Name: nitropeptide profiling and identification illustrated by angiotensin ii
Uploaded: 2019-06-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II at JoVE.com

Эта работа была поддержана Американского онкологического общества институциональных исследований Грант IRG-14-195-01 (М. Шэрон Стек является главным исследователем; X.L. является следователем-субполучателем). Эта публикация стала возможной при частичной поддержке Грант номеров KL2 TR002530 и UL1 TR002529 (A. Shekhar, PI) от Национальных институтов здравоохранения, Национальный центр по продвижению трансляционных наук, клинических и трансляционных наук премии. X. L. является получателем Индиана CTSI KL2 Молодой следователь премии. S. F. поддерживается Фондом Уолтера Рака Продвижение основных грантов рака. X. W. поддерживается Национальным фондом естественных наук Общей программы Китая (Грант No 817773047).

1. Нитация Ангиотензина II
<ol><li>Для генерации нитированного пептида разбавьте 10 зл ангиотензина II (DRVYIHPF) в растворе 390 МЛ PBS (10 мм НаГ2PO4, 150 мМ NaCl, pH 7.4) при окончательной концентрации 50 мкм.</li>
	<li>Добавьте 10 зЛ пероксинитрита (200 мм в 4,7% NaOH) в раствор Ангиотензин II, чтобы сделать окон...

<ol>
	<li>Radi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide,+oxidants,+and+protein+tyrosine+nitration.">Nitric oxide, oxidants, and protein tyrosine nitration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4003-4008 (2004).</li><li>Radi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tyrosine+nitration:+biochemical+mechanisms+and+structural+basis+of+functional+effects.">Protein tyrosine nitration: biochemical mechanisms and structural basis of functional effects.</a> Accounts of Chemical Research. 46, 550-559 (2013).</li><li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-induced+fragmentation+of+leucine+enkephalin,+nitro-Tyr-leucine+enkaphalin,+and+d5-Phe-nitro-Tyr-leucine+enkephalin.">MALDI-induced fragmentation of leucine enkephalin, nitro-Tyr-leucine enkaphalin, and d5-Phe-nitro-Tyr-leucine enkephalin.</a> Int. J Mass Spectrometry. 287, 77-86 (2009).</li><li>Batthy&#225;ny, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine-Nitrated+Proteins:+Proteomic+and+Bioanalytical+Aspects.">Tyrosine-Nitrated Proteins: Proteomic and Bioanalytical Aspects.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 26, 313-328 (2017).</li><li>Feeney, M. B., Sch&#246;neich, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+approaches+to+analyze+protein+tyrosine+nitration.">Proteomic approaches to analyze protein tyrosine nitration.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 19, 1247-1256 (2013).</li><li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitroproteins+from+a+human+pituitary+adenoma+tissue+discovered+with+a+nitrotyrosine+affinity+column+and+tandem+mass+spectrometry.">Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 354, 279-289 (2006).</li><li>Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+analysis+of+nitrotyrosine-containing+proteins.">Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins.</a> Mass Spectrometry Reviews. 34, 423-448 (2015).</li><li>Abello, N., Barroso, B., Kerstjens, H. A. M., Postma, D. S., Bischoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+labeling+and+enrichment+of+nitrotyrosine-containing+peptides.">Chemical labeling and enrichment of nitrotyrosine-containing peptides.</a> Talanta. 80, 1503-1512 (2010).</li><li>Chiappetta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+identification+of+protein+nitration+sites.">Quantitative identification of protein nitration sites.</a> Proteomics. 9, 1524-1537 (2009).</li><li>Dekker, F., Abello, N., Wisastra, R., Bischoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+and+detection+of+tyrosine-nitrated+proteins.">Enrichment and detection of tyrosine-nitrated proteins.</a> Current Protocols in Protein Science. , (2012).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+selective+enrichment+and+analysis+of+nitrotyrosine-containing+peptides+in+complex+proteome+samples.">A method for selective enrichment and analysis of nitrotyrosine-containing peptides in complex proteome samples.</a> Journal of Proteome Research. 6, 2257-2268 (2007).</li><li>Feng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid-derived+suppressor+cells+inhibit+T+cell+activation+through+nitrating+LCK+in+mouse+cancers.">Myeloid-derived suppressor cells inhibit T cell activation through nitrating LCK in mouse cancers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, 10094-10099 (2018).</li><li>Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+peptide+stable+isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics.">Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Nature Protocol. 4, 484-494 (2009).</li></ol>

В протоколе описано обогащение нитропептида и профилирование. Используя Angiotensin II в качестве модели пептида, мы проиллюстрировали процедуру, показанную на рисунке 1. После получения нитро-ангиотензина II, первичный амин на пептид должен быть заблокирован, чтобы избежать ?...

Нитирование остатков тирозина в белках для формирования 3-нитротирозин регулирует многие биологические процессы. Из-за различных химических свойств между тирозином и 3-нитротирозин, нитарный белок может иметь возмущенный сигнальной активности1,2. Поэтому важно разработать методы, которые могут обогащать и идентифицировать места нитроации на белках эффективно. Как 3-нитротирозин является низким изменением изобилия на белки по сравнению с другими формами ПТМ, таких как фосфорилирование и ацетилирование, это сложно определить эндогенных нитрационных участков непосредственно из клеточных линий или образцов тканей. Тем не менее, была разработана методология использования масс-спектрометрии (МС) для характеристики фрагментации нитропептида (например, «Чжан энд Десидерио 3»), которая закладывает основу для новых методов нитропротеомики.
В настоящее время, шаг по обогащению следуют MS является наиболее мощной стратегией для нитропептида профилирования4,5. Методы обогащения можно разделить на два класса. Один класс основан на антителах, которые могут распознавать 3-нитротирозин в частности, в то время как другой класс основан на химической производной, что снижает нитро группы амин группы4,5. Для антител на основе метода, нитротирозин сродство колонка используется для обогащения, из которого eluted материал далее решается и анализируется с высоким разрешением MS6,7. Для химического метода, основанного на производной, группы амина в N-терминах пептида или лизин должен быть заблокирован в первом шаге либо ацетилированием, изобариатом теги для относительной и абсолютной количественной оценки (iTRA)), или тандемных масс-тегов (TMT) реагентов. Далее, редуктор используется для уменьшения нитротирозин аминотирозин с последующим изменением вновь сформированной группы амина, которая включает в себя перевязку биотина, сульфидрявшее пептид преобразования, или другие типы систем пометки8,9, 10,11. Большинство установленных до сих пор протоколов основаны на сверхнитированных белках in vitro, а не на эндогенно нитированных белках.
В настоящем исследовании разработана модифицированная процедура химического произввода нитротирозина для обогащения и идентификации нитропептида, которая показывает повышенную чувствительность при обнаружении рассеянного склероза и подходит для целей количественной оценки. Наше недавнее исследование, используюемое этот метод в биологических системах, показало, что нитрация лимфоцитов специфического белка тирозина киназы (LCK) на Tyr394 RNS, произведенная из миелоидных супрессоров (MDSCs), играет важную роль в иммуносупрессии опухолевой микросреды12. Поэтому наш метод идентификации нитропептида может быть применен и к сложным биологическим образцам. Здесь мы описываем наш протокол с помощью модели пептида Angiotensin II, из которых фрагментация картина известна и широко используется в нитропротеомических исследований8,9,10,11, в качестве примера.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:756px;" width="756">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20">Acclaim pepmap 100 C18 column</td>
			<td style="width:197px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">164534</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">1 M TEAB solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">50% hydroxylamine</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>90115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">Acetonitrile</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A955</td>
			<td>MS Grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td>Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22">formaldehyde-D2</td>
			<td>Toronto Research Chemicals</td>
			<td>F691353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22">formic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>695076</td>
			<td>ACS reagent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22">Fusion Lumos mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">isoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">Methanol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A456</td>
			<td>MS Grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">NHS-S-S-bition</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>21441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">Oasis HLB column (10 mg)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186000383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">peroxynitrite</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>516620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">sodium cyanoborohydrite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>42077</td>
			<td>PhamaGrade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">sodium dithionate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>157953</td>
			<td>Technical Grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">Streptavidin Sepharose</td>
			<td>GE Healcare</td>
			<td>GE17-5113-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20">Ultimate 3000 nanoLC</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nitropeptide profiling and identification illustrated by angiotensin ii

Нитрирование белка является одним из наиболее важных посттрансляционных модификаций (ПТМ) на тирозиновых остатках и может быть вызвано химическими действиями реактивных видов кислорода (ROS) и реактивных видов азота (RNS) в эукариотических клетках. Точное выявление участков нитации на белках имеет решающее значение для понимания физиологических и патологических процессов, связанных с нитрационной этилации белка, таких как воспаление, старение и рак. Поскольку нитовые белки имеют низкое изобилие в клетках даже в индуцированных условиях, не были разработаны универсальные и эффективные методы для профилирования и идентификации участков нитрационации белка. Здесь мы описываем протокол для обогащения нитропептида с помощью реакции химического сокращения и биотина маркировки, а затем высокого разрешения масс-спектрометрии. В нашем методе производные нитропептида можно отождествлять с высокой точностью. Наш метод обладает двумя преимуществами по сравнению с ранее заявленными методами. Во-первых, диметиловая маркировка используется для блокирования первичного амина на нитропептидах, которые могут быть использованы для получения количественных результатов. Во-вторых, для обогащения используется дисульфидная связь, содержащая реагент NHS-biotin, которая может быть дополнительно уменьшена и аклинила для усиления сигнала обнаружения на масс-спектрометре. Этот протокол был успешно применен к модели пептида Angiotensin II в текущем документе.

Диаграмма потока для нитропептида профилирования в этой рукописи показана на рисунке 1. Нарисунке 2, 3, 4 и 5 показаны масс-спектры Ангиотензина II, нитро-ангиотензина II, диметила с маркировкой нитро-ангиотензин II и диметил помече?...

Watch this Scientific Journal Video about Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II at JoVE.com

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

НитропептидНое профилирование и идентификация Иллюстрировано Ангиотензином II

Протеомное профилирование тирозиновых белков было сложной техникой из-за низкого обилия 3-нитротирозиновой модификации. Здесь мы описываем новый подход к обогащению нитропептида и профилированию с помощью Angiotensin II в качестве модели. Этот метод может быть расширен для других систем in vitro или in vivo.

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Это сообщение, которое может помочь ответить на ключевые вопросы о том, как обогатить и определить нитропептиды с помощью химического подхода и масс-спектрометрии. Этот метод имеет повышенную чувствительность для обнаружения нитропептидов с помощью масс-спектрометрии и который может быть применен как к биохимическим системам in vitro, так и к эндогенным биологическим тканям. Для десалирования нитро-ангиотензина II используйте одноми миллилитрную трубу для предварительного извлечения твердой фазы обратной фазы или столбца SPE с добавлением 500 микролитров метанола и 500 микролитров воды в верхнюю часть колонны.Когда вся вода проехает через колонну, загрузите на колонну 410 микролитров раствора нитроангиотензина II. Вымойте колонку с 500 микролитров 5%метанола и воды и 300 микролитров 80% метанола и воды, чтобы утоить нитропептида. Затем высушите элуат по скорости вакуума в настройке по умолчанию при комнатной температуре.Для первичной алкиляции амина, восстановить порошкообразный нитро-ангиотензин II в 100 микролитров 100 миллимолярный триэтиламмоний бикарбонатный раствор и добавить 400 микролитров 4%формальдегида к раствору в дым капот с кратким смешивания. Затем добавьте четыре микролитера 0,6 молярного цыаноборогидрида к раствору при встряхивании при 400 вращениях в минуту в течение одного часа при комнатной температуре. В конце инкубации утоляют реакцию маркировки 16 микролитров 1%аммиачного раствора в течение пяти минут при комнатной температуре с последующим подкислением с восемью микролитерами кремной кислоты.Затем опреснюете решение в новой колонке SPE обратной фазы, как это было продемонстрировано. Для сокращения нитротирозина до аминотирозина, воссоздайте диметил-маркированную нитроангиотензин II в 500 микролитров PBS и добавьте 10 микролитров одного дитионата натрия в течение одного часа инкубации при комнатной температуре. После снижения реакции, желтый раствор станет ясно.Опустить уменьшенную выборку в новой колонке SPE обратной фазы, как это было продемонстрировано. Для биотинилирования и обогащения, восстановить диметил-маркированных аминоангиотензина II в 500 микролитров PBS следуют добавление пяти микролитров 40 наномолярных NHS-S-S биотин растворяется в диметил сульфоксид в течение двух часов инкубации при комнатной температуре. В конце инкубации, утолить реакцию с одним микролитером 5%гидроксиламина и добавить 500 микролитров свежего PBS до 100 микролитров Streptavidin Agarose бусы для эквилибрации тремя отдельными центрифугами.После последней центрифугации добавьте 100 микролитров бисера в систему реакции в течение одного часа инкубации на Ротари Шейкер при комнатной температуре. В конце инкубации, мыть систему четыре раза с 500 микролитров свежего PBS за стирку с последующим добавлением 400 микролитров 10 миллимолярный дитиотрейтол в течение 45 минут инкубации при 50 градусов по Цельсию. В конце инкубации, спина вниз по колонке и передачи супернатанта в новую трубку, содержащую 20 микролитров 0,5 молярного иодоацетамида в течение 20 минут инкубации в темноте.Затем опреснють раствор в новой обратной фазе SPE колонки, как попродемонстрировано и решить сухой пептид в 20 микролитров 0,1% formic кислоты. Для обнаружения загрузите продукт на жидкий хроматограф с тандемным масс-спектрометром. Разделите модифицированные пептиды ангиотензина II на 60-минутный градиентный элюзион со скоростью потока 0,3 микролитера в минуту с системой жидкой хроматографии высокого давления, которая непосредственно взаимодействует с масс-спектрометром высокого разрешения.В режиме получения данных, зависящих от данных, установите единый полный спектр массы сканирования в масс-спектрометре, а затем 20 зависящих от данных тандемных масс-спектрометров сканируют на 28% нормализованной энергии столкновения. Затем откройте данные о массовых спектрах и определите пики продукта на каждом шагу, чтобы подтвердить, что химическая реакция была успешно выполнена. Здесь можно наблюдать репрезентативные массовые спектры ангиотензина II до и после каждой химической модификации, как это было продемонстрировано.Молекулярный вес соединения указывается значениями соотношения массы к заряду моноизотопного пика, что указывает на то, что химическая модификация ангиотензина II была успешно достигнута для этого шага. Здесь показан конечный продукт, который обнаруживается и характеризуется жидкой хроматографией с тандемной масс-спектрометрией. Количественный анализ нитропептидов с помощью диметил-маркировки позволяет вычислить относительное количество света и тяжелых путем сравнения интенсивности моноизотопного пика в каждой группе, что позволяет количественно оценить обогащенные нитопептиды из разных групп.Следуя процедуре, вы можете использовать поисковую систему программы, такую как максимальный отсчет ФСИН, чтобы определить потенциальные нитропептиды. После своего развития, эта техника проложила путь для начала биологических функций конкретных нитратных участков.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Идентификация малая молекула-связывающих белков в нативной клеточной среде с помощью Live-клеток фотоаффинное мечение

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Разрешающая Affinity Очищенная Белковые комплексы от Синей Native ПААГ и белка корреляции профилирование

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Глубокая протеома профилирование Изобарический маркировки, обширные жидкостная хроматография, масс-спектрометрии и при содействии программного обеспечения количественной оценки

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Геном широкий количественная оценка перевода в многообещающий дрожжей рибосома профилирования

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Полисома профилирование лейшманий, клетки человека и мыши яичка

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Идентификация Циклин зависимая киназа 1 сайты конкретных фосфорилирование киназы в Vitro пробирного

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

Захват и идентификации RNA-связывая протеинов с помощью щелчка при содействии химия РНК interactome захвата (ЦАРСКОЕ) стратегии

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods

Выявление ортексин и эндоканнабиноидных рецепторов у взрослых зебрафиш с использованием иммунопероксидаза и иммунофлуоресценции Методы

Immunohistochemistry (IHC) is a highly sensitive and specific technique involved in the detection of target antigens in tissue sections with labeled ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

Распознавание последовательности ДНК с помощью высокопроходимых профилирований primase

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Высокое разрешение Комплекс Профилирование криосликинг BN-MS Анализ

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...