Name: inducible, cell type-specific expression in arabidopsis thaliana through lhgr-mediated trans-activation
Uploaded: 2019-04-19T15:00:00
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我们实验室的工作得到德国研究基金会 (DFG) 赠款 wo 16606-1 (至 s. w.) 的支持.) 和 GR 2104 4-1 (至 t. g.) 和 SFB1101 (至 t. g. 和 j. u. l), 以及欧洲研究理事会向 t. g. 提供的合并赠款 (PLANSTEMS 647148)。 S. w. 通过 Dfg 的 Emmy Noether 研究金通过 Grant WO 1660/得到支持。

载体和模块可从非营利存储库 Adgene (https://www.addgene.org) 获得。
1. 使用绿门克隆
<ol><li>设计引物使用表 1中列出的悬垂, 用下面列出的模块类型特定的适配器序列替换 "nnnn": 5 ' aaca ggtctc a nnnn ( n) ca * + 特定序列 3 ', 反向: 5 ' aca gtctc a nnnn (n) + 反向特定序列3的补体。添加带下划线的底座, 以确保阅读框架的维护。 模块悬垂: 注: 在默认的 GreenGate 框?...

<ol>
	<li>Moore, I., Samalova, M., Kurup, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivated+and+chemically+inducible+gene+expression+in+plants.">Transactivated and chemically inducible gene expression in plants.</a> The Plant Journal. 45 (4), 651-683 (2006).</li><li>Lampropoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GreenGate---a+novel,+versatile,+and+efficient+cloning+system+for+plant+transgenesis.">GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis.</a> PLoS One. 8 (12), e83043 (2013).</li><li>Baroux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictable+activation+of+tissue-specific+expression+from+a+single+gene+locus+using+the+pOp/LhG4+transactivation+system+in+Arabidopsis.">Predictable activation of tissue-specific expression from a single gene locus using the pOp/LhG4 transactivation system in Arabidopsis.</a> Plant Biotechnology Journal. 3 (1), 91-101 (2005).</li><li>Craft, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+pOp/LhG4+vectors+for+stringent+glucocorticoid-dependent+transgene+expression+in+Arabidopsis.">New pOp/LhG4 vectors for stringent glucocorticoid-dependent transgene expression in Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 41 (6), 899-918 (2005).</li><li>Moore, I., Galweiler, L., Grosskopf, D., Schell, J., Palme, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcription+activation+system+for+regulated+gene+expression+in+transgenic+plants.">A transcription activation system for regulated gene expression in transgenic plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (1), 376-381 (1998).</li><li>Samalova, M., Brzobohaty, B., Moore, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pOp6/LhGR:+a+stringently+regulated+and+highly+responsive+dexamethasone-inducible+gene+expression+system+for+tobacco.">pOp6/LhGR: a stringently regulated and highly responsive dexamethasone-inducible gene expression system for tobacco.</a> The Plant Journal. 41 (6), 919-935 (2005).</li><li>Picard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steroid-binding+domains+for+regulating+the+functions+of+heterologous+proteins+in+cis.">Steroid-binding domains for regulating the functions of heterologous proteins in cis.</a> Trends in Cell Biology. 3 (8), 278-280 (1993).</li><li>Schurholz, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comprehensive+Toolkit+for+Inducible,+Cell+Type-Specific+Gene+Expression+in+Arabidopsis.">A Comprehensive Toolkit for Inducible, Cell Type-Specific Gene Expression in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 178 (1), 40-53 (2018).</li><li>Kubo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+switches+for+protoxylem+and+metaxylem+vessel+formation.">Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation.</a> Genes and Development. 19 (16), 1855-1860 (2005).</li><li>Di Laurenzio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SCARECROW+gene+regulates+an+asymmetric+cell+division+that+is+essential+for+generating+the+radial+organization+of+the+Arabidopsis+root.">The SCARECROW gene regulates an asymmetric cell division that is essential for generating the radial organization of the Arabidopsis root.</a> Cell. 86 (3), 423-433 (1996).</li><li>Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+SCARECROW+function+reveals+a+radial+patterning+mechanism+common+to+root+and+shoot.">Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot.</a> Development. 127 (3), 595-603 (2000).</li><li>Hellens, R. P., Edwards, E. A., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pGreen:+a+versatile+and+flexible+binary+Ti+vector+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation.">pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Plant Molecular Biology. 42 (6), 819-832 (2000).</li><li>Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana+using+the+floral+dip+method.">Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method.</a> Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).</li><li>Kleinboelting, N., Huep, G., Kloetgen, A., Viehoever, P., Weisshaar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABI-Kat+SimpleSearch:+new+features+of+the+Arabidopsis+thaliana+T-DNA+mutant+database.">GABI-Kat SimpleSearch: new features of the Arabidopsis thaliana T-DNA mutant database.</a> Nucleic Acids Research. 40 (Database issue), D1211-D1215 (2012).</li><li>. Selection scheme used at GABI-Kat for resistance to sulfadiazine Available from: <a target="_blank" href="https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html">https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html</a> (2018)</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+addition+quantitative+real-time+PCR+(SAQPCR):+a+novel+approach+for+determination+of+transgene+copy+number+avoiding+PCR+efficiency+estimation.">Standard addition quantitative real-time PCR (SAQPCR): a novel approach for determination of transgene copy number avoiding PCR efficiency estimation.</a> PLoS One. 8 (1), e53489 (2013).</li><li>Wallner, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strigolactone-+and+Karrikin-Independent+SMXL+Proteins+Are+Central+Regulators+of+Phloem+Formation.">Strigolactone- and Karrikin-Independent SMXL Proteins Are Central Regulators of Phloem Formation.</a> Current Biology. 27 (8), 1241-1247 (2017).</li><li>Fletcher, J. C., Brand, U., Running, M. P., Simon, R., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+of+cell+fate+decisions+by+CLAVATA3+in+Arabidopsis+shoot+meristems.">Signaling of cell fate decisions by CLAVATA3 in Arabidopsis shoot meristems.</a> Science. 283 (5409), 1911-1914 (1999).</li><li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cellulose+synthases+in+Arabidopsis+secondary+cell+walls.">Visualization of cellulose synthases in Arabidopsis secondary cell walls.</a> Science. 350 (6257), 198-203 (2015).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VASCULAR-RELATED+NAC-DOMAIN6+and+VASCULAR-RELATED+NAC-DOMAIN7+effectively+induce+transdifferentiation+into+xylem+vessel+elements+under+control+of+an+induction+system.">VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN6 and VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN7 effectively induce transdifferentiation into xylem vessel elements under control of an induction system.</a> Plant Physiology. 153 (3), 906-914 (2010).</li><li>Engineer, C. B., Fitzsimmons, K. C., Schmuke, J. J., Dotson, S. B., Kranz, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+a+Gal4-mediated+LUC/GFP/GUS+enhancer+trap+system+in+Arabidopsis.">Development and evaluation of a Gal4-mediated LUC/GFP/GUS enhancer trap system in Arabidopsis.</a> BMC Plant Biology. 5, 9 (2005).</li><li>Aoyama, T., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glucocorticoid-mediated+transcriptional+induction+system+in+transgenic+plants.">A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants.</a> The Plant Journal. 11 (3), 605-612 (1997).</li><li>Decaestecker, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-TSKO+facilitates+efficient+cell+type-,+tissue-,+or+organ-specific+mutagenesis+in+Arabidopsis.">CRISPR-TSKO facilitates efficient cell type-, tissue-, or organ-specific mutagenesis in Arabidopsis.</a> bioRxiv. , (2018).</li></ol>

在这里, 我们描述了生成和应用用于诱导、细胞类型特异性反激活的多功能和全面工具包所需的步骤。在Pop启动子的控制下, 通过携带效应盒的交叉线, 可以研究 f1 一代的误报效应, 从而能够在广泛的细胞类型中快速评估遗传扰动。或者, 效应器构造可用于转换驱动线, 或者通过调整克隆策略, 也可以将驱动程序和效应器构造组合在一个 T-DNA 上。该系统的应用范围从空间和时间控制的误...

后基因组时代生物学的一个主要局限性是破译特定因素或遗传扰动的上下文特定角色。功能丧失和功能增益方法等本构遗传扰动往往只允许对终身适应过程进行终点分析, 混淆了主要效应和次要效应之间的区别。此外, 特定于上下文的功能可以被远处组织或其他发育阶段的大规模影响所掩盖或稀释。此外, 在极端情况下, 杀伤力可以排除任何机械洞察。理想的情况是, 为了避免这些问题, 人们可以分析急性遗传扰动在特定上下文中的影响, 例如以时间解析的方式处理特定的细胞类型。为了实现这一目标, 需要为诱导、细胞类型特异性表达的遗传工具1。为了提供一个资源, 快速评估对特定效应的反应的时空动态, 我们将 GreenGate 系统2提供的克隆的易用性与 Gr-lhg4 系统3的公认有效性结合起来, 4,5,6。在特征良好的细胞类型特异性启动子8的控制下, 我们产生了一组表达嵌合转录因子 LhG4 融合到大鼠皮质激素受体 (GR)7配体结合域的线.在静止状态下, 转录因子仍保留在细胞核之外, 因为 GR 域受细胞质 HSP90 的约束。加入合成配体地塞米松 (Dex) 后, 介导核转移, LhG4 在同源合成 POp-type型启动子 (如 mTurquoise2 记者) 的控制下, 对表达盒进行介导转录包含在驱动程序行中, 以可视化归纳后的表达域。 因此, 从技术上讲, 驱动线还包含一个效应盒。通过将一组带有效应盒的线路交叉, 例如, 在同一p p 型启动子的控制下建立感兴趣的基因, 从而能够快速评估效应表达的急性或长期后果在广泛的细胞类型。
在这里, 我们提供了一个协议, 描述了生成驱动程序和效应线所需的过程, 并演示了如何在芽顶端分生组织、根根顶端分生组织和形成层中诱导和遵循细胞类型的特定表达式。拟 南 芥。为了说明这种方法的能力和特异性, 我们使用了众所周知的转录因子 VND7, 它能够驱动类似二甲苯的二级细胞壁增厚外翻 9.从pSCR10、11驱动线和popo6:vnd7 效应线之间的交叉处理 f1, 导致拟南芥茎淀粉鞘细胞中异位木质样细胞的形成。
为了便于生成构建驱动程序和效应表达质粒所需的大型 DNA 组件, 我们采用了快速高效的 GreenGate 克隆方法2。GreenGate 克隆基于 II 型 S 限制性酶, 如eco31i 或其等分裂体bsai2。这些酶在其不对称识别部位下游切割, 产生不同碱基成分的悬垂。通过将eco31/bsai 限制位点纳入寡核苷酸, 并将特定的悬垂序列分配给 dna 元素, 实现了模块化克隆, 从而促进了大型组件的生成。在 GreenGate 框架中, DNA 模块属于 A-F 类, 基于悬垂序列, 作为适配器并按这个顺序组装。因此, 设计用于放大所需产品的引物应符合所选模块2 (图 1a)。如果有内部的 eco31/Bsa i站点, 并且序列与 greengate 入口和目标模块不兼容, 则可以在不进行突变但效率较低的情况下继续进行。或者, 使用位点定向诱变去除生态 31/Bsa i 限制位点注意不要改变基因产品中的氨基酸.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>K029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Column purification</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit (250)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture chamber for imaging</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG</td>
			<td>1-well tissue culture chamber, on cover glass II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>D139-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eco31I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FD0294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>injection cannula (0.30 x 12 mm, 30 G x 1/2)</td>
			<td>Sterican, Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>T832.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO lambda blue 63x water immersion objectiv</td>
			<td>Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS medium</td>
			<td>Duchefa, Haarlem, Netherlands</td>
			<td>M0221.0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x&#160; 1.1 NA water immersion objective</td>
			<td>Nikon, Minato, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35/10 mm</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Germany</td>
			<td>627102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60/150 mm</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Germany</td>
			<td>628102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 120/120/17</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Germany</td>
			<td>688102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant agar</td>
			<td>Duchefa, Haarlem, Netherlands</td>
			<td>P1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid extraction</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide (PI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razorblade</td>
			<td>Classic, Wilkinson Sword GmbH</td>
			<td>7005115E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tubes</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silwet L-77</td>
			<td>Kurt Obermeier GmbH &#38; Co. KG, Bad Berleburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>3834.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NanoDrop 2000c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfadiazine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>2228.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Ligase 5 U/&#181;l</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Ligase 30 U/&#181;l</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EL0013</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducible, cell type-specific expression in arabidopsis thaliana through lhgr-mediated trans-activation

诱导的组织特异性表达式是研究遗传扰动时空动力学的重要而有力的工具。结合灵活高效的 GreenGate 克隆系统与经过验证的 LhGR 系统 (此处称为 GR-LHG4) 进行诱导表达, 我们生成了一组可驱动效应器表达的转基因拟南芥线盒式磁带在三个主要植物分生组织中的一系列特定细胞类型。为此, 我们选择了以前开发的 Gr-lhg4 系统, 该系统基于嵌合转录因子和同源POp-type 启动子,确保对广泛的表达水平进行严格控制。此外, 为了可视化合成转录因子处于活动状态的表达域, 在Pop4 或 POp4启动子的控制下, 将一个 er 局部的 mTurquoise2 荧光记者编码为驱动程序行。在这里, 我们描述了生成驱动程序或效应线所需的步骤, 并演示了如何诱导和跟踪细胞类型的特异性表达, 在芽顶端分生组织, 根顶端分生组织和拟南芥的形成层。通过使用多个或所有驱动线, 可以快速评估在合成Pop启动子控制下表达一个或多个因素 (效应器) 的特定上下文效果, 例如在一个效应器和多个效应器之间交叉的 f1 工厂中驱动程序行。这种方法的例子是 VND7 的异位表达, NAC 转录因子能够诱导异位继发性细胞壁沉积在细胞自主的方式。

通过 GreenGate 克隆生成驾驶员和效应线
GreenGate 克隆系统以 GoldenGate 克隆为基础, 使用 IIS 限制性内切酶Bsai 或其等重酶体eco31i。由于酶产生的悬垂远离其不对称的识别位置, 悬垂的基础成分可以自由选择, 这是形成系统模块化的基础。每个 pcr 生成的元素 (例如, 启动子序列、CDS 或终止符) 首先插入到一个指定的条目向量中, 该条目向量具有由限制摘要生...

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Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Lhgra 介导的反激活在拟南芥诱导、细胞类型特异性表达中的表达

在这里, 我们描述了一组转基因拟南芥系的产生和应用, 使诱导, 组织特异性表达在三个主要分生组织, 芽顶端分生组织, 根顶端分生组织, 和半位子。

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

发育生物学的主要目标是了解基因的上下文特定作用。这可以通过传统的敲除突变体或构成过度表达线来实现。我们使用模块化的绿色门克隆系统，在模型植物阿拉伯藻扎利亚纳的三个主要元素中生成可致细胞特异性表达的资源。使用相同的模块化克隆策略，此方法可以应用于其他无法转化的植物物种。这个程序的视觉演示是有价值的，因为分析在茎和短顶点中的转活的效果需要解剖之前成像，这可能是相当具有挑战性的。首先，对文本协议中概述的种子进行消毒。接下来，在pH 5.8下准备半强度的Murashige和Skoog介质，并加入1%蔗糖和0.9%的加糖。高压灭式后，将2000溶于DMSO，最终浓度在10至30微摩尔之间。向控制板添加等量的 DMSO。将根部成像的种子放在盘子上，在黑暗和摄氏4度下分层48小时。将板放在植物培养箱的垂直位置，并种植五天。发芽五天后，使用共声激光扫描显微镜对幼苗进行成像。首先，准备和种植文本协议中概述的种子。发芽后六至七天，将每只幼苗转移到单独的盆栽土壤中。如果通过浇水诱导植物，在水中使用25微摩尔DEX溶液，由溶解在乙醇中的25毫摩尔DEX库存中准备。每两到三天浇水一次，直到达到所需的感应时间。如果通过浸渍诱导，准备一升烧杯，含有 750 毫升水，含 0.02% Silwet L77 和 DEX，最终浓度为 25 微摩尔，或相当于 DEX 和模拟处理的 DMSO 量。将单个工厂浸入感应或模拟溶液中 30 秒。每两到三天重复一次，直到所需的成像时间。首先，准备和种植文本协议中概述的种子。发芽后六至七天，将每只幼苗转移到单独的盆栽土壤中。当茎大约一厘米长时，在水中喷洒10至50微摩尔DEX溶液的荧光SAM。对于后期发育阶段的感应和成像，诱导较长茎或侧芽的萨姆。上岗后 24 至 48 小时，解剖 SAM 并继续成像。首先，将幼苗从盘子转移到每千克10微克的碘化丙烯溶液中，并对抗5分钟。将根部放入显微镜成像室中，并使用具有 63 倍水浸目标的共声激光扫描显微镜对根部进行成像。要可视化碘化荧光的丙光，请使用 488 纳米的激发波长，并收集 590 到 660 纳米之间的发射。对于 mTurquoise2 荧光，使用 458 纳米的激发，并使用顺序扫描收集 460 到 615 纳米之间的排放。首先，将手指固定到所需部分的对面。使用剃须刀刀片，切割大约三厘米的段，并执行几个精细的切割。在含有自来水的培养皿中冲洗剃须刀刀片，并收集茎部分。染色部分或直接安装到显微镜幻灯片上。对于染色，在反应管中准备每毫升250微克的碘化丙胺溶液中的一毫升。用移液器从培养皿中去除自来水，用碘化溶液和污渍代替五分钟。然后，取出碘化溶液，并用水冲洗。使用精细钳子或精细画笔，将染色部分转移到显微镜幻灯片中。使用共和激光扫描显微镜与 25 倍浸水浸入镜头成像样品。使用 561 纳米激光激发碘化荧光，并收集 570 到 620 纳米的辐射。使用 405 纳米激光激发由驱动线构造编码的 mTurquoise2 荧光效果器，并收集 425 到 475 纳米的发射。首先，用钳子将茎切到拍摄尖端以下两厘米处。一只手握住茎，用细钳去除花蕾和大香。要去除年轻的原体，请将 SAM 固定在含有 3% 阿加罗斯的培养皿中。接下来，使用双筒望远镜和钳子去除靠近 SAM 的任何年轻原体。将解剖的SAM转移到含有每毫升碘化二丙烯溶液250微克的管子中。让样品染色 5 到 10 分钟，同时确保样品在染色过程中保持完全浸渍。将染色的 SAM 放入含有 3% 的阿加罗斯介质的小培养皿中。用双蒸馏水盖住 SAM。使用配备 25 倍浸水浸入镜头的共声激光扫描显微镜对解剖的 SAAm 进行成像。使用 561 纳米激光激发碘化荧光，并收集 570 到 620 纳米的排放。使用 405 纳米激光激发 mTurquoise2 荧光团，并收集 425 到 475 纳米的发射。在 Z 方向上记录跨越 50 微米的图像堆栈，步长为 0.5 微米。诱导与DEX导致细胞类型特定的mTurquoise2表达在根内皮的phloem前体和凸轮，以及干细胞在拍摄中脂肪。作为转活的测试用例，生成编码辅助细胞壁主转录因子VND7的效应器线，并融合到V16激活域。经过五天的单次治疗，15微升的DEX或DMSO，茎部分准备在开始护套的异位细胞化可视化。诱导样本中的启动护套细胞显示碘化杆道的强烈信号，一些细胞显示木耳细胞中细胞壁的典型电镀增厚。看完这段视频后，您应该清楚地了解如何在不同组织中诱导基因表达，以及如何准备成像样本。按照此过程，已建立的驱动器线可以与其他用户根据其研究兴趣生成的各种效应器结构一起使用。这种捷径应该有助于植物研究人员以保留的时间的方式快速评估细胞类型特异性表达或敲击感兴趣的基因的效果。这种细胞型特异性诱导系统需要使用皮质类固醇二甲苯甲酮。应避免直接接触，因此在治疗过程中佩戴手套和面罩非常重要。

Research

JoVE Journal

Genetics

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

The Terroir Concept Interpreted through Grape Berry Metabolomics and Transcriptomics

风土通过概念葡萄果实代谢组学和转录组解释的

Terroir refers to the combination of environmental factors that affect the characteristics of crops such as grapevine (Vitis vinifera) according to ...

科研

遗传学

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

在人原代细胞培养生物钟基因表达及荷尔蒙分泌的并行测量

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

单细胞基因表达利用多重RT-qPCR的表征罕见的淋巴人群的异质性

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

饲养并在隐藏甲壳虫双链RNA介导的基因敲除，<em&gt;白腹皮蠹</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

可诱导T7 RNA聚合酶介导的多基因表达系统，pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

单细胞基因表达谱使用流式细胞仪和qPCR内部标准

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

通过诱导瞬时转染可控离子通道表达

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

通过两个互补细胞同步方案研究细胞周期调控的基因表达

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

血管动力尾静脉注射对小鼠肝细胞基因的本构和诱导系统的修饰

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

细胞间相互作用中基因表达模式的控制与分析的 Optogenetic 方法

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...