Name: a labor-saving and repeatable touch-force signaling mutant screen protocol for the study of thigmomorphogenesis of a model plant arabidopsis thaliana
Uploaded: 2019-08-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana at JoVE.

Denna studie stöddes av följande bidrag: 31370315, 31570187, 31870231 (National Science Foundation of China), 16100318, 661613, 16101114, 16103615, 16103817, AoE/M-403/16 (RGC of Hong Kong). Författarna vill tacka ju Feng precision och automation Technology Limited (Shenzhen, Kina) för deras erbjudande av flera scheman som visas i figur 1.
Författarna skulle också vilja tacka S. K. Cheung och W. C. Lee för deras bidrag till utvecklingen av touch-Force lastning maskin.

1. beredning av utsäde
Obs: Arabidopsis frön av både vildtyp (Col-0) samt mkk1 och mkk2 förlust av funktion mutanter som används köptes från ARABIDOPSIS biologiska Resource Center (ABRC, https://www.Arabidopsis.org, Columbus, OH).
<ol><li>Beräkna hur många växt individer av varje genotyp kommer att användas för en tillförlitlig statistisk analys. Förbered ett tillräckligt antal frön baserat på grobarheten för varje rad, vanligtvis 4-5 gånger mer ...

<ol>
	<li>Jaffe, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thigmomorphogenesis:+the+response+of+plant+growth+and+development+to+mechanical+stimulation+with+special+reference+to+Bryonia+dioica.">Thigmomorphogenesis: the response of plant growth and development to mechanical stimulation with special reference to Bryonia dioica.</a> Planta. 114, 143-157 (1973).</li><li>Vandenbrink, J. P., Kiss, J. Z., Herranz, R., Medina, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+and+gravity+signals+synergize+in+modulating+plant+development.">Light and gravity signals synergize in modulating plant development.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 563 (2014).</li><li>Hashiguchi, Y., Tasaka, M., Morita, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+higher+plant+gravity+sensing.">Mechanism of higher plant gravity sensing.</a> American Journal of Botany. 100, 91-100 (2013).</li><li>Salisbury, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Flowering Process. , (1963).</li><li>Darwin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Power of Movement in Plants. , (1881).</li><li>Chehab, E. W., Eich, E., Braam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thigmomorphogenesis:+a+complex+plant+response+to+mechano-stimulation.">Thigmomorphogenesis: a complex plant response to mechano-stimulation.</a> Journal of Experimental Botany. 60, 43-56 (2008).</li><li>Telewski, F. W., Jaffe, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thigmomorphogenesis:+anatomical,+morphological+and+mechanical+analysis+of+genetically+different+sibs+of+Pinus+taeda+in+response+to+mechanical+perturbation.">Thigmomorphogenesis: anatomical, morphological and mechanical analysis of genetically different sibs of Pinus taeda in response to mechanical perturbation.</a> Physiologia Plantarum. 66, 219-226 (1986).</li><li>Vogel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+precision+measurements+of+radial+increment+in+a+mature+spruce+stand+and+interpretation+variants+of+short+term+changes+in+increment+values.">Automatic precision measurements of radial increment in a mature spruce stand and interpretation variants of short term changes in increment values.</a> Allgemeine Forst-und Jagdzeitung. , (1994).</li><li>Braam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+touch:+plant+responses+to+mechanical+stimuli.">In touch: plant responses to mechanical stimuli.</a> New Phytologist. 165, 373-389 (2005).</li><li>Jaffe, M. J., Leopold, A. C., Staples, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thigmo+responses+in+plants+and+fungi.">Thigmo responses in plants and fungi.</a> American Journal of Botany. 89, 375-382 (2002).</li><li>Telewski, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unified+hypothesis+of+mechanoperception+in+plants.">A unified hypothesis of mechanoperception in plants.</a> American Journal of Botany. 93, 1466-1476 (2006).</li><li>Guti&#233;rrez, R. A., Ewing, R. M., Cherry, J. M., Green, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+unstable+transcripts+in+Arabidopsis+by+cDNA+microarray+analysis:+rapid+decay+is+associated+with+a+group+of+touch-and+specific+clock-controlled+genes.">Identification of unstable transcripts in Arabidopsis by cDNA microarray analysis: rapid decay is associated with a group of touch-and specific clock-controlled genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11513-11518 (2002).</li><li>Lee, D., Polisensky, D. H., Braam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+touch-and+darkness-regulated+Arabidopsis+genes:+a+focus+on+calmodulin-like+and+XTH+genes.">Genome-wide identification of touch-and darkness-regulated Arabidopsis genes: a focus on calmodulin-like and XTH genes.</a> New Phytologist. 165, 429-444 (2005).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+functional+posttranslational+modification+proteomics+reveals+that+TREPH1+plays+a+role+in+plant+touch-delayed+bolting.">Quantitative and functional posttranslational modification proteomics reveals that TREPH1 plays a role in plant touch-delayed bolting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences United States of America. 115, 10265-10274 (2018).</li><li>Hamilton, E. S., Schlegel, A. M., Haswell, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=United+in+diversity:+mechanosensitive+ion+channels+in+plants.">United in diversity: mechanosensitive ion channels in plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 66, 113-137 (2015).</li><li>Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+plant+aequorin+reports+the+effects+of+touch+and+cold-shock+and+elicitors+on+cytoplasmic+calcium.">Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium.</a> Nature. 352, 524 (1991).</li><li>Toyota, M., Furuichi, T., Tatsumi, H., Sokabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+calcium+increases+in+response+to+changes+in+the+gravity+vector+in+hypocotyls+and+petioles+of+Arabidopsis+seedlings.">Cytoplasmic calcium increases in response to changes in the gravity vector in hypocotyls and petioles of Arabidopsis seedlings.</a> Plant Physiology. 146, 505-514 (2008).</li><li>Knight, M. R., Smith, S. M., Trewavas, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wind-induced+plant+motion+immediately+increases+cytosolic+calcium.">Wind-induced plant motion immediately increases cytosolic calcium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 4967-4971 (1992).</li><li>Braam, J., Davis, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rain-,+wind-,+and+touch-induced+expression+of+calmodulin+and+calmodulin-related+genes+in+Arabidopsis.">Rain-, wind-, and touch-induced expression of calmodulin and calmodulin-related genes in Arabidopsis.</a> Cell. 60, 357-364 (1990).</li><li>Chehab, E. W., Yao, C., Henderson, Z., Kim, S., Braam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+touch-induced+morphogenesis+is+jasmonate+mediated+and+protects+against+pests.">Arabidopsis touch-induced morphogenesis is jasmonate mediated and protects against pests.</a> Current Biology. 22, 701-706 (2012).</li><li>Telewski, F. W., Pruyn, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thigmomorphogenesis:+a+dose+response+to+flexing+in+Ulmus+americana+seedlings.">Thigmomorphogenesis: a dose response to flexing in Ulmus americana seedlings.</a> Tree Physiology. 18, 65-68 (1998).</li><li>De Vylder, J., Vandenbussche, F. J., Hu, Y., Philips, W., Van Der Straeten, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosette+tracker:+an+open+source+image+analysis+tool+for+automatic+quantification+of+genotype+effects.">Rosette tracker: an open source image analysis tool for automatic quantification of genotype effects.</a> Plant Physiology. , (2012).</li><li>Clark, T., Bradburn, M., Love, S., Altman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+analysis+part+I:+basic+concepts+and+first+analyses.">Survival analysis part I: basic concepts and first analyses.</a> British Journal of Cancer. 89, 232 (2003).</li><li>Bradburn, M. J., Clark, T. G., Love, S., Altman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+analysis+part+II:+multivariate+data+analysis&#8211;an+introduction+to+concepts+and+methods.">Survival analysis part II: multivariate data analysis&#8211;an introduction to concepts and methods.</a> British Journal of Cancer. 89, 431 (2003).</li><li>Jaffe, M., Forbes, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thigmomorphogenesis:+the+effect+of+mechanical+perturbation+on+plants.">Thigmomorphogenesis: the effect of mechanical perturbation on plants.</a> Plant Growth Regulation. 12, 313-324 (1993).</li><li>Kutschera, U., Niklas, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+plant+physiology:+Charles+Darwin&#8217;s+forgotten+synthesis.">Evolutionary plant physiology: Charles Darwin&#8217;s forgotten synthesis.</a> Naturwissenschaften. 96, 1339 (2009).</li></ol>

Thigmomorphogenesis är en komplex växttillväxt svar mot mekaniska störningar, som innebär ett nätverk av cellulära signalering och åtgärder av fytohormoner. Det är en följd av adaptiv evolution av växter för att överleva under de oönskade miljöförhållandena25,26. Mekanisk beröring, särskilt mänskliga finger beröring och handhållna bomullspinne touch, har valts för att studera denna morfologiska förändringar i tidigare tigmomorfogenetiska...

Plant thigmomorphogenesis är en term som myntades av Jaffe, MJ i 19731. Det är en växt tropism men skiljer sig från den välkända phototropism eller gravitropism orsakad av stimuli av solljus eller gravitation2,3. Den beskriver fenotypiska förändringar i samband med periodiska mekaniska stimuleringar, som ofta har observerats av botanister i tidigare tider4,5. Regndroppar, vind, växt, djur och mänskliga berör, även djurbett, anses alla vara olika typer av Mechano-stimuli som utlöser kraft signalering i växter4,5. Egenskaper hos växten tigmomorphogenesis inkluderar förseningen av bultning, en kortare stam, mindre Rosette/bladstorlek i örtartade växter, och tjockare stam i vedartade växter6,7,8. Detta är till skillnad från den thigmonastic eller thigmotropic svar som ofta finns i Mimosa växten eller andra Mechano-känsliga vinstockar, där dessa snabba beröring svar är lättare att observeras1,9,10. Tigmomorphogenesis, å andra sidan, är relativt svårt att observeras på grund av dess långsamma tillväxt svar. Tigmomorphogenesis observeras vanligtvis efter veckor eller till och med år av kontinuerlig kraft lastning stimulering. Denna unika karaktär av växt beröring svar gör det svårt att utföra en framåt genetisk skärm med hjälp av mänsklig hand touch stimulering för att isolera touch-Force signal resistenta mutanter på ett robust sätt.
För att belysa kraften signal signaltransduktion vägar och de molekylära mekanismerna bakom thigmomorphogenesis6,11, molekylära och cellulära biologiska experiment har utförts under de senaste6, 12,13,14. Dessa studier har föreslagit att VÄXTKRAFTEN signal receptorer består huvudsakligen av mechanosensitive jonkanaler (MSC) och tjudrad MSC komplex består av multimeric komplex av membran-Spanning proteiner11,14 , 15. cytoplasmiska ca2 + övergående Spike genereras inom några sekunder efter den första beröring. Vind-, regn-, eller gravi-stimulering kan interagera med nedströms kalcium sensorer för att transduce kraften signaler till nukleära händelser14,16,17,18. Förutom molekylära och cellulära studier, den främre genetiska skärmen med manuell finger beröring av växter har funnit att fytohormoner och sekundära metaboliter är inblandade i den därav beröring-inducerbara (TCH) genuttryck efter Tryck-kraft lastning13,19. För exempel, AOS och opr320 mutanter har identifierats hittills från genetiska studier. Emellertid, det stora problemet i samband med tillämpningen av den framåt genetik i studien av tigmomorphogenesis är fortfarande den intensiva arbete som krävs för att kvantitera nivån på beröring svar och röra en stor population av genetiskt muterade enskilda anläggningar. Den tidskrävande frågan kvarstår också i handen beröring-baserade Mutant skärm14,20. För ett exempel, för att slutföra en omgång av touch-Force stimulering, en person behöver röra 30-60 gånger (en tryckning per sekund) på en enskild anläggning. För att få tillräckligt många växter för statistisk analys av fenotyp, krävs normalt 20-50 enskilda plantor av samma genotyp för den berörande belastnings processen. Denna touch-Force lastning regim innebär att en person behöver upprepade utföra 600-3000 berör en genotyp av val. Denna typ av beröring normalt måste upprepas 3 till 5 rundor om dagen, vilket motsvarar ungefär 1800-15000 finger eller bomullspinne berör per dag per genotyp av växter. En välutbildad person är normalt krävs för att bibehålla styrkan och kraften i flera inslag inom ett önskvärt intervall under många omgångar av upprepning på en dag för att undvika den stora variationen i kraft och styrka. Eftersom det är välkänt att tigmomorphogenesis är en mättningsbar och dosberoende process6,21, touch Force/Strength blir kritisk till en framgång i utlösande beröring svar av en anläggning.
För att ta bort den person beroende touch-Force lastning och för att bibehålla mekanisk tillämpning inom ett godtagbart fel område14, vi konstruerade därför en automatisk touch-Force lastning maskin för att ersätta de handmanipulerade berör. Maskinen har 4 rörliga armar byggda, som var och en är utrustad med en mänsklig hårborste. Denna version heter Model K1 för att specificera dess funktion av människohår touch-Force lastning. Om 4 genotyper mäts kvantitativt för sin tigmomorphogenesis eller beröring svar under en maskin, 40-48 individer per genotyp kan mätas. Varje omgång av touch upprepning (mindre än 60 gånger per planta) varar mindre än 5 minuter med en rörlig hastighet justerbar robotarm. Sålunda, växter på en modell K1 touch maskin kan mekaniskt stimuleras för flera omgångar om dagen antingen med en konstant touch-Force lastning eller olika nivåer av styrkor som initialt programmerade.
Arabidopsis thaliana, en modell växtorganism, valdes därför som mål växtarter för att testa den helautomatiska hår touch-Force lastning maskin ansökan. Eftersom det finns flera stora fröbanker tillgängliga för att hämta de olika arvsmassa av mutanter och storleken på blomningen, passar Arabidopsis väl till det utrymme som finns i tillväxt hylla monterad med modellen K1 touch maskin.
Modell K1 automatisk touch maskin består av tre huvudkomponenter: (1) H-form metall rack består av två remdrivna linjära manöverdon, (2) Robotic metall armar utrustade med hårborstar, och (3) en styrenhet. För en anpassad modell K1 touch maskin, varje X/Y Axelmodul består av en bälte-driven guide-Rail, två glid block (röd) och 1 57 stegmotor (förinstallerade och demonteras) (figur 1a,B). Det övre horisontella ställdon gör det möjligt för robot metall armen att flytta vänster och höger horisontellt, det undre vertikala remdrivna linjära ställdon gör det möjligt för robot metall armen att röra sig uppåt och nedåt vertikalt (figur 1B, figur 2A ). Fyra demonteras robotarmar installerades på det vertikala manöverdonet (figur 1C, figur 2B). Fyra människohår borstar var bundna till fyra robotarmar, respektive (figur 1C, figur 2B). Alla mekaniska delar att konstruera modellen K1 touch Machine i fetstil teckensnitt nedan är markerade i figur 1C (se även tabellen av material).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1141px;" width="1140">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">4 hair brushes</td>
			<td style="width:393px;"></td>
			<td style="width:149px;">customized</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">4 robot arms with one holder</td>
			<td style="width:393px;"></td>
			<td style="width:149px;">customized</td>
			<td>1000 mm length holder and 560 mm length robot arm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">57 stepper motor</td>
			<td style="width:393px;"></td>
			<td style="width:149px;">57HS22-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">All purpose potting soil</td>
			<td style="width:393px;">Plantmate, Hong Kong</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Arabidopsis plant seeds</td>
			<td style="width:393px;">Arabidopsis Biological Resource Centers, Columbus, OH</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>For arabidopsis seed purchase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">BIO-MIX potting substratum</td>
			<td style="width:393px;">Jiffy Products International BV, the Netherlands</td>
			<td style="width:149px;">1000682050</td>
			<td>Two soils were mixed together to grow Arabidopsis. The ratio of All purpos potting soil and&#160; BIO-MIX is 1:2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">IL 1700 research radiometer</td>
			<td style="width:393px;">International Light, Newburyport, MA</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>The light intensity of both full-wavelength and photosynthetic active radiation can be measured.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">ImageJ</td>
			<td style="width:393px;">https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Free downloaded software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Ju Feng Precision and Automation Technology Limited</td>
			<td style="width:393px;">Shenzhen, China</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>For belt-driven linear actuators and other mechanical modules purchase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Junction plate of the slide block</td>
			<td style="width:393px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>To fix the Y guide-rail module or Y auxiliary girder onto backs of slide blocks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Junction plate of the X axis module</td>
			<td style="width:393px;"></td>
			<td style="width:149px;">customized</td>
			<td>To connect the X guide-rail module and X auxiliary girder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Slide block</td>
			<td style="width:393px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">WDT4045 X axis guide-rail module</td>
			<td style="width:393px;"></td>
			<td style="width:149px;">843 mm, customized</td>
			<td>Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:375px;">WDT4045 Y axis guide-rail module</td>
			<td style="width:393px;"></td>
			<td style="width:149px;">1038 mm, customized</td>
			<td>Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">X axis auxiliary girder</td>
			<td style="width:393px;"></td>
			<td style="width:149px;">843 mm, customized</td>
			<td>Pre-installed with two slide blocks</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:375px;">Y axis auxiliary girder</td>
			<td style="width:393px;"></td>
			<td style="width:149px;">1038 mm, customized</td>
			<td>Pre-installed with two slide blocks</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a labor-saving and repeatable touch-force signaling mutant screen protocol for the study of thigmomorphogenesis of a model plant arabidopsis thaliana

Växter som svarar på både intracellulära och extracellulära mekaniska stimuleringar (eller kraft signaler) och utveckla speciella morfologiska förändringar, en som kallas thigmomorphogenesis. Under de senaste decennierna har flera signaleringskomponenter identifierats och rapporterats för att vara involverade i mechanotransduction (t. ex. kalcium jonbindning proteiner och bildar Acid biosyntes enzymer). Men den relativt långsamma forsknings takten i studiet av Force signalering eller thigmomorphogenesis tillskrivs till stor del två skäl: kravet på mödosam mänsklig hand manipulerade touch induktion av tigmomorphogenesis och Force Strength fel förknippas med människors hand-touch. För att öka effektiviteten av yttre kraft lastning på en växtorganism, en automatisk touch-Force lastning maskin byggdes. Denna robot arm-driven hårborste berör ger en arbetsbesparande och lätt upprepningsbara touch-Force simulering, obegränsade rundor av touch upprepning och justerbar touch styrka. Detta hår touch-Force lastning maskin kan användas för både storskalig screening av touch-Force signalering mutanter och phenomics studie av växten tigmomorphogenesis. Dessutom, beröring material som människohår, kan ersättas med andra naturliga material som djurhår, silkestrådar och bomullsfibrer. Den automatiserade rörliga armar på maskinen kan utrustas med vattenstänk munstycken och luftblåsare för att efterlikna de naturliga krafterna av regndroppar och vind, respektive. Genom att använda denna automatiska hår touch-Force lastning maskin i kombination med hand-framförd bomullspinne röra, har vi undersökt touch svar av två Force signalering mutanter, MAP kinase kinase 1 (MKK1) och MKK2 växter . Phenomes av de laddade Wild typ växterna för handlag-Force och två mutanter utvärderades statistiskt. De har uppvisat betydande skillnader i beröring svar.

Den automatiska hår touch-Force lastning maskin För observation av morfologiska förändringar på växter, både reproducerbara tillväxtförhållanden och behandlingsmetoder är nyckeln till att få repeterbara resultat. Denna höga genomströmning och automatisk touch-Force signalering Mutant screening uppnås genom den nybyggda hår touch-Force lastning maskin, modell K1 (figur 1, figur 2). Dessa hårborstar kan röra högst 4 brickor a...

Watch this Scientific Journal Video about A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana at JoVE.

A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana

En arbetsbesparande och repeterbara touch-Force signalering Mutant skärm protokoll för studiet av Thigmomorphogenesis av en modell växt Arabidopsis thaliana

En skonsam lastmaskin är byggd av människohår borstar, robotarmar och en Controller. Hårborstarna drivs av robotarmar installerade på maskinen och flytta regelbundet för att tillämpa touch-Force på växter. Styrkan i maskin-driven hår berör är jämförbar med den manuellt applicerade Detaljer.

Plants responding to both intracellular and extracellular mechanical stimulations (or force signals) and develop special morphological changes, a called ...

Vi bygger en automatisk touch kraft maskin för att observera växtsignalen morphogenesis. Den robotarmar jag installerade med mänskliga hårborstar för att tillämpa skonsam beröringskraft på växter. I jämförelse med mänskliga finger touch, kan den automatiska mänskliga hår beröring maskin erbjuda mer arbetskraft sparande, en enhetlig touch kraft lastning.Den tid som krävs för en rond av kraft lastning kan begränsas inom flera minuter. Jämfört med flera timmars fingertofil och en bomullstuss touch, robotmaskinen kan till stor del förbättra anläggningen merkantila svar forskning. Genom att öka effektiviteten och populationen av behandlade växter räknar vi med att den automatiska pekskärmsmaskinen kommer att tillämpas i en fyra signalerande mutantskärmar och merkantila responsstudier på både växter och djur.Till att börja, testa grobarhetsgraden för varje genotyp efter vårda frön på en 8%agar platta med MS medium i sju dagar. Enligt grobarhetshastigheten, förbereda frön fyra till fem gånger mer än det önskade antalet växter som ska produceras. Doppa frön i kallt vatten i 1,5 milliliter plaströr och täck med aluminiumfolie för att hålla i mörkret.Förvaras vid fyra grader celsius för frö imbibition. Fem till sju dagar efter imbibitionen väljer du lämplig jord för växttillväxt. Undvik stora klumpar och använd en gaffel för att blanda dem homogent.Förbered 24 207 milliliter plastmuggar med en övre fälgdiameter på 7,4 centimeter. Borra tre runda hål i botten av kopparna för bevattningsändamål. Fyll dessa plastmuggar med blandad jord.Låt jorden stapla upp till cirka en centimeter högre än koppen fälgen och använda en linjal för att platta ytan av staplade jorden mjukt. Överför 24 koppar i en plastbricka. Ställ in tillväxtkammarens ljusintensitet mellan 180 och 240 mikroeinstein per sekund per kvadratmeter, vilket är högre än den fotosyntetiska aktiva strålningen för snabb tillväxt av växterna.Ställ in ljustillståndet till att vara 24 timmar konstant. Ställ temperaturen i tillväxtkammaren på en 23,5 plus eller minus 1,5 grader celsius och luftfuktighet mellan 35 och 45%Lägg 2,5 liter vatten i varje bricka. Låt jorden absorbera vattnet från hålen som ligger längst ner på kopparna och vänta på att jordens yta ska sjunka till koppfälgnivån.Två timmar senare, så tre till fyra frön till en enda plats och fyra jämnt fördelade fläckar i en kopp. Placera ett genomskinligt plasttäcke ovanför varje bricka och låt frön gro i en vecka. Sedan, ta bort locket och låt plantor att växa i ytterligare en vecka.Irrigera växter med 1,5 liter vatten varannan dag efter fröna gror. Nio till 10 dagar efter utsäde sådd, ta bort extra skott genom gallring. Använd små saxar för att skära rännorna och undvika att dra hela växten ur jorden direkt.Tre till fyra växt individer av liknande storlek i varje kopp. För att installera touch hår borstar på robotarmar, använd först lim för att fixa ett lager av människohår jämnt på en 330 millimeter lång stål linjal. Längden på håret är 126 millimeter.Med två metallklämmor, fäst dessa stål linjaler på robotarmarna. I kontrollpanelen ställer du in höjden på maskinarmarna längs den vertikala dimensionen genom att trycka på Jog F plus för att höja och Jog R minus för att sänka robotarmarna och borstarna. Håll spetsen på hårborstar 5 centimeter lägre än koppfälgen.Tryck på Inc F plus eller R minus för att köra maskinen en till två cykler för att se till att alla växt individer är vidrörda. Innan det officiella experimentet, använd en elektronisk skala för att mäta beröringskraften. Justera höjden på maskinarmarna för att bibehålla beröringskraften mellan en till två millinewtons.Därefter ställer du in startpositionen för maskinarmar längs den horisontella dimensionen manuellt. Låt hårborstarna hänga i kanten på varje bricka. Tryck på Jog F plus eller Jog R minus för att flytta maskinarmen vågrätt lite i taget för att se till att ingen växt vidrörs innan beröringsexperimentet startar.Ställ in hårborstens ressträcka i den horisontella dimensionen på 365 millimeter genom att trycka på reseknappen. Tryck Inc F plus eller R minus för att flytta maskinarmarna för att få en fullständig ressträcka och se till att alla behandlade växter vidrörs. Tryck sedan på knappen för automatisk hastighet för att ställa in rörelsehastigheten längs maskinarmarnas x-axel på 5000 millimeter per minut.Tryck på den mindre cykelknappen för att ställa in pektiden vid 20 försök som motsvarar 40 beröringar per runda. Ställ in pekrundans repetitionsintervall på 480 minuter per dag genom att trycka på den större periodknappen som gör att hårborstar kan röra växter under tre omgångar om dagen med en intervalltid på åtta timmar. Maskinen kommer att starta en ny omgång touch automatiskt när nedräkningen blir noll.Ställ in den stora cykeln vid 12 försök så att maskinen kan röra växter i 12 omgångar inom en period av fyra dagar. Tryck på startknappen för att initiera det förinställda programmet. Justera och kalibrera borstarna och hårspetsarna till samma höjd varje dag under hela beröringsperioden.För att spåra bultningsdagen för varje anläggning inom ett rörande experiment, observera den första blomstringsstammen av varje anläggning varje dag. Mät längden och registrera varaktigheten av tillväxten när den når en centimeter, vilket innebär att den har övergått från den vegetativa fasen till reproduktionsfasen. Måttet på rosettradie, ta bilder av hela facket från toppen.Använd en bildbehandlingsprogramvara för att mäta avståndet från rosettcentrum till spetsen på det längsta bladet med koppkanten som linjal. För att mäta rosett område, först, ta bort blomställningen utan att påverka resten av rosett organ. Ta bilder från toppen av varje planta tillsammans med en skallinjal placerad i närheten.I bildbehandlingsprogramvaran mäter du rosettens horisontella tvådimensionella yta. I detta experiment bomullspinne manuell beröring behandling jämfördes med maskin driven hår beröring behandling på vild typ kontroll Columbia noll växter. Bultning fördröjd 1,7 dagar efter kontinuerlig bomullspinnebehandling.På samma sätt för den automatiska maskinen driven hår touch, fördröjd bultning observerades. Analys av univariat Cox hazards visar att bultningsrisken för anläggningar i beröringsgruppen är 31%och 52%jämfört med anläggningar i kontrollgruppen, respektive. Denna bultningsfördröjning observerades dock inte på TDNA insertional mutanter, NKK en och NKK två.Den univariata Cox proportionella faror modellen visar endast vilda typ Columbia noll uppvisade en betydande skillnad mellan kontroll och touch växter med en uppskattad HR på 41. För morfologiska förändringar, den vilda typ Columbia noll anläggningen visade betydligt mindre rosett radie och kortare blad längd efter tre dagar av konstant och repetitiva automatisk maskin driven hår touch. Den projicerade rosettarealen ändrades från 20 till 16 kvadratcentimeter efter 13 dagars beröring.För att se till att beröringskraftens lastning inte kommer att leda till såra, måste lämplig beröringskraft ställas in noggrant. En uppsättning av korrekt tillväxt villkor behövs för att producera en lämplig Arabidopsis anläggning för beröring svar assay. Till exempel behövs 24 timmars ljusintensitet mellan 180 och 240 mikroeinstein per kvadratmeter per sekund för att observera signalens morfogenes.För att utvidga till de andra formerna av mekanisk kraft lastning, kan maskinen också modifieras med vatten stänk munstycke eller vindblåsare att efterlikna regn eller vind effekter, respektive i framtiden.

Research

JoVE Journal

Biology

A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Datorgenererade djurmodell Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Choice and No-Choice Assays for Testing the Resistance of A. thaliana to Chewing Insects

Valfrihet och No-val analyser för att testa Resistance A. thaliana att tugga Insekter

Larvae of the small white cabbage butterfly are a pest in agricultural settings. This caterpillar species feeds from plants in the cabbage family, which ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Effektiv och snabb isolering av tidigt stadium embryon från<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Frön

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabola Märkning och Membrane Fraktione för jämförande proteomik analys av<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Fjädring cellkulturer

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Avbildning Rumslig Reorganisation av ett MAPK-signalvägen Använda Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

Snabb analys av dygns Fenotyper i Arabidopsis protoplaster transfekterade med en lysande klocka Reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable ...

A Hydroponic Co-cultivation System for Simultaneous and Systematic Analysis of Plant/Microbe Molecular Interactions and Signaling

Ett hydroponisk samodlingssystem för samtidig och systematisk analys av molekylära interaktioner och signalering av växt / mikrob

An experimental design mimicking natural plant-microbe interactions is very important to delineate the complex plant-microbe signaling processes. ...

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Standardiserad metod för High-throughput sterilisering av Arabidopsis frön

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

Masspektrometri analys för att identifiera Ubiquitylation av EYFP-märkt CENP-A (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

Forward Genetic Screen Using Transgenic Calcium Reporter Aequorin to Identify Novel Targets in Calcium Signaling

Framåt genetisk skärm med transgenkalcerande kalcium reporter Aequorin att identifiera nya mål i kalcium signalering

Forward genetic screens have been important tools in the unbiased identification of genetic components involved in several biological pathways. The basis ...