Name: a labor-saving and repeatable touch-force signaling mutant screen protocol for the study of thigmomorphogenesis of a model plant arabidopsis thaliana
Uploaded: 2019-08-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana at JoVE.

Deze studie werd gesteund door de volgende subsidies: 31370315, 31570187, 31870231 (National Science Foundation of China), 16100318, 661613, 16101114, 16103615, 16103817, AoE/M-403/16 (RGC van Hong Kong). Auteurs willen Ju Feng Precision and Automation Technology Limited (Shenzhen, China) bedanken voor hun aanbod van verschillende schema's getoond in Figuur 1.
Schrijvers willen ook S. K. Cheung en W. C. Lee bedanken voor hun bijdrage aan de ontwikkeling van de Touch-Force loading machine.

1. voorbereiding van zaaizaad
Opmerking: Arabidopsis zaden van zowel wild type (Col-0) als mkk1 en mkk2 verlies-van-functie mutanten werden aangekocht bij het ARABIDOPSIS Biological Resource Center (ABRC, https://www.Arabidopsis.org, Columbus, Oh).
<ol><li>Bereken hoeveel plantaardige individuen van elk genotype zullen worden gebruikt voor een betrouwbare statistische analyse. Bereid een voldoende aantal zaden op basis van de kiemkracht van elke lijn, meestal 4-5 k...

<ol>
	<li>Jaffe, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thigmomorphogenesis:+the+response+of+plant+growth+and+development+to+mechanical+stimulation+with+special+reference+to+Bryonia+dioica.">Thigmomorphogenesis: the response of plant growth and development to mechanical stimulation with special reference to Bryonia dioica.</a> Planta. 114, 143-157 (1973).</li><li>Vandenbrink, J. P., Kiss, J. Z., Herranz, R., Medina, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+and+gravity+signals+synergize+in+modulating+plant+development.">Light and gravity signals synergize in modulating plant development.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 563 (2014).</li><li>Hashiguchi, Y., Tasaka, M., Morita, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+higher+plant+gravity+sensing.">Mechanism of higher plant gravity sensing.</a> American Journal of Botany. 100, 91-100 (2013).</li><li>Salisbury, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Flowering Process. , (1963).</li><li>Darwin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Power of Movement in Plants. , (1881).</li><li>Chehab, E. W., Eich, E., Braam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thigmomorphogenesis:+a+complex+plant+response+to+mechano-stimulation.">Thigmomorphogenesis: a complex plant response to mechano-stimulation.</a> Journal of Experimental Botany. 60, 43-56 (2008).</li><li>Telewski, F. W., Jaffe, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thigmomorphogenesis:+anatomical,+morphological+and+mechanical+analysis+of+genetically+different+sibs+of+Pinus+taeda+in+response+to+mechanical+perturbation.">Thigmomorphogenesis: anatomical, morphological and mechanical analysis of genetically different sibs of Pinus taeda in response to mechanical perturbation.</a> Physiologia Plantarum. 66, 219-226 (1986).</li><li>Vogel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+precision+measurements+of+radial+increment+in+a+mature+spruce+stand+and+interpretation+variants+of+short+term+changes+in+increment+values.">Automatic precision measurements of radial increment in a mature spruce stand and interpretation variants of short term changes in increment values.</a> Allgemeine Forst-und Jagdzeitung. , (1994).</li><li>Braam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+touch:+plant+responses+to+mechanical+stimuli.">In touch: plant responses to mechanical stimuli.</a> New Phytologist. 165, 373-389 (2005).</li><li>Jaffe, M. J., Leopold, A. C., Staples, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thigmo+responses+in+plants+and+fungi.">Thigmo responses in plants and fungi.</a> American Journal of Botany. 89, 375-382 (2002).</li><li>Telewski, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unified+hypothesis+of+mechanoperception+in+plants.">A unified hypothesis of mechanoperception in plants.</a> American Journal of Botany. 93, 1466-1476 (2006).</li><li>Guti&#233;rrez, R. A., Ewing, R. M., Cherry, J. M., Green, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+unstable+transcripts+in+Arabidopsis+by+cDNA+microarray+analysis:+rapid+decay+is+associated+with+a+group+of+touch-and+specific+clock-controlled+genes.">Identification of unstable transcripts in Arabidopsis by cDNA microarray analysis: rapid decay is associated with a group of touch-and specific clock-controlled genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11513-11518 (2002).</li><li>Lee, D., Polisensky, D. H., Braam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+touch-and+darkness-regulated+Arabidopsis+genes:+a+focus+on+calmodulin-like+and+XTH+genes.">Genome-wide identification of touch-and darkness-regulated Arabidopsis genes: a focus on calmodulin-like and XTH genes.</a> New Phytologist. 165, 429-444 (2005).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+functional+posttranslational+modification+proteomics+reveals+that+TREPH1+plays+a+role+in+plant+touch-delayed+bolting.">Quantitative and functional posttranslational modification proteomics reveals that TREPH1 plays a role in plant touch-delayed bolting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences United States of America. 115, 10265-10274 (2018).</li><li>Hamilton, E. S., Schlegel, A. M., Haswell, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=United+in+diversity:+mechanosensitive+ion+channels+in+plants.">United in diversity: mechanosensitive ion channels in plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 66, 113-137 (2015).</li><li>Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+plant+aequorin+reports+the+effects+of+touch+and+cold-shock+and+elicitors+on+cytoplasmic+calcium.">Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium.</a> Nature. 352, 524 (1991).</li><li>Toyota, M., Furuichi, T., Tatsumi, H., Sokabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+calcium+increases+in+response+to+changes+in+the+gravity+vector+in+hypocotyls+and+petioles+of+Arabidopsis+seedlings.">Cytoplasmic calcium increases in response to changes in the gravity vector in hypocotyls and petioles of Arabidopsis seedlings.</a> Plant Physiology. 146, 505-514 (2008).</li><li>Knight, M. R., Smith, S. M., Trewavas, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wind-induced+plant+motion+immediately+increases+cytosolic+calcium.">Wind-induced plant motion immediately increases cytosolic calcium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 4967-4971 (1992).</li><li>Braam, J., Davis, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rain-,+wind-,+and+touch-induced+expression+of+calmodulin+and+calmodulin-related+genes+in+Arabidopsis.">Rain-, wind-, and touch-induced expression of calmodulin and calmodulin-related genes in Arabidopsis.</a> Cell. 60, 357-364 (1990).</li><li>Chehab, E. W., Yao, C., Henderson, Z., Kim, S., Braam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+touch-induced+morphogenesis+is+jasmonate+mediated+and+protects+against+pests.">Arabidopsis touch-induced morphogenesis is jasmonate mediated and protects against pests.</a> Current Biology. 22, 701-706 (2012).</li><li>Telewski, F. W., Pruyn, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thigmomorphogenesis:+a+dose+response+to+flexing+in+Ulmus+americana+seedlings.">Thigmomorphogenesis: a dose response to flexing in Ulmus americana seedlings.</a> Tree Physiology. 18, 65-68 (1998).</li><li>De Vylder, J., Vandenbussche, F. J., Hu, Y., Philips, W., Van Der Straeten, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosette+tracker:+an+open+source+image+analysis+tool+for+automatic+quantification+of+genotype+effects.">Rosette tracker: an open source image analysis tool for automatic quantification of genotype effects.</a> Plant Physiology. , (2012).</li><li>Clark, T., Bradburn, M., Love, S., Altman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+analysis+part+I:+basic+concepts+and+first+analyses.">Survival analysis part I: basic concepts and first analyses.</a> British Journal of Cancer. 89, 232 (2003).</li><li>Bradburn, M. J., Clark, T. G., Love, S., Altman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+analysis+part+II:+multivariate+data+analysis&#8211;an+introduction+to+concepts+and+methods.">Survival analysis part II: multivariate data analysis&#8211;an introduction to concepts and methods.</a> British Journal of Cancer. 89, 431 (2003).</li><li>Jaffe, M., Forbes, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thigmomorphogenesis:+the+effect+of+mechanical+perturbation+on+plants.">Thigmomorphogenesis: the effect of mechanical perturbation on plants.</a> Plant Growth Regulation. 12, 313-324 (1993).</li><li>Kutschera, U., Niklas, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+plant+physiology:+Charles+Darwin&#8217;s+forgotten+synthesis.">Evolutionary plant physiology: Charles Darwin&#8217;s forgotten synthesis.</a> Naturwissenschaften. 96, 1339 (2009).</li></ol>

Thigmomorphogenesis is een complexe plantgroei reactie op mechanische perturbations, waarbij een netwerk van cellulaire signalering en de werking van fytohormonen. Het is een gevolg van adaptieve evolutie van planten om te overleven onder de ongewenste omgevingsomstandigheden25,26. Mechanische aanraking, met name menselijke vingeraanraking en hand-held wattenstaafje aanraking, zijn geselecteerd om te bestuderen van deze morfologische veranderingen in eerder thigm...

Plant thigmomorphogenesis is een term die werd bedacht door Jaffe, MJ in 19731. Het is een plant tropisme, maar verschillend van het bekende phototropisme of gravitropism veroorzaakt door prikkels van zonlicht of zwaartekracht2,3. Het beschrijft fenotypische veranderingen in verband met periodieke mechanische stimulaties, die vaak zijn waargenomen door botanisten in vroegere tijden4,5. Regendruppels, wind, planten, dieren en menselijke aanrakingen, zelfs dieren beten, worden allemaal beschouwd als verschillende soorten mechano-stimuli die de kracht signalering in planten4,5triggeren. Kenmerken van de plant thigmomorphogenesis omvatten de vertraging van het bout, een kortere Steel, kleinere rozet/blad grootte in kruidachtige planten, en dikkere stam in houtige planten6,7,8. Dit is in tegenstelling tot de thigmonastieke of thigmotrope respons die vaak voorkomt in de Mimosa plant of andere mechano-gevoelige wijnstokken, waar deze snelle aanraak responsen gemakkelijker te volgen zijn op1,9,10. Thigmomorfogenese, aan de andere kant, is relatief moeilijk te worden waargenomen vanwege de trage groei reactie. Thigmomorfogenese wordt meestal waargenomen na weken of zelfs jaren van continue kracht-loading stimulatie. Deze unieke aard van plant Touch Response maakt het moeilijk om een voorwaartse genetische scherm uit te voeren met behulp van menselijke hand aanraking stimulatie om de Touch-Force signalering resistente mutanten op een robuuste manier te isoleren.
Om de kracht signaaltransductie trajecten en de onderliggende moleculaire mechanismen van de thigmomorphogenesis6,11, moleculaire en cellulaire biologische experimenten te verheldoen, zijn uitgevoerd in de afgelopen6, 12,13,14. Deze studies hebben voorgesteld dat de plant kracht signaal receptoren voornamelijk bestaan uit mechanosensitieve ionenkanalen (msc) en de tethered MSC complexen samengesteld door multimere complexen van membraan-spanning eiwitten11,14 , 15. de cytoplasmatische CA2 + voorbijgaande Spike gegenereerd binnen enkele seconden van de eerste aanraking. Wind-, regen-of gravi-stimulatie kan communiceren met de benedenstroomse calcium sensoren om de kracht signalen te leveren aan nucleaire gebeurtenissen14,16,17,18. Naast moleculaire en cellulaire studies heeft het voorwaartse genetische scherm met handmatige vingeraanraking van planten geconstateerd dat fytohormonen en de secundaire metabolieten betrokken zijn bij de daaruit voortvloeiende Touch-inducible (TCH) genexpressie na de Touch-Force loading13,19. Voorbeelden zijn AOS en opr320 mutanten geïdentificeerd tot dusver van de genetische studies. Het grote probleem in verband met de toepassing van de voorwaartse genetica in de studie van thigmomorphogenesis is echter nog steeds de intensieve arbeid die nodig is voor het kwantificeren van het niveau van aanraak respons en het aanraken van een grote populatie van genetisch gemuleerde individuele planten. Het tijdrovende probleem blijft ook bestaan in het met de hand raken van het Mutant scherm14,20. Voor een voorbeeld, om een ronde van touch-Force stimulatie te voltooien, moet een persoon 30-60 keer aanraken (één aanraking per seconde) op een afzonderlijke plant. Om een voldoende aantal planten voor statistische fenotype analyse te hebben, zijn 20-50 afzonderlijke planten van hetzelfde genotype normaalgesproken nodig voor het aanlaad proces van de aanraak kracht. Deze touch-Force laden regime betekent dat een persoon moet herhaaldelijk uitvoeren 600-3000 aanrakingen op één genotype van keuze. Dit type aanraking moet normaalgesproken 3 tot 5 ronden per dag worden herhaald, wat overeenkomt met ongeveer 1800-15000 vinger-of wattenstaafje aanrakingen per dag bij genotype van planten. Een goed opgeleide persoon is normaalgesproken vereist om de kracht en kracht van meerdere aanrakingen binnen een wenselijk bereik in vele herhalings rondes in een dag te handhaven om de grote variatie in kracht en kracht te vermijden. Omdat het bekend is dat thigmomorphogenesis een verzadigbaar en dosis afhankelijk proces is van6,21, raakt de kracht/sterkte van de aanraking cruciaal voor een succes bij het activeren van de aanraak respons van een plant.
Om de persoon afhankelijke belasting te verwijderen en de mechanische toepassing binnen een acceptabel fout bereik14te houden, hebben we daarom een automatische Touch-Force-laad machine ontworpen om de hand gemanipuleerde aanrakingen te vervangen. De machine heeft 4 bewegende armen gebouwd, die elk zijn uitgerust met één human hair Brush. Deze versie heeft de naam model K1 om de functie van human hair Touch-Force loading te specificeren. Als 4 genotypen kwantitatief worden gemeten voor hun thigmomorfogenese of aanraak respons onder één machine, kunnen 40-48 individuen per genotype worden gemeten. Elke ronde Touch herhaling (minder dan 60 keer aanraking per plant) duurt minder dan 5 minuten met behulp van een verstelbare robotarm met bewegende snelheid. Zo kunnen planten op een model K1-aanraak machine mechanisch worden gestimuleerd voor meerdere rondes per dag, hetzij met een constante belasting van de aanraking-kracht of verschillende niveaus van sterktes als aanvankelijk geprogrammeerd.
Arabidopsis thaliana, een model plant organisme, werd daarom gekozen als doel plantensoort voor het testen van de volautomatische haar Touch-Force laad machine applicatie. Omdat er verschillende grote kiem banken beschikbaar zijn voor het ophalen van de verschillende germplasmen van mutanten en de grootte van de bloei, past Arabidopsis goed in de ruimte die beschikbaar is in de groei plank gemonteerd met de model K1 Touch machine.
De model K1 Automatic Touch machine bestaat uit drie belangrijke componenten: (1) de H-shape metalen rek samengesteld door twee riem-aangedreven lineaire actuatoren, (2) robotische metalen armen uitgerust met haar borstels, en (3) een controller. Voor een aangepaste model K1-aanraak machine bestaat elke X/Y-asmodule uit één belt-gestuurde geleiderail, twee Slide blocks (rood) en 1 57 Stepper Motor (vooraf geïnstalleerd en ontkoppelbaar) (Figuur 1a,B). De bovenste horizontale Actuator laat de robotische metalen arm naar links en rechts horizontaal bewegen, de onderste verticale riem-gestuurde Lineaire Actuator laat de robotische metalen arm verticaal omhoog en omlaag bewegen (Figuur 1B, Figuur 2A ). Op de verticale Actuator zijn vier ontkoppelbaar gerobotiseerde armen geïnstalleerd (Figuur 1C, Figuur 2B). Vier menselijke haar borstels waren gebonden aan vier robotische armen, respectievelijk (Figuur 1C, Figuur 2B). Alle mechanische onderdelen voor het construeren van de model K1 Touch machine in vetdicht lettertype hieronder zijn gemarkeerd in Figuur 1C (Zie ook de tabel van de materialen).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1141px;" width="1140">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">4 hair brushes</td>
			<td style="width:393px;"></td>
			<td style="width:149px;">customized</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">4 robot arms with one holder</td>
			<td style="width:393px;"></td>
			<td style="width:149px;">customized</td>
			<td>1000 mm length holder and 560 mm length robot arm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">57 stepper motor</td>
			<td style="width:393px;"></td>
			<td style="width:149px;">57HS22-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">All purpose potting soil</td>
			<td style="width:393px;">Plantmate, Hong Kong</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Arabidopsis plant seeds</td>
			<td style="width:393px;">Arabidopsis Biological Resource Centers, Columbus, OH</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>For arabidopsis seed purchase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">BIO-MIX potting substratum</td>
			<td style="width:393px;">Jiffy Products International BV, the Netherlands</td>
			<td style="width:149px;">1000682050</td>
			<td>Two soils were mixed together to grow Arabidopsis. The ratio of All purpos potting soil and&#160; BIO-MIX is 1:2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">IL 1700 research radiometer</td>
			<td style="width:393px;">International Light, Newburyport, MA</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>The light intensity of both full-wavelength and photosynthetic active radiation can be measured.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">ImageJ</td>
			<td style="width:393px;">https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Free downloaded software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Ju Feng Precision and Automation Technology Limited</td>
			<td style="width:393px;">Shenzhen, China</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>For belt-driven linear actuators and other mechanical modules purchase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Junction plate of the slide block</td>
			<td style="width:393px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>To fix the Y guide-rail module or Y auxiliary girder onto backs of slide blocks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Junction plate of the X axis module</td>
			<td style="width:393px;"></td>
			<td style="width:149px;">customized</td>
			<td>To connect the X guide-rail module and X auxiliary girder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Slide block</td>
			<td style="width:393px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">WDT4045 X axis guide-rail module</td>
			<td style="width:393px;"></td>
			<td style="width:149px;">843 mm, customized</td>
			<td>Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:375px;">WDT4045 Y axis guide-rail module</td>
			<td style="width:393px;"></td>
			<td style="width:149px;">1038 mm, customized</td>
			<td>Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">X axis auxiliary girder</td>
			<td style="width:393px;"></td>
			<td style="width:149px;">843 mm, customized</td>
			<td>Pre-installed with two slide blocks</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:375px;">Y axis auxiliary girder</td>
			<td style="width:393px;"></td>
			<td style="width:149px;">1038 mm, customized</td>
			<td>Pre-installed with two slide blocks</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a labor-saving and repeatable touch-force signaling mutant screen protocol for the study of thigmomorphogenesis of a model plant arabidopsis thaliana

Planten reageren op zowel intracellulaire en extracellulaire mechanische stimulaties (of kracht signalen) en ontwikkelen van speciale morfologische veranderingen, een genaamd thigmomorphogenesis. In de afgelopen decennia zijn verschillende signalerings componenten geïdentificeerd en gerapporteerd om betrokken te zijn bij de mechanotransductie (bijv. calciumionen bindende eiwitten en jasmonische zuur biosynthese enzymen). Echter, de relatief trage tempo van het onderzoek in de studie van de kracht signalering of thigmomorphogenesis wordt grotendeels toegeschreven aan twee redenen: de eis voor bewerkelijk menselijke hand gemanipuleerd aanraking inductie van thigmomorphogenesis en de kracht sterkte fouten verbonden met de hand-Touch van mensen. Om de efficiëntie van externe kracht belasting op een planten organisme te verbeteren, werd een automatische Touch-Force-laad machine gebouwd. Deze robotische arm-aangedreven haarborstel raakt een arbeidsbesparende en gemakkelijk herhaalbare simulatie van aanraak kracht, onbeperkte herhalingen van aanraak herhaling en instelbare aanraak sterkte. Deze haar Touch-Force laad machine kan worden gebruikt voor zowel grootschalige screening van touch-Force signalering mutanten en de fenomica studie van plant thigmomorphogenesis. Bovendien, touch materialen zoals mensen haar, kan worden vervangen door andere natuurlijke materialen zoals dierlijk haar, zijde draden en katoenvezels. De automatische bewegende armen op de machine kunnen worden uitgerust met Watersproeiers en lucht blowers om de natuurlijke krachten van respectievelijk regendruppels en wind na te bootsen. Door het gebruik van deze automatische haar Touch-Force laad machine in combinatie met de hand uitgevoerde wattenstaafje aanraken, hebben we onderzocht de aanraking reactie van twee kracht signalering mutanten, MAP kinase kinase 1 (MKK1) en MKK2 planten . De fenomes van de Touch-Force geladen wild type planten en twee mutanten werden statistisch geëvalueerd. Ze hebben significante verschillen in aanraak respons tentoongesteld.

De automatische Hair Touch-Force laad machine Voor observatie van morfologische veranderingen op planten zijn zowel de reproduceerbare groeiomstandigheden als de behandelingsmethoden van cruciaal belang voor het verkrijgen van herhaalbaar resultaat. Deze mutant screening met hoge doorvoer en automatische Touch Force-signalering wordt bereikt door de nieuw gebouwde haar Touch-Force laad machine, model K1 (Figuur 1, Figuur 2). Deze haar borstel...

Watch this Scientific Journal Video about A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana at JoVE.

A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana

Een arbeidsbesparende en herhaalbare Touch-Force signalering Mutant screen protocol voor de studie van Thigmomorphogenesis van een model plant Arabidopsis thaliana

Een zachte touch-Force laad machine is opgebouwd uit menselijke haar borstels, robotarmen en een controller. De haar borstels worden aangedreven door robotarmen die op de machine zijn geïnstalleerd en bewegen periodiek om touch-Force op planten toe te passen. De sterkte van machinaal aangedreven haar aanrakingen is vergelijkbaar met die van handmatig aangebrachte aanrakingen.

Plants responding to both intracellular and extracellular mechanical stimulations (or force signals) and develop special morphological changes, a called ...

We bouwen een automatische touch force machine om het plantensignaal morfogenese te observeren. De robotarmen die ik installeerde met menselijke haarborstels om zachte aanraakkracht op planten aan te brengen. In vergelijking met menselijke vinger aanraking, kan de automatische menselijke haar aanrakingsmachine meer arbeidsbesparing, een eenvormige aanrakingskrachtlading aanbieden.De tijd die nodig is voor een ronde van kracht laden kan worden beperkt binnen enkele minuten. In vergelijking met een paar uur vinger aanraking en een wattenstaafje raken, de robot machine kan grotendeels verbeteren van de plant mercantile response onderzoek. Door de efficiëntie en populatie van behandelde planten te verhogen, verwachten we dat de automatische aanraakmachine zal worden toegepast in een vier signalering mutant schermen en de mercantile response studies in zowel planten als dieren.Om te beginnen test u de kiemsnelheid van elk genotype na het verzorgen van zaden op een 8%agarplaat met MS-medium gedurende zeven dagen. Volgens de kiemsnelheid, bereiden zaden vier tot vijf keer meer dan het gewenste aantal planten te produceren. Dompel zaden onder in koud water in 1,5 milliliter plastic buizen en bedek met aluminiumfolie om in het donker te blijven.Bewaar op vier graden celsius voor zaad imbibition. Vijf tot zeven dagen na de imbibition, selecteer de juiste bodem voor plantengroei. Vermijd grote klonten en gebruik een vork om ze homogeen te mengen.Bereid 24 207 milliliter plastic bekers met een bovenste velgdiameter van 7,4 centimeter. Boor drie ronde gaten aan de onderkant van de kopjes voor irrigatiedoeleinden. Vul deze plastic bekers met gemengde grond.Laat de grond zich opstapelen tot ongeveer een centimeter hoger dan de bekerrand en gebruik een liniaal om het oppervlak van de opgestapelde grond zacht plat te maken. Breng 24 kopjes in een plastic dienblad. Stel de lichtintensiteit van de groeikamer tussen 180 en 240 microeinsteins per seconde per vierkante meter, wat hoger is dan de fotosynthetische actieve straling voor snelle groei van de planten.Stel de lichtconditie in op 24 uur constant. Stel de temperatuur van de groeikamer in op een 23,5 plus of min 1,5 graden Celsius en vochtigheid tussen 35 en 45%Voeg 2,5 liter water toe aan elke lade. Laat de grond absorberen het water uit de gaten gelegen aan de onderkant van de kopjes en wacht tot het oppervlak van de bodem te laten vallen tot de beker velg niveau.Twee uur later, zaaien drie tot vier zaden op een enkele plek en vier gelijkmatig verdeelde plekken in een beker. Plaats een transparante plastic deksel boven elke lade en laat zaden ontkiemen voor een week. Verwijder vervolgens de hoes en laat zaailingen nog een week groeien.Irrigeer planten met 1,5 liter water om de andere dag na de zaden ontkiemen. Negen tot 10 dagen na het zaaien van zaad, verwijder extra scheuten door dunner te worden. Gebruik kleine schaar om de parachutes te snijden en te voorkomen dat het trekken van de hele plant uit de bodem direct.Drie tot vier plantaardige individuen van vergelijkbare grootte in elk kopje. Om aanraakhaarborstels op de robotarmen te installeren, gebruik je eerst lijm om een laag menselijk haar gelijkmatig op een 330 millimeter lange stalen liniaal te bevestigen. De lengte van het haar is 126 millimeter.Met twee metalen klemmen, bevestig die stalen linialen op de robotarmen. Stel in het bedieningspaneel de hoogte van de machinearmen in langs de verticale dimensie door op Jog F plus te drukken om te verhogen en Jog R min om de robotarmen en borstels te verlagen. Houd het puntje van haarborstels 5 centimeter lager dan de cup rand.Druk op de Inc F plus of R min om de machine een tot twee cycli voor te draaien om ervoor te zorgen dat alle plantaardige individuen worden aangeraakt. Gebruik voor het officiële experiment een elektronische weegschaal om de aanraakkracht te meten. Pas de hoogte van de machinearmen aan om de aanraakkracht tussen één tot twee millinewtons te behouden.Stel vervolgens handmatig de startpositie van machinearmen langs de horizontale dimensie in. Laat de haarborstels aan de rand van elke lade hangen. Druk op Jog F plus of Jog R min om de machinearm beetje bij beetje horizontaal te bewegen om ervoor te zorgen dat er geen plant wordt aangeraakt voordat het aanraakexperiment begint.Stel de rijafstand van de haarborstel in de horizontale dimensie in op 365 millimeter door op de reisknop te drukken. Druk op Inc F plus of R min om de machine armen te verplaatsen om een volledige reisafstand te verkrijgen en ervoor te zorgen dat alle van de behandelde planten worden aangeraakt. Druk vervolgens op de automatische snelheidsknop om de bewegingssnelheid langs de x-as van de machinearmen in te stellen op 5000 millimeter per minuut.Druk op de kleine fietsknop om de aanraaktijd in te stellen op 20 proeven gelijk aan 40 aanrakingen per ronde. Stel het herhalingsinterval van de aanraakronde in op 480 minuten per dag door op de belangrijke periodeknop te drukken waarmee haarborstels drie rondes per dag planten kunnen raken met een intervaltijd van acht uur. De machine start automatisch een nieuwe ronde van aanraking wanneer het aftellen in nul draait.Stel de belangrijkste cyclus op 12 proeven om de machine in staat te stellen planten aan te raken gedurende 12 rondes binnen een periode van vier dagen. Druk op de startknop om het vooraf ingestelde programma te starten. Pas en kalibreer de borstels en haartips elke dag op dezelfde hoogte tijdens de gehele aanrakingsperiode.Om de boutdag van elke plant te volgen in een ontroerend experiment, observeer je de eerste bloeisterige stam van elke plant elke dag. Meet de lengte en noteren de duur van de groei wanneer deze een centimeter bereikt, wat betekent dat het is overgestapt van de vegetatieve fase naar de voortplantingsfase. De maat van de rozet straal, neem foto's van de hele lade vanaf de top.Gebruik een beeldverwerkingssoftware om de afstand van het rozetcentrum tot het puntje van het langste blad te meten met de bekerrand als liniaal. Om het rozetgebied te meten, moet u eerst de bloeiwijze verwijderen zonder de rest van de rozetorganen te beïnvloeden. Maak foto's vanaf de bovenkant van elke plant samen met een schaal liniaal in de buurt geplaatst.Meet in de beeldverwerkingssoftware het horizontale tweedimensionale oppervlak van de rozetbladeren. In dit experiment wattenstaafje handmatige touch behandeling werd vergeleken met machine gedreven haar touch behandeling op wilde type controle Columbia nul planten. Bouten vertraagd 1,7 dagen na continue wattenstaafje touch behandeling.Ook voor de automatische machine aangedreven haar aanraking, vertraagde bouten werd waargenomen. De univariate Cox gevaren analyse toont het boutrisico van planten in de touch groep is 31%en 52% in vergelijking met planten in de controlegroep, respectievelijk. Deze vertraging werd echter niet waargenomen bij tDNA insertional mutanten, NKK één en NKK twee.De univariate Cox proportionele gevaren model toont alleen wilde type Columbia nul tentoongesteld een significant verschil tussen controle en touch planten met een geschatte HR van 41. Voor morfologische veranderingen, het wilde type Columbia nul plant toonde aanzienlijk kleinere rozet straal en kortere bladlengte na drie dagen van constante en repetitieve automatische machine aangedreven haar aanraking. Het geprojecteerde rozet gebied werd veranderd van 20 tot 16 vierkante centimeter na 13 dagen van aanraking.Om ervoor te zorgen dat de aanraakkracht lading niet zal leiden tot de wond, moet de juiste aanraakkracht zorgvuldig worden ingesteld. Een reeks van de juiste groei voorwaarden nodig zijn om een geschikte Arabidopsis plant te produceren voor touch response assay. Zo is bijvoorbeeld 24 uur lichtintensiteit tussen 180 en 240 microeinstein per vierkante meter per seconde nodig om het signaal morfogenese waar te nemen.Om uit te breiden tot de andere vormen van mechanische krachtbelasting, kan de machine ook worden aangepast met waterberegeningsmond of windblazers om regen- of windeffecten na te bootsen, respectievelijk in de toekomst.

Research

JoVE Journal

Biology

A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Door de computer gegenereerde Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Choice and No-Choice Assays for Testing the Resistance of A. thaliana to Chewing Insects

Keuze en No-keuze Assays voor het testen van de weerstand van A. thaliana te kauwen Insecten

Larvae of the small white cabbage butterfly are a pest in agricultural settings. This caterpillar species feeds from plants in the cabbage family, which ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Efficiënte en snelle isolatie van een vroeg stadium embryo&#39;s van<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Zaden

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabole Labeling en Membrane Fractionation for Comparative Proteomic analyse van<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Schorsing Celkweken

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Beeldvorming Ruimtelijke Reorganisatie van een MAPK signaalroute Met behulp van de Tabak Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

Snelle analyse van het circadiaans fenotypes in Arabidopsis protoplasten getransfecteerd met een Lichtgevende klok Reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable ...

A Hydroponic Co-cultivation System for Simultaneous and Systematic Analysis of Plant/Microbe Molecular Interactions and Signaling

Een hydroponisch co-cultuursysteem voor gelijktijdige en systematische analyse van plant- / microbe moleculaire interacties en signalering

An experimental design mimicking natural plant-microbe interactions is very important to delineate the complex plant-microbe signaling processes. ...

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Gestandaardiseerde methode voor High-throughput sterilisatie van Arabidopsis zaden

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

Massaspectrometrieanalyse om alomtegenwoordigheid van EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) te identificeren

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

Forward Genetic Screen Using Transgenic Calcium Reporter Aequorin to Identify Novel Targets in Calcium Signaling

Forward Genetisch Scherm met behulp van transgene calcium Reporter Aequorin om nieuwe doelen te identificeren in calcium signalering

Forward genetic screens have been important tools in the unbiased identification of genetic components involved in several biological pathways. The basis ...