Name: inducible, cell type-specific expression in arabidopsis thaliana through lhgr-mediated trans-activation
Uploaded: 2019-04-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation at JoVE.com

عمل في مختبراتنا معتمد من قبل مؤسسة البحوث الألمانية (DFG) منح WO 1660/6-1 (إلى جنوب غرب) و "الموارد الوراثية" 2104/4-1 (إلى آثاريا) و SFB1101 (إلى آثاريا و J.U.L) ومجلس البحوث الأوروبي منح consolidator (بلانتستيمس 647148) إلى آثاريا  جنوب غرب معتمد من خلال "الزمالة إيمي نويثر" من DFG من خلال منحة WO 1660/2.

يمكن الحصول على ناقلات ووحدات من المستودع غير هادفة للربح، أدجيني (https://www.addgene.org).
1-الاستنساخ باستخدام جرينجاتي
<ol><li>تصميم كبسولة تفجير باستخدام يتدلى المدرجة في الجدول 1، استبدال 'NNNN' مع وحدة محول نوع خاص تسلسل المدرجة أدناه: إلى الأمام: 5´AACA جتكتك أ NNNN (ن) CA*</s...

<ol>
	<li>Moore, I., Samalova, M., Kurup, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivated+and+chemically+inducible+gene+expression+in+plants.">Transactivated and chemically inducible gene expression in plants.</a> The Plant Journal. 45 (4), 651-683 (2006).</li><li>Lampropoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GreenGate---a+novel,+versatile,+and+efficient+cloning+system+for+plant+transgenesis.">GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis.</a> PLoS One. 8 (12), e83043 (2013).</li><li>Baroux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictable+activation+of+tissue-specific+expression+from+a+single+gene+locus+using+the+pOp/LhG4+transactivation+system+in+Arabidopsis.">Predictable activation of tissue-specific expression from a single gene locus using the pOp/LhG4 transactivation system in Arabidopsis.</a> Plant Biotechnology Journal. 3 (1), 91-101 (2005).</li><li>Craft, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+pOp/LhG4+vectors+for+stringent+glucocorticoid-dependent+transgene+expression+in+Arabidopsis.">New pOp/LhG4 vectors for stringent glucocorticoid-dependent transgene expression in Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 41 (6), 899-918 (2005).</li><li>Moore, I., Galweiler, L., Grosskopf, D., Schell, J., Palme, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcription+activation+system+for+regulated+gene+expression+in+transgenic+plants.">A transcription activation system for regulated gene expression in transgenic plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (1), 376-381 (1998).</li><li>Samalova, M., Brzobohaty, B., Moore, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pOp6/LhGR:+a+stringently+regulated+and+highly+responsive+dexamethasone-inducible+gene+expression+system+for+tobacco.">pOp6/LhGR: a stringently regulated and highly responsive dexamethasone-inducible gene expression system for tobacco.</a> The Plant Journal. 41 (6), 919-935 (2005).</li><li>Picard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steroid-binding+domains+for+regulating+the+functions+of+heterologous+proteins+in+cis.">Steroid-binding domains for regulating the functions of heterologous proteins in cis.</a> Trends in Cell Biology. 3 (8), 278-280 (1993).</li><li>Schurholz, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comprehensive+Toolkit+for+Inducible,+Cell+Type-Specific+Gene+Expression+in+Arabidopsis.">A Comprehensive Toolkit for Inducible, Cell Type-Specific Gene Expression in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 178 (1), 40-53 (2018).</li><li>Kubo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+switches+for+protoxylem+and+metaxylem+vessel+formation.">Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation.</a> Genes and Development. 19 (16), 1855-1860 (2005).</li><li>Di Laurenzio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SCARECROW+gene+regulates+an+asymmetric+cell+division+that+is+essential+for+generating+the+radial+organization+of+the+Arabidopsis+root.">The SCARECROW gene regulates an asymmetric cell division that is essential for generating the radial organization of the Arabidopsis root.</a> Cell. 86 (3), 423-433 (1996).</li><li>Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+SCARECROW+function+reveals+a+radial+patterning+mechanism+common+to+root+and+shoot.">Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot.</a> Development. 127 (3), 595-603 (2000).</li><li>Hellens, R. P., Edwards, E. A., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pGreen:+a+versatile+and+flexible+binary+Ti+vector+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation.">pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Plant Molecular Biology. 42 (6), 819-832 (2000).</li><li>Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana+using+the+floral+dip+method.">Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method.</a> Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).</li><li>Kleinboelting, N., Huep, G., Kloetgen, A., Viehoever, P., Weisshaar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABI-Kat+SimpleSearch:+new+features+of+the+Arabidopsis+thaliana+T-DNA+mutant+database.">GABI-Kat SimpleSearch: new features of the Arabidopsis thaliana T-DNA mutant database.</a> Nucleic Acids Research. 40 (Database issue), D1211-D1215 (2012).</li><li>. Selection scheme used at GABI-Kat for resistance to sulfadiazine Available from: <a target="_blank" href="https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html">https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html</a> (2018)</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+addition+quantitative+real-time+PCR+(SAQPCR):+a+novel+approach+for+determination+of+transgene+copy+number+avoiding+PCR+efficiency+estimation.">Standard addition quantitative real-time PCR (SAQPCR): a novel approach for determination of transgene copy number avoiding PCR efficiency estimation.</a> PLoS One. 8 (1), e53489 (2013).</li><li>Wallner, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strigolactone-+and+Karrikin-Independent+SMXL+Proteins+Are+Central+Regulators+of+Phloem+Formation.">Strigolactone- and Karrikin-Independent SMXL Proteins Are Central Regulators of Phloem Formation.</a> Current Biology. 27 (8), 1241-1247 (2017).</li><li>Fletcher, J. C., Brand, U., Running, M. P., Simon, R., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+of+cell+fate+decisions+by+CLAVATA3+in+Arabidopsis+shoot+meristems.">Signaling of cell fate decisions by CLAVATA3 in Arabidopsis shoot meristems.</a> Science. 283 (5409), 1911-1914 (1999).</li><li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cellulose+synthases+in+Arabidopsis+secondary+cell+walls.">Visualization of cellulose synthases in Arabidopsis secondary cell walls.</a> Science. 350 (6257), 198-203 (2015).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VASCULAR-RELATED+NAC-DOMAIN6+and+VASCULAR-RELATED+NAC-DOMAIN7+effectively+induce+transdifferentiation+into+xylem+vessel+elements+under+control+of+an+induction+system.">VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN6 and VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN7 effectively induce transdifferentiation into xylem vessel elements under control of an induction system.</a> Plant Physiology. 153 (3), 906-914 (2010).</li><li>Engineer, C. B., Fitzsimmons, K. C., Schmuke, J. J., Dotson, S. B., Kranz, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+a+Gal4-mediated+LUC/GFP/GUS+enhancer+trap+system+in+Arabidopsis.">Development and evaluation of a Gal4-mediated LUC/GFP/GUS enhancer trap system in Arabidopsis.</a> BMC Plant Biology. 5, 9 (2005).</li><li>Aoyama, T., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glucocorticoid-mediated+transcriptional+induction+system+in+transgenic+plants.">A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants.</a> The Plant Journal. 11 (3), 605-612 (1997).</li><li>Decaestecker, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-TSKO+facilitates+efficient+cell+type-,+tissue-,+or+organ-specific+mutagenesis+in+Arabidopsis.">CRISPR-TSKO facilitates efficient cell type-, tissue-, or organ-specific mutagenesis in Arabidopsis.</a> bioRxiv. , (2018).</li></ol>

هنا، نحن تصف الخطوات الضرورية لإنشاء وتطبيق مجموعة أدوات متنوعة وشاملة لنوع الخلية إيندوسيبلي، محددة ترانس-التنشيط. عبور خطوط تحمل أشرطة الكاسيت المستجيب تحت سيطرة المروج البوب مع خطوط برنامج تشغيل يسمح لدراسة آثار سوء التعبير في الجيل F1، تمكين التقييم السريع لاضطراب الوراثية...

قيداً رئيسيا في علم الأحياء في عصر بوستجينوميك فك سياق الدور المحدد لعامل معين أو اضطراب الوراثية. كثيرا ما لا تسمح التأسيسي الاضطرابات الوراثية مثل النهج فقدان للوظيفة والكسب من وظيفة تحليل نقطة النهاية لعمليات التكيف مدى الحياة، تشويش التمييز بين الآثار الأولية والثانوية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن ملثمين سياق مهام محددة أو يخفف من آثار واسعة النطاق في أنسجة بعيدة أو خلال مراحل أخرى من التنمية. وعلاوة على ذلك، في الحالات القصوى، يمكن أن يحول دون الفتك أي فكرة آليا. ومن الناحية المثالية، للالتفاف حول هذه القضايا، أحد يمكن تحليل أثر اضطراب الوراثية الحادة داخل سياق محدد مثل نوع خلية محددة بطريقة حل الوقت. ولتحقيق ذلك، هي الأدوات الجينية للخلية إيندوسيبلي، الخاصة بنوع التعبير المطلوبة1. لتوفير موارد للتقييم السريع لديناميات الزمانية المكانية استجابة للمستجيب عينها، جمعنا بين سهولة الاستنساخ المنصوص عليها في نظام جرينجاتي2 مع أثبتت فعاليتها من نظام الموارد الوراثية-LhG43، 45،،6. ونحن قد ولدت مجموعة من خطوط التعبير عن عامل النسخ تشيميريك LhG4 تنصهر فيها المجال ملزم يجند من الفئران كورتيكويد مستقبلات (GR)7 تحت سيطرة المروجين محددة نوع الخلية جيدا تتسم8. في استراحة الظروف، يبقى عامل النسخ خارج النواة، كما يرتبط المجال الموارد الوراثية قبل HSP90 سيتوسوليك. مع إضافة يجند الاصطناعية الديكساميتازون (Dex)، هو فعل إزفاء النووية وسوف التوسط LhG4 النسخ من أشرطة الكاسيت التعبير تحت سيطرة المروج الاصطناعية المشابهة من نوع البوب ، مثل مراسل mTurquoise2 وشملت في بنود برنامج التشغيل تصور المجال التعبير بعد التعريفي.  وهكذا، الخطوط برنامج تشغيل تقنيا تحتوي أيضا على كاسيت المستجيب. عبور مجموعة من بنود برنامج التشغيل مع خط يحمل كاسيت المستجيب مع، على سبيل المثال، أحد جينات للفائدة تحت التحكم من نفس نوع البوب المروج وهكذا يسمح التقييم السريع لآثار حادة أو طويلة الأجل المستجيب التعبير في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا.
هنا، نحن نقدم بروتوكول وصف الإجراءات اللازمة لإنشاء خطوط السائق والمستجيب، وتثبت كيف يمكن الناجم عن خلية محددة نوع التعبير وأتباعه في أرض قمية تبادل لإطلاق النار، وأرض قمية الجذر وكامبيوم من نبات. لتوضيح ذلك ببراعة وخصوصية لهذا النهج، فنحن نستخدم عامل النسخ المعروفة VND7 وقادرة على قيادة الخلية الثانوية مثل الخشب الجدار ثيكينينجس اكتوبيكالي9. علاج F1 من عبور بين السطر برنامج تشغيل11 10، pSCRوخط المستجيب pOp6:VND7 يؤدي إلى تكوين خلايا الخشب مثل حمل خارج الرحم في غمد النشا وقف الخلايا من نبات .
لتيسير توليد التجميعات الحمض النووي الكبيرة اللازمة لتشييد والبلازميدات التعبير السائق والمستجيب، كنا جرينجاتي بسرعة وكفاءة استنساخ الأسلوب2. جرنجيت الاستنساخ أساس في النوع الثاني S تقييد الإنزيمات مثل منظمة التعاون الاقتصادي31I أو إيسوشيزومير في جيش صرب البوسنة2. هذه الإنزيمات قطع المصب من مواقعهم الاعتراف غير المتناظر المنتجة يتدلى مع اختلاف تكوين قاعدة. من خلال دمج الإيكولوجية31I/جيش صرب البوسنةأنا تقييد مواقع في النوكليوتيد وتخصيص تسلسلات عبء محددة لعناصر الحمض النووي، استنساخ وحدات يتحقق، تيسير توليد التجمعات الكبيرة. وفي إطار جرنجيت، وحدات الحمض النووي تنقسم إلى فئات واو استناداً إلى تسلسل المتراكمة التي تعمل كمحولات ويتم تجميعها في هذا النظام. ولذلك، ينبغي أن تكون كبسولة تفجير تهدف إلى تضخيم المنتج المطلوب وفقا للوحدة النمطية المحددة2 (الشكل 1A). إذا كان هناك داخلية الإيكولوجية31I/جيش صرب البوسنةأنا الموقع والتسلسل غير متوافق مع وحدات الإدخال والوجهة جرينجاتي، يمكنك المتابعة دون موتاجينيزينج، ولكن بكفاءة أقل. بدلاً من ذلك، استخدام الطفرات موقع الموجه لإزالة الإيكولوجية31I/جيش صرب البوسنةوأنا تقييد مواقع مع الحرص على عدم تغيير الأحماض الأمينية في منتجات الجينات.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>K029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Column purification</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit (250)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture chamber for imaging</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG</td>
			<td>1-well tissue culture chamber, on cover glass II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>D139-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eco31I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FD0294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>injection cannula (0.30 x 12 mm, 30 G x 1/2)</td>
			<td>Sterican, Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>T832.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO lambda blue 63x water immersion objectiv</td>
			<td>Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS medium</td>
			<td>Duchefa, Haarlem, Netherlands</td>
			<td>M0221.0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x&#160; 1.1 NA water immersion objective</td>
			<td>Nikon, Minato, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35/10 mm</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Germany</td>
			<td>627102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60/150 mm</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Germany</td>
			<td>628102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 120/120/17</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Germany</td>
			<td>688102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant agar</td>
			<td>Duchefa, Haarlem, Netherlands</td>
			<td>P1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid extraction</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide (PI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razorblade</td>
			<td>Classic, Wilkinson Sword GmbH</td>
			<td>7005115E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tubes</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silwet L-77</td>
			<td>Kurt Obermeier GmbH &#38; Co. KG, Bad Berleburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>3834.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NanoDrop 2000c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfadiazine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>2228.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Ligase 5 U/&#181;l</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Ligase 30 U/&#181;l</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EL0013</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducible, cell type-specific expression in arabidopsis thaliana through lhgr-mediated trans-activation

التعبير إيندوسيبلي والأنسجة على حدة أداة هامة وقوية لدراسة ديناميات اضطراب الوراثية الزمانية. الجمع بين جرينجاتي بالمرونة والكفاءة الاستنساخ مع نظام ثبت ومرجعية لهجر نظام (يطلق عليها هنا غرام-LhG4) للتعبير إيندوسيبلي، نحن قد ولدت مجموعة من خطوط نبات المعدلة وراثيا التي يمكن أن تدفع بالتعبير عن المستجيب كاسيت بمجموعة من أنواع الخلايا المحددة في الخلايا الإنشائية النباتية الرئيسية الثلاثة. وتحقيقا لهذه الغاية، اخترنا نظام الموارد الوراثية-LhG4 المتقدمة سابقا على أساس عامل نسخ تشيميريك ومروج المشابهة من نوع البوب ضمان رقابة مشددة على مجموعة واسعة من مستويات التعبير. وباﻹضافة إلى ذلك، تصور المجال التعبير التي تنشط فيها عامل النسخ الاصطناعية، يتم ترميز مراسل فلورسنت المترجمة ER mTurquoise2 تحت سيطرة المروج pOp4 أو pOp6 في خطوط برنامج التشغيل. هنا، نحن تصف الخطوات الضرورية لإنشاء سطر برنامج التشغيل أو المستجيب، وتبين كيف يمكن الناجمين عن خلية محددة نوع التعبير وأتباعه في أرض قمية تبادل لإطلاق النار، وأرض قمية الجذر وكامبيوم من نبات. باستخدام برنامج تشغيل عدة أو كافة خطوط، أثر سياق محدد للتعبير عن أحد أو عوامل متعددة (المستجيبة) تحت سيطرة المروج الاصطناعية البوب يمكن تقييم سرعة، على سبيل المثال في مصانع F1 من عبور بين المستجيب واحدة ومتعددة خطوط برنامج التشغيل. ويتجلى هذا النهج التعبير حمل خارج الرحم من VND7، عامل نسخ NAC قادرة على حمل خارج الرحم الثانوية خلية الجدار ترسب بطريقة ذاتية في خلية.

جيل خطوط السائق والمستجيب عن طريق الاستنساخ جرنجيت
جرينجاتي استنساخ نظام يستند إلى GoldenGate الاستنساخ واستخدام endonuclease تقييد IIS نوع جيش صرب البوسنةأنا أو ما إيسوشيزومير إيكو31I. كما يمكن أن يكون يتدلى تنتج إنزيم بعيدة من موقعها على الاعتراف غير المتناظر، تكو?...

Watch this Scientific Journal Video about Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation at JoVE.com

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

إيندوسيبلي، الخلية المحددة بنوع التعبير في نبات التمويل "عن طريق لحجر" بوساطة ترانس-التنشيط

هنا، يصف لنا توليد وتطبيق مجموعة من المعدلة وراثيا التمويل نبات خطوط التعبير إيندوسيبلي، الخاصة بالانسجة مواتية في الخلايا الإنشائية الرئيسية الثلاثة وأرض قمية تبادل لإطلاق النار وأرض قمية الجذر وكامبيوم.

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

الهدف الرئيسي في علم الأحياء التنموي هو فهم الدور المحدد للسياق للجين. وهذا يمكن أن يكون من الصعب تحقيق من قبل المسوخ خروج المغلوب التقليدية أو عن طريق خطوط overexpression التأسيسية. استخدمنا نظام استنساخ البوابة الخضراء وحدات لتوليد مورد للتعبير غير قابل للاختزالية cyto محددة في meristems الرئيسية الثلاثة من نموذج مصنع Arabidopsis thaliana.وباستخدام نفس استراتيجية الاستنساخ المعيارية، يمكن تطبيق هذه الطريقة على الأنواع النباتية الأخرى التي لا يمكن تغييرها في التحول. المرئية مظاهرة من هذا الإجراء هو قيمة لأن تحليل تأثير عبر التنشيط في meristems من الجذعية و القمة قصيرة يتطلب تشريح قبل التصوير، والتي يمكن أن تكون صعبة للغاية. للبدء، تعقيم البذور كما هو موضح في بروتوكول النص.المقبل, إعداد نصف قوة Murashige و Skoog المتوسطة في درجة اله PH 5.8 وإضافة واحد في المئة السكروز و 0.9٪ أجار. بعد الوتكلاف، أضف ديكس المذاب في DMSO إلى لوحات الحث بتركيز نهائي بين 10 و 30 ميكرومولار. أضف كمية مساوية من DMSO إلى لوحات التحكم.وضع البذور لتصوير الجذر على لوحات وطبقتها لمدة 48 ساعة في الظلام وعند أربع درجات مئوية. وضع لوحات في وضع عمودي في حاضنة النباتات وتنمو لمدة خمسة أيام. بعد خمسة أيام من الإنبات، استخدم المجهر المسح الضوئي بالليزر confocal لتصوير الشتلات.للبدء ، وإعداد وتنمو البذور على النحو المبين في بروتوكول النص. بعد ستة إلى سبعة أيام من الإنبات، نقل كل شتلة إلى التربة في وعاء منفصل. إذا كان الحث على النباتات عن طريق سقي، واستخدام 25 محلول DEX micromolar في الماء، أعدت من مخزون من 25 ميليمولار DEX حل في الإيثانول.الماء كل يومين إلى ثلاثة أيام حتى الوقت المطلوب من التعريفي. إذا كان الحث عن طريق غمس, إعداد كأس لتر واحد مع 750 ملليلتر من الماء التي تحتوي على 0.02٪ سيلويت L77 و DEX في 25 تركيز نهائي ميكروموللار أو كمية مكافئة من DMSO لDEX والمعالجة وهمية. تراجع مصنع واحد في الحل التعريفي أو وهمية لمدة 30 ثانية.كرر كل يومين أو ثلاثة أيام، حتى الوقت المطلوب من التصوير. للبدء ، وإعداد وتنمو البذور على النحو المبين في بروتوكول النص. بعد ستة إلى سبعة أيام من الإنبات، نقل كل شتلة إلى التربة في وعاء منفصل.عندما يكون طول الجذع حوالي سنتيمتر واحد ، رش سام المفلورة مع ما بين 10 و 50 ميكرومولار DEX الحل في الماء. للحصول على الحث والتصوير في مراحل لاحقة من التنمية، والحث على SAMs من سيقان أطول أو يطلق النار على الجانب. بعد 24 إلى 48 ساعة من الحث، تشريح SAMs والمضي قدما في التصوير.أولاً، نقل الشتلات من اللوحة إلى محلول 10 ميكروغرام لكل ملليلتر من يوديد البروديوم ومضادة لهم لمدة خمس دقائق. ضع الجذور في غرفة تصوير المجهر وصورها باستخدام مجهر مسح ليزري مشترك مع هدف غمر الماء 63x. لتصور الفلوريسيد البروديوم، استخدم الطول الموجي الإثارة من 488 نانومتر وجمع الانبعاثات بين 590 و 660 نانومتر.بالنسبة لـ mTurquoise2 fluorescence، استخدم 458 نانومتر وتجمّع الانبعاثات بين 460 و615 نانومتر باستخدام المسح التسلسلي. أولاً، قم بإصلاح جذع بإصبع على الجانب الآخر من القسم المطلوب. باستخدام شفرة حلاقة، وقطع قطعة من حوالي ثلاثة سنتيمترات وإجراء عدة تخفيضات غرامة.شطف شفرة الحلاقة في طبق بيتري التي تحتوي على مياه الصنبور وجمع أقسام الجذعية. إما وصمة عار الأقسام أو تركيبها مباشرة على شرائح المجهر. للتلوين ، قم بإعداد ملليلتر واحد من محلول 250 ميكروغرام لكل ملليلتر من يوديد البرودينيوم في أنبوب رد فعل.إزالة ماء الصنبور من طبق بيتري مع ماصة واستبدالها مع محلول يوديد بروبديسيوم وصمة عار لمدة خمس دقائق. ثم، إزالة محلول يوديد بروبديسيوم وشطف بالماء. باستخدام إما ملقط غرامة أو فرشاة الطلاء غرامة، ونقل المقاطع الملطخة إلى شرائح المجهر.استخدم مجهر مسح ليزر مدمج مع عدسة غمر الماء 25x للتصوير صورًا للعينات. استخدم ضوء ليزر 561 نانومتر لإثارة الفلوريسيدات البروديويدية وجمع الانبعاثات من 570 إلى 620 نانومتر. استخدام ضوء الليزر نانومتر 405 لإثارة تأثير الفلوروبور 2 mTurquoise المشفرة من قبل خط سائق يبني وجمع الانبعاثات من 425 إلى 475 نانومتر.أولاً، استخدم ملقط لقطع الساق سنتيمترين تحت طرف التصوير. عقد الجذعية في يد واحدة واستخدام ملقط غرامة لإزالة براعم زهرة وprimordia كبيرة. لإزالة البدائية الشباب، إصلاح SAM في وضع مستقيم في طبق بيتري تحتوي على ثلاثة في المئة agarose.بعد ذلك، استخدم منظار وملباب لإزالة أي primordia الشباب قريبة من SAM. نقل سام تشريح إلى أنبوب يحتوي على 250 ميكروغرام في ملليلتر حل من يوديد بروبديسيوم. اترك العينة لمدة خمس إلى عشر دقائق مع التأكد من بقاء العينة مغمورة بالكامل أثناء إجراء التلطيخ.ضع سام الملون في طبق بيتري صغير يحتوي على ثلاثة في المئة من الاغاروز المتوسطة. غطي سام بالماء المقطر المزدوج. استخدم مجهر مسح ليزر مدمج مجهز بعدسة غمر الماء 25x لغمسها لتصوير SAMs المتشَقَف.استخدم ضوء ليزر 561 نانومتر لإثارة الفلوريسيدات البروديويدية وجمع الانبعاثات من 570 إلى 620 نانومتر. استخدم ضوء ليزر 405 نانومتر لإثارة الفلوروفهور mTurquoise2 وجمع الانبعاثات من 425 إلى 475 نانومتر. سجل مكدسات الصور التي تمتد 50 ميكرومتر في اتجاه Z مع حجم خطوة من 0.5 ميكرومتر.تحريض مع DEX يؤدي إلى نوع الخلية تعبير mTurquoise2 محددة في endodermis الجذر السلائف الفلوم والكامبيوم، والخلايا الجذعية في تبادل لاطلاق النار meristem apical. كحالة اختبار للتنشيط، يتم إنشاء خط effector ترميز عامل النسخ الرئيسي جدار الخلية الثانوية VND7 تنصهر إلى المجال التنشيط V16. بعد خمسة أيام من العلاج الواحد مع إما 15 ميكرولترات من DEX أو DMSO ، يتم إعداد أقسام الجذعية للتصور من lignificationopic في بدن.تظهر خلايا الغمد الأولى في العينات المستحثة إشارة قوية لقناة يوديد البروديوم وتظهر بعض الخلايا سماكة التشنج النمطية لرائط الخلية في خلايا xylem. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم واضح لكيفية الحث على التعبير الجيني في الأنسجة المختلفة وكيفية إعداد العينات الخاصة بك للتصوير. بعد هذا الإجراء، يمكن استخدام خطوط برنامج التشغيل المنشأة مع مجموعة متنوعة واسعة من الثوابت effector التي تم إنشاؤها من قبل المستخدمين الآخرين وفقا لمصالح البحوث الخاصة بهم.وينبغي أن يساعد هذا الاختصار الباحثين النباتية لتقييم تأثير التعبير النوع الخلية محددة بسرعة أو ضربة قاضية من جينة ذات أهمية بطريقة الوقت المحجوزة. يتطلب هذا النوع من الخلايا نظام التعريفي محددة استخدام ديكساميثازون الكورتيكوستيرويد. يجب تجنب الاتصال المباشر ، لذلك من المهم ارتداء القفازات وقناع الوجه أثناء العلاج.

Research

JoVE Journal

Genetics

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

The Terroir Concept Interpreted through Grape Berry Metabolomics and Transcriptomics

مفهوم TERROIR تفسر من خلال العنب بيري الايض وTranscriptomics

Terroir refers to the combination of environmental factors that affect the characteristics of crops such as grapevine (Vitis vinifera) according to ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

قياس موازية التعبير الإيقاعية جين ساعة وهرمون إفراز في مزارع الخلايا الأولية البشرية

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

وحيدة الخلية التعبير الجيني عن طريق المتعددة RT-QPCR لتوصيف عدم التجانس من السكان اللمفاوية نادر

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

تربية ومزدوجة الذين تقطعت بهم السبل بوساطة الحمض النووي الريبي الجينات ضربة قاضية في إخفاء بيتل،<em&gt; Dermestes المبقعة</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

مستحلب T7 الحمض النووي الريبي البلمرة بوساطة مولتيجين نظام التعبير، بمغس

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

وحيدة الخلية التعبير الجيني التنميط عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية وQPCR مع المعايير الداخلية

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

السيطرة التعبير قناة ايون من خلال ترنسفكأيشن عابر محرض

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

دراسة الخلية التعبير عن تنظيم دورة الجينات من قبل اثنين من بروتوكولات التزامن الخلية التكميلية

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

نظم التأسيسي وإيندوسيبلي للتعديل الوراثي في فيفو من خلايا الكبد الماوس باستخدام حقن الوريد ذيل هيدرودينامية

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

أسلوب أوبتوجينيتيك لمراقبة وتحليل أنماط التعبير الجيني في تفاعلات الخلية للخلية

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...