Name: inducible, cell type-specific expression in arabidopsis thaliana through lhgr-mediated trans-activation
Uploaded: 2019-04-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation at JoVE.com

Werk in onze laboratoria wordt ondersteund door de Duitse Research Foundation (DFG) subsidies WO 1660/6-1 (S.W.) en GR 2104/4-1 (T.G.) en SFB1101 (aan T.G. en J.U.L) en door een Europese Onderzoeksraad consolidator toekennen (PLANTSTEMS 647148) T.G.  S.W. wordt ondersteund door de Emmy Noether Fellowship van de DFG door Grant WO 1660/2.

Vectoren en modules kunnen worden verkregen bij de non-profit repository, Addgene (https://www.addgene.org).
1. klonen met behulp van GreenGate
<ol><li>Ontwerp primers met behulp van de in tabel 1genoemde overhangen, ter vervanging van 'NNNN' met module type-specifieke adapter sequenties hieronder: vooruit: 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) CA* + specifieke volgorde 3´, Reverse: 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) + omgekeerde aanvulling van specifieke reeks 3´. De onderst...

<ol>
	<li>Moore, I., Samalova, M., Kurup, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivated+and+chemically+inducible+gene+expression+in+plants.">Transactivated and chemically inducible gene expression in plants.</a> The Plant Journal. 45 (4), 651-683 (2006).</li><li>Lampropoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GreenGate---a+novel,+versatile,+and+efficient+cloning+system+for+plant+transgenesis.">GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis.</a> PLoS One. 8 (12), e83043 (2013).</li><li>Baroux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictable+activation+of+tissue-specific+expression+from+a+single+gene+locus+using+the+pOp/LhG4+transactivation+system+in+Arabidopsis.">Predictable activation of tissue-specific expression from a single gene locus using the pOp/LhG4 transactivation system in Arabidopsis.</a> Plant Biotechnology Journal. 3 (1), 91-101 (2005).</li><li>Craft, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+pOp/LhG4+vectors+for+stringent+glucocorticoid-dependent+transgene+expression+in+Arabidopsis.">New pOp/LhG4 vectors for stringent glucocorticoid-dependent transgene expression in Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 41 (6), 899-918 (2005).</li><li>Moore, I., Galweiler, L., Grosskopf, D., Schell, J., Palme, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcription+activation+system+for+regulated+gene+expression+in+transgenic+plants.">A transcription activation system for regulated gene expression in transgenic plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (1), 376-381 (1998).</li><li>Samalova, M., Brzobohaty, B., Moore, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pOp6/LhGR:+a+stringently+regulated+and+highly+responsive+dexamethasone-inducible+gene+expression+system+for+tobacco.">pOp6/LhGR: a stringently regulated and highly responsive dexamethasone-inducible gene expression system for tobacco.</a> The Plant Journal. 41 (6), 919-935 (2005).</li><li>Picard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steroid-binding+domains+for+regulating+the+functions+of+heterologous+proteins+in+cis.">Steroid-binding domains for regulating the functions of heterologous proteins in cis.</a> Trends in Cell Biology. 3 (8), 278-280 (1993).</li><li>Schurholz, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comprehensive+Toolkit+for+Inducible,+Cell+Type-Specific+Gene+Expression+in+Arabidopsis.">A Comprehensive Toolkit for Inducible, Cell Type-Specific Gene Expression in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 178 (1), 40-53 (2018).</li><li>Kubo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+switches+for+protoxylem+and+metaxylem+vessel+formation.">Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation.</a> Genes and Development. 19 (16), 1855-1860 (2005).</li><li>Di Laurenzio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SCARECROW+gene+regulates+an+asymmetric+cell+division+that+is+essential+for+generating+the+radial+organization+of+the+Arabidopsis+root.">The SCARECROW gene regulates an asymmetric cell division that is essential for generating the radial organization of the Arabidopsis root.</a> Cell. 86 (3), 423-433 (1996).</li><li>Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+SCARECROW+function+reveals+a+radial+patterning+mechanism+common+to+root+and+shoot.">Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot.</a> Development. 127 (3), 595-603 (2000).</li><li>Hellens, R. P., Edwards, E. A., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pGreen:+a+versatile+and+flexible+binary+Ti+vector+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation.">pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Plant Molecular Biology. 42 (6), 819-832 (2000).</li><li>Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana+using+the+floral+dip+method.">Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method.</a> Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).</li><li>Kleinboelting, N., Huep, G., Kloetgen, A., Viehoever, P., Weisshaar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABI-Kat+SimpleSearch:+new+features+of+the+Arabidopsis+thaliana+T-DNA+mutant+database.">GABI-Kat SimpleSearch: new features of the Arabidopsis thaliana T-DNA mutant database.</a> Nucleic Acids Research. 40 (Database issue), D1211-D1215 (2012).</li><li>. Selection scheme used at GABI-Kat for resistance to sulfadiazine Available from: <a target="_blank" href="https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html">https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html</a> (2018)</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+addition+quantitative+real-time+PCR+(SAQPCR):+a+novel+approach+for+determination+of+transgene+copy+number+avoiding+PCR+efficiency+estimation.">Standard addition quantitative real-time PCR (SAQPCR): a novel approach for determination of transgene copy number avoiding PCR efficiency estimation.</a> PLoS One. 8 (1), e53489 (2013).</li><li>Wallner, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strigolactone-+and+Karrikin-Independent+SMXL+Proteins+Are+Central+Regulators+of+Phloem+Formation.">Strigolactone- and Karrikin-Independent SMXL Proteins Are Central Regulators of Phloem Formation.</a> Current Biology. 27 (8), 1241-1247 (2017).</li><li>Fletcher, J. C., Brand, U., Running, M. P., Simon, R., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+of+cell+fate+decisions+by+CLAVATA3+in+Arabidopsis+shoot+meristems.">Signaling of cell fate decisions by CLAVATA3 in Arabidopsis shoot meristems.</a> Science. 283 (5409), 1911-1914 (1999).</li><li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cellulose+synthases+in+Arabidopsis+secondary+cell+walls.">Visualization of cellulose synthases in Arabidopsis secondary cell walls.</a> Science. 350 (6257), 198-203 (2015).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VASCULAR-RELATED+NAC-DOMAIN6+and+VASCULAR-RELATED+NAC-DOMAIN7+effectively+induce+transdifferentiation+into+xylem+vessel+elements+under+control+of+an+induction+system.">VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN6 and VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN7 effectively induce transdifferentiation into xylem vessel elements under control of an induction system.</a> Plant Physiology. 153 (3), 906-914 (2010).</li><li>Engineer, C. B., Fitzsimmons, K. C., Schmuke, J. J., Dotson, S. B., Kranz, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+a+Gal4-mediated+LUC/GFP/GUS+enhancer+trap+system+in+Arabidopsis.">Development and evaluation of a Gal4-mediated LUC/GFP/GUS enhancer trap system in Arabidopsis.</a> BMC Plant Biology. 5, 9 (2005).</li><li>Aoyama, T., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glucocorticoid-mediated+transcriptional+induction+system+in+transgenic+plants.">A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants.</a> The Plant Journal. 11 (3), 605-612 (1997).</li><li>Decaestecker, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-TSKO+facilitates+efficient+cell+type-,+tissue-,+or+organ-specific+mutagenesis+in+Arabidopsis.">CRISPR-TSKO facilitates efficient cell type-, tissue-, or organ-specific mutagenesis in Arabidopsis.</a> bioRxiv. , (2018).</li></ol>

Hier beschrijven we de noodzakelijke stappen voor het genereren en toepassen van een veelzijdige en uitgebreide toolkit voor afleidbare, cel type specifieke trans-activering. Overschrijding van lijnen uitvoering effector cassettes onder controle van de promoter pOp met stuurprogramma lijnen kunt deelneemt bestudeert de effecten van verkeerde expressie in de F1-generatie, de snelle beoordeling van genetische perturbation in een breed scala van celtypes inschakelen. U kunt ook effector constructies kunnen...

Een belangrijke beperking in de biologie in het postgenomic tijdperk is te ontcijferen van de specifieke rol van de context van een gegeven factor of genetische perturbation. Constitutieve genetische verstoringen zoals verlies-van- en winst-van-functie benaderingen vaak alleen toestaan eindpunt analyse van levenslang aanpassing processen, het onderscheid tussen primaire en secundaire effecten obfuscating. Daarnaast kunnen specifieke functies van de context worden gemaskeerd of verdund door grootschalige effecten in verre weefsels of tijdens de andere fasen van ontwikkeling. Bovendien, in extreme gevallen, kan letaliteit beletsel voor ieder mechanistische inzicht. Ideaal, om deze kwesties te omzeilen, kan een analyseren het effect van acute genetische perturbation binnen een specifieke context, zoals een specifieke celtype in een time-resolved wijze. Om dit te bereiken, zijn genetische hulpmiddelen voor afleidbare, cel type-specifieke expressie vereist1. Om een bron voor de snelle beoordeling van de spatio dynamiek van een reactie op een bepaalde effector, hebben wij gebundeld in het gemak van het klonen van de GreenGate systeem2 voorzien van de bewezen doeltreffendheid van de GR-LhG4 systeem3, 4,5,6. We hebben een verzameling lijnen uiten het chimeer transcriptiefactor dat lhg4 tot het ligand bindend domein van de rat corticoid receptor (GR)7 onder de controle van goed gekarakteriseerd cel type specifieke initiatiefnemers8 gesmoltengegenereerd. In rust voorwaarden, blijft de transcriptiefactor buiten de kern, zoals het domein GR is gebonden door de cytosolische HSP90. Met de toevoeging van synthetische ligand dexamethason (Dex), nucleaire translocatie wordt geïnduceerd en LhG4 zal bemiddelen transcriptie van expressie cassettes onder controle van de promotor van een cognaat synthetische pOp-type , zoals een mTurquoise2 verslaggever opgenomen in de regels van de bestuurder te visualiseren van het domein van de expressie na inductie.  Dus, de bestuurder regels technisch bevatten ook een effector cassette. Het overschrijden van een verzameling stuurprogramma lijnen met een lijn met een effector cassette met, bijvoorbeeld, een gen van belang onder controle van de promoter pOp-type dezelfde dus laat de snelle beoordeling van de acute of langdurige gevolgen van effector expressie in een groot aantal celtypes.
Hier bieden we een protocol met een beschrijving van de procedures die noodzakelijk zijn voor het genereren van de bestuurder en effector lijnen en aantonen hoe cel type specifieke expressie kan worden geïnduceerd en volgde in het schieten apicale meristeem, de wortel apicale meristeem en de cambium van Arabidopsis. Om te illustreren de dapperheid en de specificiteit van deze aanpak, we gebruik maken van de bekende transcriptiefactor VND7 die in staat van rijden xylem-achtige secundaire cel muur heeft ectopically is9. Behandeling van de F1 van een kruising tussen de pSCR10,11 driver regel en de regel pOp6:VND7 effector leidt tot de vorming van ectopische xylem-achtige cellen in de schede van de zetmeel cellen van de Arabidopsis voortvloeien.
Ter vergemakkelijking van de generatie van grote verzamelingen van DNA nodig voor de bouw van de bestuurder en effector expressie plasmiden, gebruikten we de snelle en efficiënte GreenGate klonen van methode2. Het klonen van GreenGate is gebaseerd op de enzymen van de beperking van type II S zoals Eco31I of de isoschizomer Bsaik2. Deze enzymen knippen stroomafwaarts van hun sites van de asymmetrische erkenning overhangen met variërende basis samenstelling produceren. Door de integratie van Eco31I /Bsaik beperking sites in oligonucleotides en specifieke overstek sequenties aan DNA-elementen toe te wijzen, modulaire klonen is bereikt, het vergemakkelijken van het genereren van grote verzamelingen. In het kader van GreenGate vallen DNA modules in de categorieën A-F op basis van de volgorde van de overhang die dienen als adapters en worden geassembleerd in die volgorde. Daarom moet de inleidingen aan het versterken van uw gewenste product ontworpen overeenkomstig de geselecteerde module2 (figuur 1A). Als er een interne Eco31I is /Bsaik site en de volgorde is niet compatibel met de GreenGate ingang en bestemming modules, kunt u doorgaan zonder mutagenizing, maar met lagere efficiëntie. Als alternatief, plaats-geleide mutagenese kunt verwijderen Eco31I /Bsaik beperkingsplaatsen verzorgen als u niet wilt wijzigen van aminozuren in genproducten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>K029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Column purification</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit (250)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture chamber for imaging</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG</td>
			<td>1-well tissue culture chamber, on cover glass II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>D139-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eco31I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FD0294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>injection cannula (0.30 x 12 mm, 30 G x 1/2)</td>
			<td>Sterican, Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>T832.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO lambda blue 63x water immersion objectiv</td>
			<td>Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS medium</td>
			<td>Duchefa, Haarlem, Netherlands</td>
			<td>M0221.0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x&#160; 1.1 NA water immersion objective</td>
			<td>Nikon, Minato, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35/10 mm</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Germany</td>
			<td>627102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60/150 mm</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Germany</td>
			<td>628102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 120/120/17</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Germany</td>
			<td>688102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant agar</td>
			<td>Duchefa, Haarlem, Netherlands</td>
			<td>P1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid extraction</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide (PI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razorblade</td>
			<td>Classic, Wilkinson Sword GmbH</td>
			<td>7005115E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tubes</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silwet L-77</td>
			<td>Kurt Obermeier GmbH &#38; Co. KG, Bad Berleburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>3834.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NanoDrop 2000c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfadiazine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>2228.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Ligase 5 U/&#181;l</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Ligase 30 U/&#181;l</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EL0013</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducible, cell type-specific expression in arabidopsis thaliana through lhgr-mediated trans-activation

Afleidbare, weefsel-specifieke expressie is een belangrijk en krachtig hulpmiddel om te studeren de spatio-temporele dynamiek van genetische perturbation. De flexibele en efficiënte GreenGate klonen systeem met het bewezen en warempel LhGR systeem (hier genoemd GR-LhG4) voor de afleidbare expressie te combineren, hebben we gegenereerd een verzameling transgene Arabidopsis lijnen die de uitdrukking van een effector kan rijden cassette in een aantal specifieke celtypes in de drie belangrijkste plant meristems. Te dien einde, kozen we voor de eerder ontwikkelde GR-LhG4-systeem dat is gebaseerd op een chimeer transcriptiefactor en de promotor van een cognaat pOp-type zorgen voor een strakke controle over een breed scala van expressie niveaus. Bovendien, om te visualiseren het domein van de expressie waar de synthetische transcriptiefactor actief is, is een verslaggever ER-gelokaliseerde mTurquoise2 fluorescerende onder controle van de promoter pOp4 of pOp6 gecodeerd in stuurprogramma lijnen. Hier beschrijven we de noodzakelijke stappen voor het genereren van een stuurprogramma of effector lijn en demonstreren hoe cel type specifieke expressie kan worden geïnduceerd en volgde in het schieten apicale meristeem, de wortel apicale meristeem en de cambium van Arabidopsis. Met behulp van meerdere of alle stuurprogramma lijnen, het specifieke effect van kader uiting te geven aan een of meerdere factoren (effectoren) onder controle van de promoter synthetische pOp kan worden beoordeeld snel, bijvoorbeeld in F1 planten van een kruising tussen een effector en meerdere stuurprogramma lijnen. Deze aanpak wordt geïllustreerd door de ectopische uitdrukking van VND7, een NAC transcriptiefactor staat inducerende ectopische cel van de secundaire muur depositie op autonome wijze van een cel.

Generatie van bestuurder en effector lijnen door GreenGate klonen
De GreenGate klonen systeem is gebaseerd op GoldenGate klonen en gebruik de type IIS beperking endonuclease Bsaik of zijn isoschizomer Eco31I. Zoals het enzym produceert overhangen verre van de asymmetrische erkenning-site, de basis samenstelling van de overhangen kunnen vrij worden vormen gekozen, die de basis vormt de modulariteit van het systeem. Elk element van PCR-gegenereerd, bijvoorbeeld...

Watch this Scientific Journal Video about Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation at JoVE.com

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Afleidbare, cel Type-specifieke uiting in Arabidopsis thaliana via LhGR-gemedieerde Trans-activering

Hier beschrijven we de generatie en toepassing van een geheel van transgene Arabidopsis thaliana lijnen inschakelen afleidbare, weefsel-specifieke expressie in de drie belangrijkste meristems, het schieten apicale meristeem, de wortel apicale meristeem en het cambium.

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

Het belangrijkste doel in de ontwikkelingsbiologie is om de contextspecifieke rol van een gen te begrijpen. En dit kan moeilijk te bereiken zijn door conventionele knock-out mutanten of door constitutieve overexpressie lijnen. We gebruikten het modulaire groene poortkloonsysteem om een bron te genereren voor inducible cyto-specifieke expressie in de drie belangrijkste meristems van de modelplant Arabidopsis thaliana.Met behulp van dezelfde modulaire kloonstrategie kan deze methode worden toegepast op andere plantensoorten die onveranderlijk zijn voor transformatie. Visuele demonstratie van deze procedure is waardevol omdat het analyseren van het effect van trans-activering in de meristems van de stam en de korte top dissectie vereist voor beeldvorming, wat behoorlijk uitdagend kan zijn. Om te beginnen steriliseren de zaden zoals beschreven in het tekstprotocol.Bereid vervolgens het medium Half-Sterkte Murashige en Skoog voor op pH 5,8 en voeg 1 procent sacharose en 0,9% agar toe. Voeg Na autoclaving Dex opgelost in DMSO toe aan de inductieplaten bij een uiteindelijke concentratie tussen 10 en 30 micromolar. Voeg een gelijke hoeveelheid DMSO toe aan de controleplaten.Zet de zaden voor wortel beeldvorming op platen en stratificatie ze voor 48 uur in het donker en op vier graden Celsius. Zet de platen in een verticale positie in een plantenbroedmachine en laat ze vijf dagen groeien. Vijf dagen na de ontkieming, gebruik confocale laser scanning microscopie om de zaailingen beeld.Om te beginnen, bereiden en groeien de zaden zoals beschreven in het tekstprotocol. Zes tot zeven dagen na de ontkieming, breng elke zaailing naar de bodem in een aparte pot. Als u de planten door water geeft, gebruikt u een DEX-oplossing van 25 micromolar in water, bereid uit een voorraad van 25 millimolar DEX opgelost in ethanol.Water om de twee tot drie dagen tot de gewenste tijd van inductie. Als u dompelen door dompelen, bereiden een een-liter beker met 750 milliliter water met 0,02%Silwet L77 en DEX bij 25 micromolar definitieve concentratie of een gelijkwaardige hoeveelheid DMSO voor de DEX en mock behandeling. Dompel een enkele plant gedurende 30 seconden in de inductie- of schijnoplossing.Herhaal elke twee tot drie dagen, tot de gewenste tijd van beeldvorming. Om te beginnen, bereiden en groeien de zaden zoals beschreven in het tekstprotocol. Zes tot zeven dagen na de ontkieming, breng elke zaailing naar de bodem in een aparte pot.Wanneer de stengel ongeveer een centimeter lang is, spuit de influorescente SAM met tussen de 10 en 50 micromolar DEX-oplossing in water. Voor inductie en beeldvorming in latere stadia van ontwikkeling, induceren SAM's van langere stengels of zijscheuten. 24 tot 48 uur na inductie ontleedt u de SAM's en gaat u over tot beeldvorming.Breng eerst de zaailingen van de plaat naar een 10 microgram per millileteroplossing van propidiumjodide en houd ze gedurende vijf minuten tegen. Plaats de wortels in een microscoop beeldkamer en beeld ze met behulp van een confocale laser scanning microscoop met een 63x water onderdompeling doelstelling. Om propidium jodidefluorescentie te visualiseren, gebruik je een excitatiegolflengte van 488 nanometer en verzamel je de uitstoot tussen 590 en 660 nanometer.Gebruik voor mTurquoise2 fluorescentie 458 nanometer excitatie en verzamel de uitstoot tussen 460 en 615 nanometer met behulp van sequentiële scanning. Bevestig eerst een steel met een vinger aan de andere kant van de gewenste sectie. Met behulp van een scheermesje, snijd een segment van ongeveer drie centimeter en het uitvoeren van verschillende fijne bezuinigingen.Spoel het scheermesje in een petrischaaltje met kraanwater en verzamel de stengelsecties. Ofwel vlekken op de secties of direct monteren op microscoop dia's. Voor het bevlekken, bereiden een milliliter van een 250 microgram per milliliter oplossing van propidium jodide in een reactiebuis.Haal het kraanwater uit de petrischaal met een pipet en vervang het gedurende vijf minuten door de propidium jodideoplossing en vlek. Verwijder vervolgens de propidium jodideoplossing en spoel af met water. Met behulp van fijne tangen of een fijne penseel, breng de gekleurde secties naar microscoop dia's.Gebruik een confocale laser scanning microscoop met een 25x dompelen water onderdompeling lens om de monsters beeld. Gebruik een laserlicht van 561 nanometer om propidium jodidefluorescentie op te wekken en de uitstoot van 570 tot 620 nanometer te verzamelen. Gebruik een laserlicht van 405 nanometer om de mTurquoise2 fluorofofofeffector te prikkelen die door de bestuurderslijn is gecodeerd en de uitstoot van 425 tot 475 nanometer te verzamelen.Gebruik eerst tangen om de steel twee centimeter onder de schietpunt te snijden. Houd de steel in één hand en gebruik fijne tangen om de bloemknoppen en grote primordia te verwijderen. Om jonge primordia te verwijderen, bevestigt u de SAM rechtop in een petrischaaltje met drie procent agarose.Gebruik vervolgens een verrekijker en tangen om een jonge primordia dicht bij de SAM te verwijderen. Breng de ontleed SAM over op een buis met een 250 microgram per milliliter oplossing van propidium jodide. Laat het monster vijf tot tien minuten vlekken terwijl u ervoor zorgt dat het monster tijdens de kleuringsprocedure volledig onder water blijft.Plaats de gekleurde SAM in een kleine petrischaal met drie procent agarose medium. Bedek de SAM met dubbel gedestilleerd water. Gebruik een confocale laser scanning microscoop uitgerust met een 25x dompelen water onderdompeling lens om het beeld van de ontleed SAM's.Gebruik een laserlicht van 561 nanometer om propidium jodidefluorescentie op te wekken en emissies te verzamelen van 570 tot 620 nanometer. Gebruik een laserlicht van 405 nanometer om de mTurquoise2 fluorofoof op te wekken en de uitstoot van 425 tot 475 nanometer te verzamelen. Neem beeldstapels van 50 micrometer in de Z-richting op met een stapgrootte van 0,5 micrometer.Inductie met DEX leidt tot cel-type specifieke mTurquoise2 expressie in de wortel endodermis de phloem precursoren en cambium, en de stamcellen in de shoot apicale meristem. Als testcase voor transactivering wordt een effectorregel gegenereerd die de secundaire celwandmastertranscriptiefactor VND7 fused naar het V16-activeringsdomein zingsel. Na vijf dagen van enkele behandeling met ofwel 15 microliters van DEX of DMSO, worden stamsecties voorbereid op de visualisatie van de buitenbaarmoederlijke lignificatie in de beginschede.De start schede cellen in geïnduceerde monsters tonen een sterk signaal voor de propidium jodide kanaal en sommige cellen tonen de typische reticulate verdikking van de celwand in xylem cellen. Na het bekijken van deze video, moet u een duidelijk begrip van hoe genexpressie in verschillende weefsels induceren en hoe u uw monsters voor te bereiden op beeldvorming. Na deze procedure kunnen de gevestigde bestuurderslijnen worden gebruikt met een breed scala aan effectorconstructies die door andere gebruikers worden gegenereerd op basis van hun onderzoeksinteresses.Deze snelkoppeling moet plantenonderzoekers helpen om snel het effect van celtypespecifieke expressie of knockdown van een gen van belang op een tijd gereserveerde manier te beoordelen. Dit celspecifieke inductiesysteem vereist het gebruik van de corticosteroïde dexamethasone. Direct contact moet worden vermeden, dus het is belangrijk om handschoenen en een gezichtsmasker te dragen tijdens de behandeling.

Research

JoVE Journal

Genetics

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

The Terroir Concept Interpreted through Grape Berry Metabolomics and Transcriptomics

De Terroir Concept Uitgelegd door de Bes van de Druif Metabolomics en Transcriptomics

Terroir refers to the combination of environmental factors that affect the characteristics of crops such as grapevine (Vitis vinifera) according to ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Parallel Meting van de circadiane klok genexpressie en hormoon in Human primaire celculturen

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

Eencellige genexpressie met behulp van Multiplex RT-qPCR heterogeniteit van Rare lymfoïde populaties karakteriseren

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Grootbrengen en Double-stranded RNA-gemedieerde gen knock-down in het verbergen Kever,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Induceerbaar T7 RNA Polymerase-gemedieerde Multigene Expression System, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Eencellige Gene Expression Profiling Met behulp van FACS en qPCR met interne standaarden

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Controleerbaar Ion Channel Expression door middel Induceerbare tijdelijke transfectie

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

Het bestuderen van celcyclusreguleerde genuitdrukking door twee complementaire celsynchronisatieprotocollen

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutieve en afleidbare systemen voor genetische In Vivo wijziging van muis hepatocyten gebruik hydrodynamische staart veneuze injectie

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Een Optogenetic methode te controleren en analyseren van gen expressiepatronen in cel-naar-cel interacties

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...