri kullanırken güvenli bir şekilde çalışmayı ve her zaman önleyici tedbirlere saygı göstermeyi unutmayın.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Covalent Binding of Antibodies to Cellulose Paper Discs and Their Applications in Naked-eye Colorimetric Immunoassays

Selüloz Kağıt Diskler ve Çıplak göz Kolorimetrik İmmüno Onların Uygulamaları antikorların bağlama Kovalent

This report presents two methods for the covalent immobilization of capture antibodies on cellulose filter paper grade No. 1 (medium-flow filter paper) ...

Measurement of Basal and Forskolin-stimulated Lipolysis in Inguinal Adipose Fat Pads

İnguinal Yağ Yastıklarında Basal ve Forskolin ile uyarılmış Lipoliz Ölçümleri

Lipolysis is a process by which the lipid stored as triglycerides in adipose tissues are hydrolyzed into glycerol and fatty acids. This article describes ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

Bir endojen translasyonel modifikasyon profil hedef proteinler için tanımlamak için bir kapsamlı Immunoprecipitation zenginleştirme sistemi kullanan

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Simultaneous Measurement of Superoxide/Hydrogen Peroxide and NADH Production by Flavin-containing Mitochondrial Dehydrogenases

Süperoksit/hidrojen peroksit ve NADH üretim mitokondriyal Dehydrogenases Flavin içeren tarafından eş zamanlı ölçüm

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include ...

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

Doku çok az miktarda kullanarak Drosophila Permeabilized liflerinin mitokondrial oksijen harcama ölçme noktalar

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

A Direct Force Probe for Measuring Mechanical Integration Between the Nucleus and the Cytoskeleton

Çekirdek ve sitoiskeleti mekanik bütünleşmesi ölçmek için bir doğrudan kuvvet sonda

The mechanical properties of the nucleus determine its response to mechanical forces generated in cells. Because the nucleus is molecularly continuous ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Yüksek içeriği hedef nişan yapisan hücrelerdeki ölçmek için Imaging kullanarak

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Transkripsiyon faktörü-DNA bağlayıcı Affinities floresans mikroskobu kullanarak rekabet titrasyon tarafından yüksek hassasiyet ölçümü

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Cortisol Measurement in Koala (Phascolarctos cinereus) Fur

Cortisol Measurement in Koala Phascolarctos cinereus Fur

Koalak'da Kortizol Ölçümü (Phascolarctos cinereus) Kürk

Optimal methods of hormone extraction used to measure stress in animals across sample types are not always the same. Australia&#39;s iconic marsupial ...

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability DARTS assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

Rapamisin/mTOR etkileşimini incelemek için Yarı Kantitatif İlaç Affinity Responsive Target Stability (DARTS)

Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) is a robust method for detection of novel small molecule protein targets. It can be used to verify known ...