Name: a labor-saving and repeatable touch-force signaling mutant screen protocol for the study of thigmomorphogenesis of a model plant arabidopsis thaliana
Uploaded: 2019-08-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana at JoVE.

Denne undersøgelse blev støttet af følgende tilskud: 31370315, 31570187, 31870231 (National Science Foundation of China), 16100318, 661613, 16101114, 16103615, 16103817, AoE/M-403/16 (RGC af Hongkong). Forfattere vil gerne takke Ju Feng Precision og Automation Technology Limited (Shenzhen, Kina) for deres tilbud af flere skemaer vist i figur 1.
Forfattere vil også gerne takke S. K. Cheung og W. C. Lee for deres bidrag til udviklingen af touch-Force lastning maskine.

1. klargøring af frø
Bemærk: Arabidopsis frø af både vildtype (Col-0) samt mkk1 og mkk2 tab-of-funktion mutanter blev købt fra ARABIDOPSIS biologisk ressource Center (ABRC, https://www.Arabidopsis.org, Columbus, OH).
<ol><li>Beregn, hvor mange plante individer af hver genotype der skal anvendes til en pålidelig statistisk analyse. Forbered et tilstrækkeligt antal frø baseret på spire hastigheden af hver linje, normalt 4-5 gange mere end hvad der er nødve...

<ol>
	<li>Jaffe, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thigmomorphogenesis:+the+response+of+plant+growth+and+development+to+mechanical+stimulation+with+special+reference+to+Bryonia+dioica.">Thigmomorphogenesis: the response of plant growth and development to mechanical stimulation with special reference to Bryonia dioica.</a> Planta. 114, 143-157 (1973).</li><li>Vandenbrink, J. P., Kiss, J. Z., Herranz, R., Medina, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+and+gravity+signals+synergize+in+modulating+plant+development.">Light and gravity signals synergize in modulating plant development.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 563 (2014).</li><li>Hashiguchi, Y., Tasaka, M., Morita, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+higher+plant+gravity+sensing.">Mechanism of higher plant gravity sensing.</a> American Journal of Botany. 100, 91-100 (2013).</li><li>Salisbury, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Flowering Process. , (1963).</li><li>Darwin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Power of Movement in Plants. , (1881).</li><li>Chehab, E. W., Eich, E., Braam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thigmomorphogenesis:+a+complex+plant+response+to+mechano-stimulation.">Thigmomorphogenesis: a complex plant response to mechano-stimulation.</a> Journal of Experimental Botany. 60, 43-56 (2008).</li><li>Telewski, F. W., Jaffe, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thigmomorphogenesis:+anatomical,+morphological+and+mechanical+analysis+of+genetically+different+sibs+of+Pinus+taeda+in+response+to+mechanical+perturbation.">Thigmomorphogenesis: anatomical, morphological and mechanical analysis of genetically different sibs of Pinus taeda in response to mechanical perturbation.</a> Physiologia Plantarum. 66, 219-226 (1986).</li><li>Vogel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+precision+measurements+of+radial+increment+in+a+mature+spruce+stand+and+interpretation+variants+of+short+term+changes+in+increment+values.">Automatic precision measurements of radial increment in a mature spruce stand and interpretation variants of short term changes in increment values.</a> Allgemeine Forst-und Jagdzeitung. , (1994).</li><li>Braam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+touch:+plant+responses+to+mechanical+stimuli.">In touch: plant responses to mechanical stimuli.</a> New Phytologist. 165, 373-389 (2005).</li><li>Jaffe, M. J., Leopold, A. C., Staples, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thigmo+responses+in+plants+and+fungi.">Thigmo responses in plants and fungi.</a> American Journal of Botany. 89, 375-382 (2002).</li><li>Telewski, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unified+hypothesis+of+mechanoperception+in+plants.">A unified hypothesis of mechanoperception in plants.</a> American Journal of Botany. 93, 1466-1476 (2006).</li><li>Guti&#233;rrez, R. A., Ewing, R. M., Cherry, J. M., Green, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+unstable+transcripts+in+Arabidopsis+by+cDNA+microarray+analysis:+rapid+decay+is+associated+with+a+group+of+touch-and+specific+clock-controlled+genes.">Identification of unstable transcripts in Arabidopsis by cDNA microarray analysis: rapid decay is associated with a group of touch-and specific clock-controlled genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11513-11518 (2002).</li><li>Lee, D., Polisensky, D. H., Braam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+touch-and+darkness-regulated+Arabidopsis+genes:+a+focus+on+calmodulin-like+and+XTH+genes.">Genome-wide identification of touch-and darkness-regulated Arabidopsis genes: a focus on calmodulin-like and XTH genes.</a> New Phytologist. 165, 429-444 (2005).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+functional+posttranslational+modification+proteomics+reveals+that+TREPH1+plays+a+role+in+plant+touch-delayed+bolting.">Quantitative and functional posttranslational modification proteomics reveals that TREPH1 plays a role in plant touch-delayed bolting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences United States of America. 115, 10265-10274 (2018).</li><li>Hamilton, E. S., Schlegel, A. M., Haswell, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=United+in+diversity:+mechanosensitive+ion+channels+in+plants.">United in diversity: mechanosensitive ion channels in plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 66, 113-137 (2015).</li><li>Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+plant+aequorin+reports+the+effects+of+touch+and+cold-shock+and+elicitors+on+cytoplasmic+calcium.">Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium.</a> Nature. 352, 524 (1991).</li><li>Toyota, M., Furuichi, T., Tatsumi, H., Sokabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+calcium+increases+in+response+to+changes+in+the+gravity+vector+in+hypocotyls+and+petioles+of+Arabidopsis+seedlings.">Cytoplasmic calcium increases in response to changes in the gravity vector in hypocotyls and petioles of Arabidopsis seedlings.</a> Plant Physiology. 146, 505-514 (2008).</li><li>Knight, M. R., Smith, S. M., Trewavas, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wind-induced+plant+motion+immediately+increases+cytosolic+calcium.">Wind-induced plant motion immediately increases cytosolic calcium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 4967-4971 (1992).</li><li>Braam, J., Davis, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rain-,+wind-,+and+touch-induced+expression+of+calmodulin+and+calmodulin-related+genes+in+Arabidopsis.">Rain-, wind-, and touch-induced expression of calmodulin and calmodulin-related genes in Arabidopsis.</a> Cell. 60, 357-364 (1990).</li><li>Chehab, E. W., Yao, C., Henderson, Z., Kim, S., Braam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+touch-induced+morphogenesis+is+jasmonate+mediated+and+protects+against+pests.">Arabidopsis touch-induced morphogenesis is jasmonate mediated and protects against pests.</a> Current Biology. 22, 701-706 (2012).</li><li>Telewski, F. W., Pruyn, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thigmomorphogenesis:+a+dose+response+to+flexing+in+Ulmus+americana+seedlings.">Thigmomorphogenesis: a dose response to flexing in Ulmus americana seedlings.</a> Tree Physiology. 18, 65-68 (1998).</li><li>De Vylder, J., Vandenbussche, F. J., Hu, Y., Philips, W., Van Der Straeten, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosette+tracker:+an+open+source+image+analysis+tool+for+automatic+quantification+of+genotype+effects.">Rosette tracker: an open source image analysis tool for automatic quantification of genotype effects.</a> Plant Physiology. , (2012).</li><li>Clark, T., Bradburn, M., Love, S., Altman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+analysis+part+I:+basic+concepts+and+first+analyses.">Survival analysis part I: basic concepts and first analyses.</a> British Journal of Cancer. 89, 232 (2003).</li><li>Bradburn, M. J., Clark, T. G., Love, S., Altman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+analysis+part+II:+multivariate+data+analysis&#8211;an+introduction+to+concepts+and+methods.">Survival analysis part II: multivariate data analysis&#8211;an introduction to concepts and methods.</a> British Journal of Cancer. 89, 431 (2003).</li><li>Jaffe, M., Forbes, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thigmomorphogenesis:+the+effect+of+mechanical+perturbation+on+plants.">Thigmomorphogenesis: the effect of mechanical perturbation on plants.</a> Plant Growth Regulation. 12, 313-324 (1993).</li><li>Kutschera, U., Niklas, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+plant+physiology:+Charles+Darwin&#8217;s+forgotten+synthesis.">Evolutionary plant physiology: Charles Darwin&#8217;s forgotten synthesis.</a> Naturwissenschaften. 96, 1339 (2009).</li></ol>

Thigmomorphogenesis er en kompleks plantevækst respons mod mekaniske forstyrrelser, som involverer et netværk af cellulære signalering og handling af Phytohormoner. Det er en konsekvens af adaptiv udvikling af planter til at overleve under de uønskede miljømæssige betingelser25,26. Mekanisk berøring, især menneskelig fingerberøring og håndholdt vatpind touch, er blevet udvalgt til at studere denne morfologiske ændringer i tidligere thigmomorfogenetiske...

Plant thigmomorphogenesis er et begreb, der blev opfundet af Jaffe, MJ i 19731. Det er en plante tropisme, men adskiller sig fra den velkendte foto tropisme eller gravitropisme forårsaget af stimuli af sollys eller tyngdekraften2,3. Det beskriver fænotypiske ændringer i forbindelse med periodiske mekaniske stimuleringer, som ofte er observeret af botanikere i tidligere tider4,5. Regndråber, vind, plante, dyr og menneskelige rører, selv animalske bid, er alle anses for at være forskellige typer af mechano-stimuli, der udløserkraften signalering i planter4,5. Karakteristik af planten thigmomorphogenesis omfatter forsinkelsen af bolte, en kortere stilk, mindre Rosette/blad størrelse i urteagtige planter, og tykkere stilk i træagtige planter6,7,8. Dette er i modsætning til den thigmonastiske eller thigmotropic respons ofte findes i Mimosa planten eller andre mechano-følsomme vinstokke, hvor disse hurtige touch svar er lettere at blive observeret1,9,10. Thigmomorphogenesis, på den anden side, er relativt vanskeligt at blive observeret på grund af sin langsomme vækst respons. Thigmomorphogenesis observeres normalt efter uger eller endda år af kontinuerlig kraft-loading stimulation. Denne unikke karakter af Plant touch respons gør det vanskeligt at udføre en fremad genetisk skærm ved hjælp af menneskelig hånd touch stimulation for at isolere touch-Force signalering resistente mutanter på en robust måde.
For at belyse kraft signaltransduktionsvejene og de molekylære mekanismer, der lå til grund for den thigmomorfogenese6,11, molekylære og cellulære biologiske eksperimenter er blevet udført i de sidste6, 12,13,14. Disse undersøgelser har foreslået, at kraft signal receptorerne hovedsageligt består af mekaniske Ionkanaler (msc) og de tøjerede MSC komplekser komponeret af multimeriske komplekser af membran-spænder proteiner11,14 , 15. cytoplasmatiske ca2 + forbigående Spike genereret inden for sekunder af den første berøring. Vind-, regn-eller gravi-stimulation kan interagere med downstream-calcium følerne for at overføre kraft signalerne til nukleare begivenheder14,16,17,18. Ud over molekylære og cellulære undersøgelser har den fremad genetiske skærm med manuel fingerberøring af planterne fundet, at Phytohormoner og de sekundære metabolitter er involveret i det deraf følgende berørings inducerbare (TCH) genekspression efter Tryk-kraft lastning13,19. For eksempler, AOS og opr320 mutanter er blevet identificeret hidtil fra de genetiske undersøgelser. Men det store problem i forbindelse med anvendelsen af Forward genetik i studiet af thigmomorphogenesis er stadig den intensive arbejdskraft, der kræves for at kvantitere niveauet af touch respons og røre en stor population af genetisk muteret individuelle planter. Den tidskrævende problem fortsætter også i den hånd rørende-baserede mutant skærm14,20. For et eksempel, for at fuldføre en runde af touch-Force stimulation, en person skal røre 30-60 gange (One touch per sekund) på en individuel plante. For at have tilstrækkeligt mange anlæg til statistisk fænotype analyse, 20-50 individuelle planter af samme genotype er normalt kræves for touch-kraft lastning proces. Denne touch-Force loading regime betyder, at en person har brug for at repetitivt udføre 600-3000 rører på en genotype valg. Denne type berøring skal normalt gentages 3 til 5 runder om dagen, hvilket svarer til ca. 1800-15000 fingre eller vatpind berøringer pr. dag pr. genotype af planter. En veluddannet person er normalt forpligtet til at opretholde styrken og kraften af flere berøringer inden for et ønskværdigt område i løbet af mange runder af gentagelser på en dag for at undgå den store variation i kraft og styrke. Da det er velkendt, at thigmomorphogenesis er en mætbar og dosis-afhængig proces6,21, trykkraft/styrke bliver afgørende for en succes i udløser touch respons af en plante.
For at fjerne den person afhængige berørings kraft lastning og for at opretholde mekanisk anvendelse inden for et acceptabelt fejlområde14, vi derfor designet en automatisk touch-kraft lastning maskine til at erstatte de hånd-manipulerede rører. Maskinen har 4 bevægelige arme bygget, som hver er udstyret med en menneskelig hårbørste. Denne version hedder model K1 at specificere sin funktion af menneskehår touch-kraft lastning. Hvis 4 genotyper måles kvantitativt for deres thigmomorfogenesis eller berørings respons under én maskine, kan 40-48 individer pr. genotype måles. Hver runde af berøring gentagelse (mindre end 60 gange af berøring pr. plante) varer mindre end 5 minutter ved hjælp af en bevægelige hastighed justerbar robot arm. Således kan planter på en model K1 touch Machine mekanisk stimuleres til flere runder om dagen enten med en konstant touch-kraft lastning eller forskellige niveauer af styrker som oprindeligt programmeret.
Arabidopsis thaliana, en model plante organisme, blev derfor valgt som målet plantearter til afprøvning af fuldautomatisk hår touch-kraft lastning maskine ansøgning. Fordi der er flere store Seedbanks til rådighed for at hente de forskellige germplasms af mutanter og størrelsen af blomstring, Arabidopsis passer godt til den plads til rådighed i vækst hylden monteret med modellen K1 touch Machine.
Modellen K1 automatiske berørings maskine består af tre hovedkomponenter: (1) H-form metal stativet består af to bælte drevne lineære aktuatorer, (2) robot metal arme udstyret med hårbørster, og (3) en controller. For en tilpasset model K1 touch Machine er hvert X/Y-akse modul sammensat af en bælte styret føringsskinne, to glide blokke (rød) og 1 57 stepper motor (pre-installeret og afmonterbar) (figur 1a,B). Den øvre vandrette aktuator gør det muligt for robot metalarmen at bevæge sig til venstre og højre vandret, og den nedre lodrette bælte drevne aktuator gør det muligt for robot metalarmen at bevæge sig op og ned lodret (figur 1B, figur 2A ). Der blev installeret fire umonterbare robotarme på den lodrette aktuator (figur 1C, figur 2B). Fire menneskehår børster var bundet til fire robotarme henholdsvis (figur 1C, figur 2B). Alle mekaniske dele til at konstruere modellen K1 touch Machine i fed skrift nedenfor er markeret i figur 1C (også se tabellen over materialer).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1141px;" width="1140">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">4 hair brushes</td>
			<td style="width:393px;"></td>
			<td style="width:149px;">customized</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">4 robot arms with one holder</td>
			<td style="width:393px;"></td>
			<td style="width:149px;">customized</td>
			<td>1000 mm length holder and 560 mm length robot arm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">57 stepper motor</td>
			<td style="width:393px;"></td>
			<td style="width:149px;">57HS22-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">All purpose potting soil</td>
			<td style="width:393px;">Plantmate, Hong Kong</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Arabidopsis plant seeds</td>
			<td style="width:393px;">Arabidopsis Biological Resource Centers, Columbus, OH</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>For arabidopsis seed purchase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">BIO-MIX potting substratum</td>
			<td style="width:393px;">Jiffy Products International BV, the Netherlands</td>
			<td style="width:149px;">1000682050</td>
			<td>Two soils were mixed together to grow Arabidopsis. The ratio of All purpos potting soil and&#160; BIO-MIX is 1:2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">IL 1700 research radiometer</td>
			<td style="width:393px;">International Light, Newburyport, MA</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>The light intensity of both full-wavelength and photosynthetic active radiation can be measured.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">ImageJ</td>
			<td style="width:393px;">https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Free downloaded software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Ju Feng Precision and Automation Technology Limited</td>
			<td style="width:393px;">Shenzhen, China</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>For belt-driven linear actuators and other mechanical modules purchase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Junction plate of the slide block</td>
			<td style="width:393px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>To fix the Y guide-rail module or Y auxiliary girder onto backs of slide blocks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Junction plate of the X axis module</td>
			<td style="width:393px;"></td>
			<td style="width:149px;">customized</td>
			<td>To connect the X guide-rail module and X auxiliary girder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Slide block</td>
			<td style="width:393px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">WDT4045 X axis guide-rail module</td>
			<td style="width:393px;"></td>
			<td style="width:149px;">843 mm, customized</td>
			<td>Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:375px;">WDT4045 Y axis guide-rail module</td>
			<td style="width:393px;"></td>
			<td style="width:149px;">1038 mm, customized</td>
			<td>Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">X axis auxiliary girder</td>
			<td style="width:393px;"></td>
			<td style="width:149px;">843 mm, customized</td>
			<td>Pre-installed with two slide blocks</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:375px;">Y axis auxiliary girder</td>
			<td style="width:393px;"></td>
			<td style="width:149px;">1038 mm, customized</td>
			<td>Pre-installed with two slide blocks</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a labor-saving and repeatable touch-force signaling mutant screen protocol for the study of thigmomorphogenesis of a model plant arabidopsis thaliana

Planter reagerer på både intracellulære og ekstracellulære mekaniske stimuleringer (eller Force-signaler) og udvikle særlige morfologiske ændringer, en kaldet thigmomorphogenesis. I de seneste årtier er flere signalerings komponenter blevet identificeret og rapporteret for at være involveret i mekanisering (f. eks. calcium-ion bindende proteiner og jasmoninsyre-biosyntese enzymer). Men den relativt langsomme forskning i studiet af force signalering eller thigmomorphogenesis er i vid udstrækning tilskrives to grunde: kravet om omstændelig menneskelig hånd-manipuleret touch induktion af thigmomorphogenesis og Force Strength fejl forbundet med folks hånd-touch. For at øge effektiviteten af ekstern kraft lastning på en plante organisme, en automatisk touch-Force lastning maskine blev bygget. Denne robot arm-drevne hårbørste rører giver en arbejdsbesparende og let gentagelig touch-Force simulation, ubegrænset runder af touch gentagelse og justerbar touch styrke. Denne hår touch-kraft lastning maskine kan bruges til både storstilet screening af touch-Force signalering mutanter og fænomics undersøgelse af plante thigmomorphogenesis. Hertil kommer, touch materialer såsom menneskehår, kan erstattes med andre naturlige materialer som animalsk hår, silketråde og bomuld fibre. De automatiserede bevægelige arme på maskinen kan være udstyret med vand overbrusning dyser og luftblæsere til at efterligne de fysiske kræfter i regn dråber og vind, hhv. Ved at bruge denne automatiske hår touch-kraft lastning maskine i kombination med hånd-udført bomuld vatpind rørende, har vi undersøgt touch respons af to kraft signalering mutanter, MAP kinase kinase 1 (MKK1) og MKK2 planter . Fænomerne af touch-Force loaded vilde type planter og to mutanter blev evalueret statistisk. De har udstillet betydelige forskelle i touch respons.

Den automatiske hår touch-kraft lastning maskine Til observation af morfologiske ændringer på planter, både de reproducerbare vækstbetingelser og behandlingsmetoder er nøglen til at opnå gentagelig resultater. Denne high-gennemløb og automatisk touch-Force signalering mutant screening opnås ved den nybyggede hår touch-kraft lastning maskine, model K1 (figur 1, figur 2). Disse hårbørster kan røre maksimalt 4 bakker af planter samt...

Watch this Scientific Journal Video about A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana at JoVE.

A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana

En arbejdsbesparende og gentagelig touch-Force Signaling mutant Screen protokol til studiet af Thigmomorphogenesis af en model plante Arabidopsis thaliana

En blid touch-Force loading maskine er bygget af menneskehår børster, robotarme og en controller. Hårbørster er drevet af robotarme installeret på maskinen og bevæge sig periodisk for at anvende touch-kraft på planter. Styrken af maskindrevne hårberøringer kan sammenlignes med de manuelt anvendte berøringer.

Plants responding to both intracellular and extracellular mechanical stimulations (or force signals) and develop special morphological changes, a called ...

Vi bygger en automatisk touch force maskine til at observere anlægget signal morfogenese. Den robot arme jeg installeret med menneskehår børster til at anvende blid touch kraft på planter. I sammenligning med menneskelige finger touch, den automatiske menneskelige hår touch maskine kan tilbyde mere arbejdskraft besparelse, en ensartet touch kraft belastning.Den tid, der kræves for en runde af kraft belastning kan begrænses inden for flere minutter. Sammenlignet med flere timers fingerberøring og en vatpindsberøring kan robotmaskinen i høj grad forbedre forskningen i plantekantil respons. Ved at øge effektiviteten og populationen af behandlede planter forventer vi, at den automatiske berøringsmaskine vil blive anvendt på fire signallydbilleder og de merkantile responsundersøgelser hos både planter og dyr.Til at begynde, teste spiring sats af hver genotype efter pleje frø på en 8% agar plade med MS medium i syv dage. Ifølge spiring sats, forberede frø fire til fem gange mere end det ønskede antal planter, der skal produceres. Fordyb frø i koldt vand i 1,5 milliliter plastrør og dække med aluminiumsfolie til at holde i mørke.Opbevares ved fire grader celsius for frø imbibition. Fem til syv dage efter imbibition, vælge den relevante jord til plantevækst. Undgå store klumper og bruge en gaffel til at blande dem homogent.Forbered 24 207 milliliter plast kopper med en øvre kant diameter på 7,4 centimeter. Bor tre runde huller i bunden af kopperne til kunstvanding. Fyld disse plastik kopper med blandet jord.Lad jorden hober sig op til omkring en centimeter højere end kopfælgen og brug en lineal til at flade overfladen af den stablede jord blødt. Overfør 24 kopper i en plastikbakke. Indstil lysintensiteten af vækstkammeret mellem 180 og 240 mikroeinstein pr. sekund pr. kvadratmeter, hvilket er højere end den fotosyntetiske aktive stråling for planternes hurtige vækst.Indstil lystilstanden til at være 24 timer konstant. Indstil temperaturen i vækstkammeret på en 23,5 plus eller minus 1,5 grader celsius og fugtighed mellem 35 og 45% Tilsæt 2,5 liter vand i hver bakke. Lad jorden absorbere vandet fra hullerne i bunden af kopperne og vente på overfladen af jorden til at falde til kopfælgen niveau.To timer senere, så tre til fire frø i et enkelt sted og fire jævnt fordelt pletter i en kop. Placer en gennemsigtig plast dække over hver bakke og lad frø spire i en uge. Fjern derefter dækslet og lad planter vokse i endnu en uge.Overrisle planter med 1,5 liter vand hver anden dag efter frøene spire. Ni til 10 dage efter såning af frø skal du fjerne ekstra skud ved udtynding. Brug lille saks til at skære faldskærme og undgå at trække hele planten ud af jorden direkte.Tre til fire plante individer af samme størrelse i hver kop. For at installere touch hår børster på robot arme, først bruge lim til at fastsætte et lag af menneskehår jævnt på en 330 millimeter lang stål lineal. Længden af håret er 126 millimeter.Med to metalklemmer fastgøres stålsalstagerne på robotarmene. I kontrolpanelet skal du indstille højden af maskinarmene langs den lodrette dimension ved at trykke på Jog F plus for at hæve og Jog R minus for at sænke robotarmene og børsterne. Hold spidsen af hår børster 5 centimeter lavere end kopfælgen.Tryk på Inc F plus eller R minus for at prerun maskinen en til to cyklusser for at sikre, at alle plante individer bliver rørt. Før det officielle eksperiment skal du bruge en elektronisk skala til at måle berøringskraften. Juster maskinens armes højde for at opretholde berøringskraften mellem en til to millinewtons.Derefter indstilles udgangspositionen for maskinarme langs den vandrette dimension manuelt. Lad hårbørsterne hænge på kanten af hver bakke. Tryk på Jog F plus eller Jog R minus for at flytte maskinarmen vandret lidt efter lidt for at sikre, at ingen plante bliver rørt, før det rørende eksperiment starter.Indstil hårbørstens rejseafstand i den vandrette dimension til 365 millimeter ved at trykke på rejseknappen. Tryk på Inc F plus eller R minus for at flytte maskinarmene for at opnå fuld rejseafstand og sikre, at alle de behandlede planter berøres. Tryk derefter på den automatiske hastighedsknap for at indstille bevægelseshastigheden langs maskinarmenes x-akse til 5000 millimeter i minuttet.Tryk på den mindre cyklusknap for at indstille berøringstiden til 20 forsøg, der svarer til 40 berøringer pr. runde. Indstil gentagelsesintervallet for berøringsrunden til 480 minutter om dagen ved at trykke på den store periodeknap, som gør det muligt for hårbørster at røre ved planter i tre runder om dagen med en intervaltid på otte timer. Maskinen starter automatisk en ny berøringsrunde, når nedtællingen bliver nul.Indstil den store cyklus på 12 forsøg for at gøre det muligt for maskinen at røre planter i 12 runder inden for en periode på fire dage. Tryk på startknappen for at starte det forudindstillede program. Juster og kalibrer børster og hårspidser til samme højde hver dag i hele røreperioden.For at spore bolting dag af hver plante i en rørende eksperiment, observere den første blomsterstande stilk af hver plante hver dag. Mål længden og registrere varigheden af væksten, når den når en centimeter, hvilket betyder, at det er skiftet fra den vegetative fase til den reproduktive fase. Målingen af roset radius, tage billeder af hele bakken fra toppen.Brug en billedbehandling software til at måle afstanden fra roset midten til spidsen af den længste blad med kopfælgen som lineal. For at måle roset område, først fjerne blomsterstand uden at påvirke resten af roset organer. Tag billeder fra toppen af hver plante sammen med en skala lineal placeret i nærheden.I billedbehandlingssoftwaren skal du måle rosetbladenes vandrette todimensionelle overfladeareal. I dette eksperiment bomuld vatpind manuel touch behandling blev sammenlignet med maskine drevet hår touch behandling på vilde type kontrol Columbia nul planter. Bolting forsinket 1,7 dage efter kontinuerlig behandling af rør i vatpinden.Tilsvarende for den automatiske maskine drevet hår touch, forsinket boltning blev observeret. Den univariate Cox fareanalyse viser, at risikoen for bolte af planter i berøringsgruppen er henholdsvis 31 % og 52 % sammenlignet med planter i kontrolgruppen. Denne boltingforsinkelse blev imidlertid ikke observeret på tDNA insertional mutanter, NKK one og NKK two.Den univariate Cox proportional hazards model viser kun vilde type Columbia nul udstillet en betydelig forskel mellem kontrol og touch planter med en anslået HR på 41. For morfologiske ændringer, viste den vilde type Columbia nul plante betydeligt mindre roset radius og kortere blad længde efter tre dage med konstant og gentagne automatisk maskine drevet hår touch. Det forventede rosetområde blev ændret fra 20 til 16 kvadratcentimeter efter 13 dages berøring.For at sikre, at berøringskraften ikke fører til såret, skal der indstilles en passende berøringskraft omhyggeligt. Et sæt af ordentlige vækstbetingelser er nødvendige for at producere en passende Arabidopsis anlæg til touch respons assay. For eksempel er 24 timers lysintensitet mellem 180 og 240 microeinstein per kvadratmeter per sekund nødvendig for at observere signalet morfogenese.For at udvide til de andre former for mekanisk kraft belastning, kan maskinen også ændres med vand overbrusning dyse eller vindblæsere til at efterligne regn eller vind effekter, henholdsvis i fremtiden.

Research

JoVE Journal

Biology

A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Choice and No-Choice Assays for Testing the Resistance of A. thaliana to Chewing Insects

Larvae of the small white cabbage butterfly are a pest in agricultural settings. This caterpillar species feeds from plants in the cabbage family, which ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Effektiv og hurtig Isolering af Debuterende embryoner fra<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Frø

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolisk mærkning og membranfraktionering for Komparativ proteomiske analyse af<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Imaging Rumlig Reorganisering af et MAPK signalvej Brug af tobak Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

Hurtig Analyse af døgnrytmen fænotyper i Arabidopsis Protoplaster transficeret med et Selvlysende Clock Reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable ...

A Hydroponic Co-cultivation System for Simultaneous and Systematic Analysis of Plant/Microbe Molecular Interactions and Signaling

Et hydroponisk co-dyrkningssystem til simultan og systematisk analyse af plante / mikrobe molekylære interaktioner og signalering

An experimental design mimicking natural plant-microbe interactions is very important to delineate the complex plant-microbe signaling processes. ...

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Standardiseret metode til høj overførselshastighed Sterilisation af Arabidopsis frø

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

Massespektrometri analyse til at identificere allestedsnærværendelation af EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

Forward Genetic Screen Using Transgenic Calcium Reporter Aequorin to Identify Novel Targets in Calcium Signaling

Forward Genetiske Screen Brug Transgenic Calcium Reporter Aequorin at identificere nye mål i Calcium Signalering

Forward genetic screens have been important tools in the unbiased identification of genetic components involved in several biological pathways. The basis ...