Name: inducible, cell type-specific expression in arabidopsis thaliana through lhgr-mediated trans-activation
Uploaded: 2019-04-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation at JoVE.com

Arbejde i vores laboratorier er understøttet af tyske Research Foundation (DFG) tilskud WO 1660/6-1 (til S.W.) og GR 2104/4-1 (til T.G.) og SFB1101 (til T.G. og J.U.L) og ved et europæisk forskningsråd samlegodsspeditøren giver (PLANTSTEMS 647148) til T.G.  S.W. understøttes gennem Emmy Noether Fellowship af DFG gennem Grant WO 1660/2.

Vektorer og moduler kan fås fra arkivet non-profit, Addgene (https://www.addgene.org).
1. kloning med GreenGate
<ol><li>Design primere med udhæng i tabel 1anførte, erstatter 'NNNN' med modul typespecifikke adapter sekvenser nedenfor: frem: 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) CA* + bestemt sekvens 3´, omvendt: 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) + omvendt supplement af specifikke sekvens 3´. Tilføj de understregede baser for at sikre vedligeholdelse af rammen læsning.<br...

<ol>
	<li>Moore, I., Samalova, M., Kurup, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivated+and+chemically+inducible+gene+expression+in+plants.">Transactivated and chemically inducible gene expression in plants.</a> The Plant Journal. 45 (4), 651-683 (2006).</li><li>Lampropoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GreenGate---a+novel,+versatile,+and+efficient+cloning+system+for+plant+transgenesis.">GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis.</a> PLoS One. 8 (12), e83043 (2013).</li><li>Baroux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictable+activation+of+tissue-specific+expression+from+a+single+gene+locus+using+the+pOp/LhG4+transactivation+system+in+Arabidopsis.">Predictable activation of tissue-specific expression from a single gene locus using the pOp/LhG4 transactivation system in Arabidopsis.</a> Plant Biotechnology Journal. 3 (1), 91-101 (2005).</li><li>Craft, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+pOp/LhG4+vectors+for+stringent+glucocorticoid-dependent+transgene+expression+in+Arabidopsis.">New pOp/LhG4 vectors for stringent glucocorticoid-dependent transgene expression in Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 41 (6), 899-918 (2005).</li><li>Moore, I., Galweiler, L., Grosskopf, D., Schell, J., Palme, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcription+activation+system+for+regulated+gene+expression+in+transgenic+plants.">A transcription activation system for regulated gene expression in transgenic plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (1), 376-381 (1998).</li><li>Samalova, M., Brzobohaty, B., Moore, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pOp6/LhGR:+a+stringently+regulated+and+highly+responsive+dexamethasone-inducible+gene+expression+system+for+tobacco.">pOp6/LhGR: a stringently regulated and highly responsive dexamethasone-inducible gene expression system for tobacco.</a> The Plant Journal. 41 (6), 919-935 (2005).</li><li>Picard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steroid-binding+domains+for+regulating+the+functions+of+heterologous+proteins+in+cis.">Steroid-binding domains for regulating the functions of heterologous proteins in cis.</a> Trends in Cell Biology. 3 (8), 278-280 (1993).</li><li>Schurholz, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comprehensive+Toolkit+for+Inducible,+Cell+Type-Specific+Gene+Expression+in+Arabidopsis.">A Comprehensive Toolkit for Inducible, Cell Type-Specific Gene Expression in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 178 (1), 40-53 (2018).</li><li>Kubo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+switches+for+protoxylem+and+metaxylem+vessel+formation.">Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation.</a> Genes and Development. 19 (16), 1855-1860 (2005).</li><li>Di Laurenzio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SCARECROW+gene+regulates+an+asymmetric+cell+division+that+is+essential+for+generating+the+radial+organization+of+the+Arabidopsis+root.">The SCARECROW gene regulates an asymmetric cell division that is essential for generating the radial organization of the Arabidopsis root.</a> Cell. 86 (3), 423-433 (1996).</li><li>Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+SCARECROW+function+reveals+a+radial+patterning+mechanism+common+to+root+and+shoot.">Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot.</a> Development. 127 (3), 595-603 (2000).</li><li>Hellens, R. P., Edwards, E. A., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pGreen:+a+versatile+and+flexible+binary+Ti+vector+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation.">pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Plant Molecular Biology. 42 (6), 819-832 (2000).</li><li>Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana+using+the+floral+dip+method.">Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method.</a> Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).</li><li>Kleinboelting, N., Huep, G., Kloetgen, A., Viehoever, P., Weisshaar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABI-Kat+SimpleSearch:+new+features+of+the+Arabidopsis+thaliana+T-DNA+mutant+database.">GABI-Kat SimpleSearch: new features of the Arabidopsis thaliana T-DNA mutant database.</a> Nucleic Acids Research. 40 (Database issue), D1211-D1215 (2012).</li><li>. Selection scheme used at GABI-Kat for resistance to sulfadiazine Available from: <a target="_blank" href="https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html">https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html</a> (2018)</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+addition+quantitative+real-time+PCR+(SAQPCR):+a+novel+approach+for+determination+of+transgene+copy+number+avoiding+PCR+efficiency+estimation.">Standard addition quantitative real-time PCR (SAQPCR): a novel approach for determination of transgene copy number avoiding PCR efficiency estimation.</a> PLoS One. 8 (1), e53489 (2013).</li><li>Wallner, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strigolactone-+and+Karrikin-Independent+SMXL+Proteins+Are+Central+Regulators+of+Phloem+Formation.">Strigolactone- and Karrikin-Independent SMXL Proteins Are Central Regulators of Phloem Formation.</a> Current Biology. 27 (8), 1241-1247 (2017).</li><li>Fletcher, J. C., Brand, U., Running, M. P., Simon, R., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+of+cell+fate+decisions+by+CLAVATA3+in+Arabidopsis+shoot+meristems.">Signaling of cell fate decisions by CLAVATA3 in Arabidopsis shoot meristems.</a> Science. 283 (5409), 1911-1914 (1999).</li><li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cellulose+synthases+in+Arabidopsis+secondary+cell+walls.">Visualization of cellulose synthases in Arabidopsis secondary cell walls.</a> Science. 350 (6257), 198-203 (2015).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VASCULAR-RELATED+NAC-DOMAIN6+and+VASCULAR-RELATED+NAC-DOMAIN7+effectively+induce+transdifferentiation+into+xylem+vessel+elements+under+control+of+an+induction+system.">VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN6 and VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN7 effectively induce transdifferentiation into xylem vessel elements under control of an induction system.</a> Plant Physiology. 153 (3), 906-914 (2010).</li><li>Engineer, C. B., Fitzsimmons, K. C., Schmuke, J. J., Dotson, S. B., Kranz, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+a+Gal4-mediated+LUC/GFP/GUS+enhancer+trap+system+in+Arabidopsis.">Development and evaluation of a Gal4-mediated LUC/GFP/GUS enhancer trap system in Arabidopsis.</a> BMC Plant Biology. 5, 9 (2005).</li><li>Aoyama, T., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glucocorticoid-mediated+transcriptional+induction+system+in+transgenic+plants.">A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants.</a> The Plant Journal. 11 (3), 605-612 (1997).</li><li>Decaestecker, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-TSKO+facilitates+efficient+cell+type-,+tissue-,+or+organ-specific+mutagenesis+in+Arabidopsis.">CRISPR-TSKO facilitates efficient cell type-, tissue-, or organ-specific mutagenesis in Arabidopsis.</a> bioRxiv. , (2018).</li></ol>

Her beskriver vi de nødvendige skridt til at generere og anvende en alsidig og omfattende toolkit for inducerbar, celle type specifikke trans-aktivering. Passage linjer transporterer effektor kassetter under for pOp med driver linjer kontrol giver mulighed for at studere effekterne mis udtryk i F1 generation, muliggør en hurtig vurdering af genetiske undertrykkelse af netbårne i en lang række celletyper. Alternativt, effektor konstruktioner kan bruges til at omdanne driver linjer, eller ved at tilpa...

En stor begrænsning i biologi i den postgenomic æra er at dechifrere sammenhæng specifikke rolle en bestemt faktor eller genetiske undertrykkelse af netbårne. Konstituerende genetiske forstyrrelser såsom tab af funktion og gevinst af funktion tilgange ofte kun tillade end-point analyse af livslang tilpasning processer, obfuscating sondringen mellem primære og sekundære virkninger. Derudover kan sammenhæng specifikke funktioner maskeret eller fortyndet med stor skala effekter i fjerntliggende væv eller i andre faser af udvikling. Desuden, i ekstreme tilfælde, dødelighed kan udelukke enhver mekanistiske indblik. Ideelt, for at omgå disse problemer, kunne man analysere effekten af akut genetiske undertrykkelse af netbårne inden for en bestemt sammenhæng som en bestemt celletype på en gang-løst måde. For at opnå dette, er genetiske værktøjer for inducerbar, celle type-specifikke udtryk nødvendigt1. For at give en ressource for hurtig vurdering af en reaktion på en given effektor spatiotemporelle dynamik, har vi kombineret let kloning fra GreenGate system2 med dokumenteret effekten af GR-LhG4 system3, 4,5,6. Vi har genereret et sæt linjer at udtrykke den kimære transskription faktor LhG4 sammenvoksede til ligand bindende domæne af rotte corticoid receptor (GR)7 under kontrol af godt karakteriseret celle type specifikke initiativtagere8. I hvile betingelser, forbliver transskription faktor uden for kernen, som domænet GR er bundet af det cytosole HSP90. Med tilføjelsen af syntetisk ligand dexamethason (Dex), nukleare translokation er induceret og LhG4 vil mægle transskription af udtryk kassetter under kontrol af en beslægtet syntetiske pOp-type promoter, såsom en mTurquoise2 journalist inkluderet i driver linjer til at visualisere domænet udtryk efter induktion.  Således indeholde driver linjer teknisk også en effektor kassette. Passage af et sæt driver linjer med en linje, der transporterer en effektor kassette med, for eksempel et gen af interesse inden for samme pOp-type kontrol dermed giver mulighed for hurtig vurdering af de akutte eller langvarige konsekvenser af effektor udtryk i en lang række celletyper.
Her, leverer vi en protokol, der beskriver de procedurer, der er nødvendige for at generere driver og effektor linjerne og demonstrere hvordan celle type specifikke udtryk kan induceret og fulgt i skyde yderste meristem, roden yderste meristem og cambium af Arabidopsis. For at illustrere den dygtighed og specificiteten af denne tilgang, vi udnytte den velkendte transskription faktor VND7, som er i stand til at køre vedvævet-lignende secondary celle væg fortykkelser ectopically9. Behandling af F1 fra en krydsning mellem pSCR10,11 driver linje og pOp6:VND7 effektor linje fører til dannelsen af ektopiske vedvævet-lignende celler i den stivelse sheath celler i Arabidopsis stammer.
For at lette generation af store DNA forsamlinger kræves til at konstruere driver og effektor udtryk plasmider, brugte vi den hurtige og effektive GreenGate kloning metode2. GreenGate kloning er baseret på type II S restriktionsenzymer Eco31I eller dens isoschizomer Bsa2. Disse enzymer klippe neden for deres asymmetriske genkendelsessekvenser producerer markiser med varierende base sammensætning. Ved at indarbejde Eco31I /Bsajeg begrænsning sites i oligonukleotider og tildeling af specifikke overhæng sekvenser til DNA elementer, modulære kloning er opnået, at lette generation af store forsamlinger. Inden for rammerne af GreenGate DNA moduler kan inddeles i kategorier A-F baseret på overhæng sekvens, der tjener som adaptere og er samlet i rækkefølgen. Primere designet til at forstærke dit ønskede produkt bør derfor i overensstemmelse med det valgte modul2 (figur 1A). Hvis der er en indre Eco31I /Bsajeg site og rækkefølgen er ikke kompatibel med GreenGate løsning og destination moduler, kan du fortsætte uden mutagenizing, men med lavere effektivitet. Alternativt kan du bruge site-directed mutagenese fjerne Eco31I /Bsajeg begrænsning websteder pas på ikke for at ændre aminosyrer i genprodukter.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>K029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Column purification</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit (250)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture chamber for imaging</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG</td>
			<td>1-well tissue culture chamber, on cover glass II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>D139-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eco31I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FD0294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>injection cannula (0.30 x 12 mm, 30 G x 1/2)</td>
			<td>Sterican, Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>T832.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO lambda blue 63x water immersion objectiv</td>
			<td>Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS medium</td>
			<td>Duchefa, Haarlem, Netherlands</td>
			<td>M0221.0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x&#160; 1.1 NA water immersion objective</td>
			<td>Nikon, Minato, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35/10 mm</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Germany</td>
			<td>627102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60/150 mm</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Germany</td>
			<td>628102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 120/120/17</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Germany</td>
			<td>688102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant agar</td>
			<td>Duchefa, Haarlem, Netherlands</td>
			<td>P1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid extraction</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide (PI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razorblade</td>
			<td>Classic, Wilkinson Sword GmbH</td>
			<td>7005115E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tubes</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silwet L-77</td>
			<td>Kurt Obermeier GmbH &#38; Co. KG, Bad Berleburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>3834.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NanoDrop 2000c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfadiazine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>2228.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Ligase 5 U/&#181;l</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Ligase 30 U/&#181;l</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EL0013</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducible, cell type-specific expression in arabidopsis thaliana through lhgr-mediated trans-activation

Inducerbar, væv-specifikke udtryk er et væsentligt og stærkt værktøj til at studere genetiske undertrykkelse af netbårne spatio-temporale dynamik. Kombinerer den fleksible og effektive GreenGate kloning system med den gennemprøvede og benchmarkes LhGR system (her kaldt GR-LhG4) for inducerbar udtryk, har vi genereret et sæt gensplejsede Arabidopsis linjer, der kan drive et udtryk for en effektor kassette i et udvalg af specifikke celletyper i de tre største plante ildens. Med henblik herpå valgte vi den tidligere udviklet GR-LhG4 system baseret på en kimære transskription faktor og en beslægtet pOp-type promoter stram kontrol over en bred vifte af udtryk niveauer. Derudover for at visualisere domænet udtryk hvor de syntetiske transkriptionsfaktor er aktiv, er en ER-lokaliseret mTurquoise2 fluorescerende reporter under for pOp4 eller pOp6 kontrol kodet i driver linjer. Her beskriver vi de nødvendige skridt til at generere en driver eller effektor linje og demonstrere hvordan celle type specifikke udtryk kan induceret og fulgt i skyde yderste meristem, roden yderste meristem og cambium i Arabidopsis. Ved hjælp af flere eller alle driver linjer, kontekst specifikke virkning at udtrykke en eller flere faktorer (effektorer) under kontrol af syntetiske pOp initiativtageren kan vurderes hurtigt, for eksempel i F1 planter af en krydsning mellem en effektor og flere driver linjer. Denne tilgang er eksemplificeret ved den Ektopisk udtryk for VND7, en NAC transskription faktor i stand til at inducere ektopisk secondary celle væg deposition i en celle autonomt.

Generation af driveren og effektor linjer gennem GreenGate kloning
GreenGate kloning system er baseret på GoldenGate kloning og brug type IIS begrænsning liv1975 Bsajeg eller dens isoschizomer Eco31I. Som enzym producerer udhæng fjernt fra sin asymmetriske genkendelsessekvens, base sammensætningen af udhæng kan være frit danne valgte, som er grundlaget modularitet af systemet. Hver PCR-genereret element, for eksempel en promotor sekvens, cd'er eller ter...

Watch this Scientific Journal Video about Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation at JoVE.com

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducerbar, celle Type-specifikke udtryk i Arabidopsis thaliana gennem LhGR-medieret Trans-aktivering

Her, vi beskrive generation og anvendelsen af et sæt af gensplejsede Arabidopsis thaliana linjer aktivering inducerbar, væv-specifikke udtryk i de tre vigtigste ildens, skyde yderste meristem, roden yderste meristem og cambium.

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

Det vigtigste mål i udviklingsbiologi er at forstå et gens kontekstspecifikke rolle. Og dette kan være svært at opnå ved konventionelle knockout mutanter eller ved konstituerende overekspression linjer. Vi brugte det modulære grønne gate kloning system til at generere en ressource for inducerende cyto-specifikke udtryk i de tre vigtigste meristems af modellen anlægget Arabidopsis thaliana.Ved hjælp af den samme modulære kloning strategi, kan denne metode anvendes på andre plantearter, der er uforanderlige til transformation. Visuel demonstration af denne procedure er værdifuld, fordi analysere effekten af trans-aktivering i meristems af stilken og den korte spids kræver dissektion før billeddannelse, som kan være ganske udfordrende. Til at begynde, sterilisere frøene som skitseret i tekstprotokollen.Dernæst forberede halvstyrke Murashige og Skoog medium på pH 5,8 og tilsæt en procent saccharose og 0,9% agar. Efter autoklavering tilsættes Dex opløst i DMSO til induktionspladerne ved en endelig koncentration mellem 10 og 30 mikromolar. Tilføj en tilsvarende mængde DMSO til kontrolpladerne.Sæt frøene til rodbilleddannelse på plader og stratificere dem i 48 timer i mørke og ved fire grader Celsius. Sæt pladerne i en lodret position i en plante inkubator og dyrke dem i fem dage. Fem dage efter spiring, bruge konfokale laser scanning mikroskopi til at billedet planterne.Til at begynde, forberede og dyrke frøene som beskrevet i tekstprotokollen. Seks til syv dage efter spiring, overføre hver kimplante til jord i en separat gryde. Hvis planterne fremkaldes ved vanding, skal der anvendes en 25 mikromolar DEX-opløsning i vand, fremstillet af en bestand på 25 millimolar DEX opløst i ethanol.Vand hver to til tre dage, indtil den ønskede tid af induktion. Hvis der fremkaldes ved dypning, forberedes et en-liters bægerglas med 750 milliliter vand, der indeholder 0,02%Silwet L77 og DEX ved 25 mikromolar endelige koncentration eller en tilsvarende mængde DMSO til DEX og mock behandling. Dyp en enkelt plante i induktion eller mock opløsning i 30 sekunder.Gentag hver to til tre dage, indtil det ønskede tidspunkt for billeddannelse. Til at begynde, forberede og dyrke frøene som beskrevet i tekstprotokollen. Seks til syv dage efter spiring, overføre hver kimplante til jord i en separat gryde.Når stilken er omkring en centimeter lang, spray den influorescerende SAM med mellem 10 og 50 mikromolar DEX opløsning i vand. Til induktion og billeddannelse på senere udviklingsstadier fremkalder SAM'er af længere stængler eller sideskud. 24 til 48 timer efter induktion, dissekerer SAM'erne og fortsæt til billeddannelse.Først overføres frøplanterne fra pladen til en 10 mikrogram pr. millileter opløsning af propidiumdodid og kontrastain dem i fem minutter. Placer rødderne i et mikroskop billeddannelse kammer og billede dem ved hjælp af en konfokal laser scanning mikroskop med en 63x vand nedsænkning mål. For at visualisere propidium iodid fluorescens, bruge en excitation bølgelængde på 488 nanometer og indsamle emissioner mellem 590 og 660 nanometer.For mTurquoise2 fluorescens anvendes 458 nanometerexcitation og emission mellem 460 og 615 nanometer ved sekventiel scanning. Først skal du fastsætte en stilk med en finger på den modsatte side af den ønskede sektion. Ved hjælp af et barberblad, skære et segment på cirka tre centimeter og udføre flere fine nedskæringer.Skyl barberbladet i en petriskål, der indeholder vand fra hanen, og opsaml stængesektionerne. Enten plette sektioner eller direkte montere dem på mikroskop dias. Til farvning tilberedes en milliliter 250 mikrogram pr. millilitopløsning propidiumidodid i et reaktionsrør.Fjern vand fra hanen fra petriskålen med en pipette og udskift det med propidiumidodidopløsningen og pletten i fem minutter. Fjern derefter propidiumdodidopløsningen og skyl med vand. Brug enten fine penps eller en fin pensel, overføre de farvede sektioner til mikroskop dias.Brug en konfokal laserscanning mikroskop med en 25x dypning vand nedsænkning linse til at billedet prøverne. Brug en 561 nanometer laserlys til at ophidse propidium iodid fluorescens og indsamle emissioner fra 570 til 620 nanometer. Brug en 405 nanometer laserlys til at ophidse mTurquoise2 fluorophore effektor kodet af føreren linje konstruktioner og indsamle emissioner fra 425 til 475 nanometer.Først skal du bruge kraftspring til at skære stilken to centimeter under skydespidsen. Hold stilken i den ene hånd og bruge fine kraftvipper til at fjerne blomsterknopper og store primordia. For at fjerne unge primordia, fastsætte SAM i en oprejst position i en petriskål, der indeholder tre procent agarose.Brug derefter en kikkert og en styrke til at fjerne eventuelle unge primordia tæt på SAM. Den dissekerede SAM overføres til et rør, der indeholder en 250 mikrogram pr. milliliteropløsning af propidiumidodid. Prøvepletten i fem til 10 minutter, mens prøven forbliver helt nedsænket under farvningsproceduren.Placer den farvede SAM i en lille petriskål, der indeholder tre procent agarose medium. Dæk SAM med dobbelt destilleret vand. Brug en konfokal laserscanning mikroskop udstyret med en 25x dypning vand nedsænkning linse til billede af dissekerede SAM'er.Brug en 561 nanometer laserlys til at ophidse propidium iodid fluorescens og indsamle emissioner fra 570 til 620 nanometer. Brug en 405 nanometer laserlys til at ophidse mTurquoise2 fluorophore og indsamle emissioner fra 425 til 475 nanometer. Optag billedstakke, der spænder over 50 mikrometer i Z-retningen med en trinstørrelse på 0,5 mikrometer.Induktion med DEX fører til celle-type specifikke mTurquoise2 udtryk i roden endodermis phloem prækursorer og cambium, og stamceller i skyde apikale meristem. Som en prøvesag for transaktivering genereres der en effektorlinje, der kodning af den sekundære cellevægsmestertransskriptionsfaktor VND7, der er smeltet til V16-aktiveringsdomænet. Efter fem dages enkeltbehandling med enten 15 mikroliter DEX eller DMSO forberedes stængelsektioner til visualisering af den ektopiske lignificering i startkappen.Startmembrancellerne i inducerede prøver viser et stærkt signal til propidiumidodidkanalen, og nogle celler viser den typiske retikulere fortykkelse af cellevæggen i xylem-celler. Efter at have set denne video, bør du have en klar forståelse af, hvordan man fremkalder genekspression i forskellige væv, og hvordan du forbereder dine prøver til billeddannelse. Efter denne procedure kan de etablerede driverlinjer bruges med en lang række effektorkonstruktioner, der genereres af andre brugere i henhold til deres forskningsinteresser.Denne genvej bør hjælpe planteforskere til hurtigt at vurdere effekten af celle-type specifikke udtryk eller knockdown af et gen af interesse i en tid reserveret måde. Dette cellespecifikke induktionssystem kræver brug af kortikosteroid dexamethason. Direkte kontakt bør undgås, så det er vigtigt at bære handsker og en ansigtsmaske under behandlingen.

Research

JoVE Journal

Genetics

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

The Terroir Concept Interpreted through Grape Berry Metabolomics and Transcriptomics

Den Terroir Concept Fortolket gennem Grape Berry Metabolomics og Transcriptomics

Terroir refers to the combination of environmental factors that affect the characteristics of crops such as grapevine (Vitis vinifera) according to ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Parallel Måling af døgnrytmen ur genekspression og hormon sekretion i Human primære cellekulturer

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

Single-celle genekspression Brug Multiplex RT-qPCR at Karakterisere Meget forskellige sjældne Lymfoide populationer

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Opdræt og dobbelt-strenget RNA-medieret Gene Knockdown i Skjul Beetle,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Inducerbart T7 RNA Polymerase-medieret Multigen Expressions System, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Single-celle Gene Expression Profiling Brug FACS og qPCR med interne standarder

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Kontrollerbar Ion Channel Expression gennem Inducible Transient transfektion

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

Studie af Cyklusreguleret Gen Expression af To Komplementære Celle Synkronisering Protokoller

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Konstituerende og inducerbar systemer for genetiske In Vivo ændring af mus hepatocytter brug af hydrodynamiske hale vene injektion

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

En Optogenetic metode til at styre og analysere gen Expression mønstre i celle-til-celle interaktioner

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...