Name: inducible, cell type-specific expression in arabidopsis thaliana through lhgr-mediated trans-activation
Uploaded: 2019-04-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation at JoVE.com

Travail dans nos laboratoires est pris en charge par le fondation de recherche allemande (DFG) subventions WO 1660/6-1 (S.W.) et GR 2104/4-1 (à T.G.) et SFB1101 (à T.G. et J.U.L) et par un Conseil de recherche européen consolidator grant (PLANTSTEMS 647148) à T.G.  S.W. est pris en charge par le biais de l’Emmy Noether Fellowship de la DFG par Grant WO 1660/2.

Vecteurs et modules peuvent être obtenus du référentiel à but non lucratif, Addgene (https://www.addgene.org).
1. clonage à l’aide de GreenGate
<ol><li>Des amorces de conception en utilisant les surplombs énumérés au tableau 1, remplacer « NNNN » avec des séquences d’adaptateur spécifique au type de module ci-dessous : vers l’avant : 5´AACA GGTCTC NNNN (n) CA* + 3´ de séquence spécifique, inverser : 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) + mar...

<ol>
	<li>Moore, I., Samalova, M., Kurup, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivated+and+chemically+inducible+gene+expression+in+plants.">Transactivated and chemically inducible gene expression in plants.</a> The Plant Journal. 45 (4), 651-683 (2006).</li><li>Lampropoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GreenGate---a+novel,+versatile,+and+efficient+cloning+system+for+plant+transgenesis.">GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis.</a> PLoS One. 8 (12), e83043 (2013).</li><li>Baroux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictable+activation+of+tissue-specific+expression+from+a+single+gene+locus+using+the+pOp/LhG4+transactivation+system+in+Arabidopsis.">Predictable activation of tissue-specific expression from a single gene locus using the pOp/LhG4 transactivation system in Arabidopsis.</a> Plant Biotechnology Journal. 3 (1), 91-101 (2005).</li><li>Craft, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+pOp/LhG4+vectors+for+stringent+glucocorticoid-dependent+transgene+expression+in+Arabidopsis.">New pOp/LhG4 vectors for stringent glucocorticoid-dependent transgene expression in Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 41 (6), 899-918 (2005).</li><li>Moore, I., Galweiler, L., Grosskopf, D., Schell, J., Palme, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcription+activation+system+for+regulated+gene+expression+in+transgenic+plants.">A transcription activation system for regulated gene expression in transgenic plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (1), 376-381 (1998).</li><li>Samalova, M., Brzobohaty, B., Moore, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pOp6/LhGR:+a+stringently+regulated+and+highly+responsive+dexamethasone-inducible+gene+expression+system+for+tobacco.">pOp6/LhGR: a stringently regulated and highly responsive dexamethasone-inducible gene expression system for tobacco.</a> The Plant Journal. 41 (6), 919-935 (2005).</li><li>Picard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steroid-binding+domains+for+regulating+the+functions+of+heterologous+proteins+in+cis.">Steroid-binding domains for regulating the functions of heterologous proteins in cis.</a> Trends in Cell Biology. 3 (8), 278-280 (1993).</li><li>Schurholz, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comprehensive+Toolkit+for+Inducible,+Cell+Type-Specific+Gene+Expression+in+Arabidopsis.">A Comprehensive Toolkit for Inducible, Cell Type-Specific Gene Expression in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 178 (1), 40-53 (2018).</li><li>Kubo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+switches+for+protoxylem+and+metaxylem+vessel+formation.">Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation.</a> Genes and Development. 19 (16), 1855-1860 (2005).</li><li>Di Laurenzio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SCARECROW+gene+regulates+an+asymmetric+cell+division+that+is+essential+for+generating+the+radial+organization+of+the+Arabidopsis+root.">The SCARECROW gene regulates an asymmetric cell division that is essential for generating the radial organization of the Arabidopsis root.</a> Cell. 86 (3), 423-433 (1996).</li><li>Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+SCARECROW+function+reveals+a+radial+patterning+mechanism+common+to+root+and+shoot.">Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot.</a> Development. 127 (3), 595-603 (2000).</li><li>Hellens, R. P., Edwards, E. A., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pGreen:+a+versatile+and+flexible+binary+Ti+vector+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation.">pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Plant Molecular Biology. 42 (6), 819-832 (2000).</li><li>Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana+using+the+floral+dip+method.">Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method.</a> Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).</li><li>Kleinboelting, N., Huep, G., Kloetgen, A., Viehoever, P., Weisshaar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABI-Kat+SimpleSearch:+new+features+of+the+Arabidopsis+thaliana+T-DNA+mutant+database.">GABI-Kat SimpleSearch: new features of the Arabidopsis thaliana T-DNA mutant database.</a> Nucleic Acids Research. 40 (Database issue), D1211-D1215 (2012).</li><li>. Selection scheme used at GABI-Kat for resistance to sulfadiazine Available from: <a target="_blank" href="https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html">https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html</a> (2018)</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+addition+quantitative+real-time+PCR+(SAQPCR):+a+novel+approach+for+determination+of+transgene+copy+number+avoiding+PCR+efficiency+estimation.">Standard addition quantitative real-time PCR (SAQPCR): a novel approach for determination of transgene copy number avoiding PCR efficiency estimation.</a> PLoS One. 8 (1), e53489 (2013).</li><li>Wallner, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strigolactone-+and+Karrikin-Independent+SMXL+Proteins+Are+Central+Regulators+of+Phloem+Formation.">Strigolactone- and Karrikin-Independent SMXL Proteins Are Central Regulators of Phloem Formation.</a> Current Biology. 27 (8), 1241-1247 (2017).</li><li>Fletcher, J. C., Brand, U., Running, M. P., Simon, R., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+of+cell+fate+decisions+by+CLAVATA3+in+Arabidopsis+shoot+meristems.">Signaling of cell fate decisions by CLAVATA3 in Arabidopsis shoot meristems.</a> Science. 283 (5409), 1911-1914 (1999).</li><li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cellulose+synthases+in+Arabidopsis+secondary+cell+walls.">Visualization of cellulose synthases in Arabidopsis secondary cell walls.</a> Science. 350 (6257), 198-203 (2015).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VASCULAR-RELATED+NAC-DOMAIN6+and+VASCULAR-RELATED+NAC-DOMAIN7+effectively+induce+transdifferentiation+into+xylem+vessel+elements+under+control+of+an+induction+system.">VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN6 and VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN7 effectively induce transdifferentiation into xylem vessel elements under control of an induction system.</a> Plant Physiology. 153 (3), 906-914 (2010).</li><li>Engineer, C. B., Fitzsimmons, K. C., Schmuke, J. J., Dotson, S. B., Kranz, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+a+Gal4-mediated+LUC/GFP/GUS+enhancer+trap+system+in+Arabidopsis.">Development and evaluation of a Gal4-mediated LUC/GFP/GUS enhancer trap system in Arabidopsis.</a> BMC Plant Biology. 5, 9 (2005).</li><li>Aoyama, T., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glucocorticoid-mediated+transcriptional+induction+system+in+transgenic+plants.">A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants.</a> The Plant Journal. 11 (3), 605-612 (1997).</li><li>Decaestecker, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-TSKO+facilitates+efficient+cell+type-,+tissue-,+or+organ-specific+mutagenesis+in+Arabidopsis.">CRISPR-TSKO facilitates efficient cell type-, tissue-, or organ-specific mutagenesis in Arabidopsis.</a> bioRxiv. , (2018).</li></ol>

Ici, nous décrivons les étapes nécessaires pour générer et appliquer un outil polyvalent et complet pour inductible, cellule type spécifique trans-activation. Traversée de lignées porteuses de cassettes d’effecteur sous contrôle du promoteur pOp avec des lignes de pilote permet étudie les effets de l’expression erronée dans la génération F1, ce qui permet une évaluation rapide de perturbation génétique dans un large éventail de types de cellules. Alternativement, effecteur des const...

Une limitation majeure en biologie dans l’ère postgénomique est à déchiffrer le rôle spécifique du contexte d’un facteur donné ou perturbation génétique. Constitutives perturbations génétiques comme les approches de perte de fonction et de gain de fonction permettent souvent seulement point final une analyse des processus d’adaptation permanente, dissimuler la distinction entre les effets primaires et secondaires. En outre, des fonctions spécifiques de contexte peuvent être masquées ou diluées par des effets à grande échelle en tissus éloignés ou pendant d’autres phases de développement. En outre, dans les cas extrêmes, la létalité peut empêcher toute idée mécanistique. Idéalement, pour contourner ces problèmes, on pourrait analyser l’effet d’une perturbation génétique aiguë dans un contexte spécifique tel qu’un type de cellule spécifique d’une manière résolue dans le temps. Pour ce faire, des outils génétiques pour inductible, expression spécifique au type de cellule sont requis1. Pour fournir une ressource pour l’évaluation rapide de la dynamique spatio-temporelle d’une réponse à un effecteur donné, nous avons combiné la facilité du clonage fournies par le système de GreenGate2 avec l’efficacité prouvée du système GR-LhG43, 4,5,6. Nous avons généré un ensemble de lignes exprimant le facteur de transcription chimérique LhG4 fondu pour le domaine de liaison du ligand du récepteur (GR) corticoïdes rat7 sous le contrôle du type de cellule bien caractérisés promoteurs spécifiques8. En conditions de repos, le facteur de transcription reste en dehors du noyau, comme le domaine des ressources génétiques est lié par la HSP90 cytosolique. Avec l’ajout de ligands synthétiques dexaméthasone, translocation nucléaire est induite et LhG4 vont médier transcription des cassettes d’expression sous contrôle d’un promoteur analogues synthétiques de type pOp , comme un journaliste mTurquoise2 inclus dans les lignes correspondant au pilote de visualiser le domaine d’expression après l’induction.  Ainsi, les lignes correspondant au pilote techniquement aussi contenant une cassette d’effecteur. La traversée d’un ensemble de lignes correspondant au pilote avec une ligne transportant une cassette d’effecteur avec, par exemple, un gène d’intérêt sous le contrôle du même promoteur pOp-type donc permet une évaluation rapide des conséquences aiguës ou à long terme d’expression de l’effecteur dans un large éventail de types de cellules.
Ici, nous fournissons un protocole décrivant les procédures nécessaires pour générer les lignes pilote et effectrices et démontrer comment expression spécifiques du type cellulaire peut être induite et suivie dans le méristème apical, le méristème apical racinaire et le cambium de Arabidopsis. Pour illustrer la prouesse et la spécificité de cette approche, nous utilisons le facteur de transcription bien connu VND7 qui est capable de piloter des épaississements de mur de cellules du xylème secondaire façon ectopique9. Traitement de F1 d’un croisement entre la ligne de pilote pSCR10,11 et l’effecteur pOp6:VND7 conduit à la formation des cellules du xylème ectopiques dans la gaine de l’amidon de l' Arabidopsis , les cellules souches.
Pour faciliter la génération de grands assemblages d’ADN requis pour construire des plasmides d’expression conducteur et effectrices, nous avons utilisé le GreenGate rapide et efficace méthode2le clonage. GreenGate clonage est basé sur les enzymes de restriction type II S tels Eco31I ou ses isochizomère BsaI2. Ces enzymes couper en aval de leurs sites de reconnaissance asymétrique produisant des surplombs avec des variables de composition en bases. En intégrant l' éco31I /Bsaj’ai des sites de restriction en oligonucléotides et affectation des séquences spécifiques de porte-à-faux à des éléments d’ADN, clonage modulaire est atteint, facilitant la génération de grandes assemblées. Dans le cadre de GreenGate, modules d’ADN relèvent de catégories Qu'a à F repose sur la séquence de surplomb qui servent de cartes et sont montés dans cet ordre. Les amorces conçues pour amplifier votre produit désiré devraient donc selon le module sélectionné2 (Figure 1 a). Si il y a un interne Eco31I /Bsaje site et la séquence n’est pas compatible avec les modules d’entrée et de la destination de GreenGate, vous pouvez procéder sans la mutagenèse, mais avec une efficacité moindre. Également utiliser mutagenèse pour supprimer Eco31I /Bsaj’ai des sites de restriction prenant soin de ne pas pour changer d’acides aminés dans les produits des gènes.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>K029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Column purification</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit (250)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture chamber for imaging</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG</td>
			<td>1-well tissue culture chamber, on cover glass II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>D139-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eco31I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FD0294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>injection cannula (0.30 x 12 mm, 30 G x 1/2)</td>
			<td>Sterican, Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>T832.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO lambda blue 63x water immersion objectiv</td>
			<td>Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS medium</td>
			<td>Duchefa, Haarlem, Netherlands</td>
			<td>M0221.0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x&#160; 1.1 NA water immersion objective</td>
			<td>Nikon, Minato, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35/10 mm</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Germany</td>
			<td>627102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60/150 mm</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Germany</td>
			<td>628102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 120/120/17</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Germany</td>
			<td>688102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant agar</td>
			<td>Duchefa, Haarlem, Netherlands</td>
			<td>P1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid extraction</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide (PI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razorblade</td>
			<td>Classic, Wilkinson Sword GmbH</td>
			<td>7005115E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tubes</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silwet L-77</td>
			<td>Kurt Obermeier GmbH &#38; Co. KG, Bad Berleburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>3834.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NanoDrop 2000c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfadiazine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>2228.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Ligase 5 U/&#181;l</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Ligase 30 U/&#181;l</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EL0013</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducible, cell type-specific expression in arabidopsis thaliana through lhgr-mediated trans-activation

Expression inductible, tissu-spécifique est un outil important et puissant pour étudier la dynamique spatio-temporelle des perturbations génétiques. Combinant la GreenGate souple et efficace avec l’éprouvée et Benchmarké LhGR système (ici appelé GR-LhG4) pour l’expression inductible de clonage, nous avons généré un ensemble de lignées transgéniques de Arabidopsis qui permet de piloter l’expression d’un effecteur cassette dans un éventail de types de cellules spécifiques dans les méristèmes usine principale trois. À cette fin, nous avons choisi le système GR-LhG4 déjà élaborée, fondé sur un facteur de transcription chimérique et un promoteur apparenté de type pOp , assurer un contrôle serré sur un large éventail de niveaux d’expression. En outre, afin de visualiser le domaine d’expression où le facteur de transcription synthétique est actif, un journaliste fluorescent mTurquoise2 ER localisée sous le contrôle du promoteur pOp4 ou pOp6 est codé en lignes correspondant au pilote. Ici, nous décrivons les étapes nécessaires pour générer une ligne pilote ou effectrices et démontrer comment expression spécifiques du type cellulaire peut être induite et suivie dans le méristème apical, le méristème apical racinaire et le cambium d’Arabidopsis. En utilisant le pilote plusieurs ou toutes les lignes, l’effet de contexte spécifique d’exprimer un ou plusieurs facteurs (effecteurs) sous contrôle du promoteur synthétique pOp peut être évaluées rapidement, par exemple chez les plantes F1 d’un croisement entre un effecteur et multiple lignes de pilote. Cette approche est illustrée par l’expression ectopique de VND7, un facteur de transcription du CNA capable d’induire la déposition ectopique cellule secondaire de la paroi de manière autonome de la cellule.

Génération des lignes pilote et effectrices par clonage de GreenGate
Le GreenGate clonage système est issu de GoldenGate clonage et l’utilisation de l’endonucléase de restriction IIS de type BsaI ou son isochizomère Eco31I. Comme les surplombs de produit enzyme éloigné de son site de reconnaissance asymétrique, la composition en bases du porte-à-faux peuvent être librement choisie, qui est la base forme la modularité du système. Chaque éléme...

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Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inductible, Expression spécifique au Type cellulaire chez Arabidopsis thaliana médiation par le biais de LhGR Trans-Activation

Ici, nous décrivons la génération et l’application d’un ensemble de transgéniques Arabidopsis thaliana lignes habilitante expression inductible, tissu-spécifique dans les trois méristèmes principaux, le méristème apical, le méristème apical racinaire et le cambium.

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

L’objectif principal de la biologie du développement est de comprendre le rôle spécifique au contexte d’un gène. Et cela peut être difficile à réaliser par les mutants ko conventionnels ou par des lignes constitutives de surexpression. Nous avons utilisé le système modulaire de clonage de portes vertes pour générer une ressource pour l’expression cyto-spécifique inductible dans les trois ménismes principaux de la plante modèle Arabidopsis thaliana.En utilisant la même stratégie modulaire de clonage, cette méthode peut être appliquée à d’autres espèces végétales immuables à la transformation. La démonstration visuelle de cette procédure est valable parce que l’analyse de l’effet de la trans-activation dans les ménistes de la tige et de l’apex court exige la dissection avant la formation image, qui peut être tout à fait provocante. Pour commencer, stérilisez les graines telles qu’décrites dans le protocole textuel.Ensuite, préparez murashige et skoog mi-résistance à pH 5,8 et ajoutez un pour cent de saccharose et 0,9% d’agar. Après autoclaving, ajouter Dex dissous dans DMSO aux plaques d’induction à une concentration finale entre 10 et 30 micromolaires. Ajouter une quantité égale de DMSO aux plaques de commande.Mettez les graines pour l’imagerie des racines dans des assiettes et stratifiez-les pendant 48 heures dans l’obscurité et à quatre degrés Celsius. Mettez les plaques en position verticale dans un incubateur de plantes et cultivez-les pendant cinq jours. Cinq jours après la germination, utilisez la microscopie confocale à balayage laser pour imager les semis.Pour commencer, préparer et cultiver les graines telles que décrites dans le protocole texte. Six à sept jours après la germination, transférer chaque semis au sol dans une casserole séparée. Si vous induisez les plantes par arrosage, utilisez une solution DEX de 25 micromolaires dans l’eau, préparée à partir d’un stock de DEX de 25 millimolaires dissous dans de l’éthanol.Arrosez tous les deux à trois jours jusqu’au moment désiré de l’induction. Si vous induisez en trempant, préparez un bécher d’un litre avec 750 millilitres d’eau contenant 0,02%Silwet L77 et DEX à 25 micromolaires de concentration finale ou une quantité équivalente de DMSO pour le DEX et le traitement simulé. Trempez une seule plante dans la solution d’induction ou de maquette pendant 30 secondes.Répétez tous les deux à trois jours, jusqu’au moment désiré de l’imagerie. Pour commencer, préparer et cultiver les graines telles que décrites dans le protocole texte. Six à sept jours après la germination, transférer chaque semis au sol dans une casserole séparée.Lorsque la tige fait environ un centimètre de long, vaporisez le SAM influorescent avec entre 10 et 50 micromolaires de solution DEX dans l’eau. Pour l’induction et l’imagerie à des stades ultérieurs de développement, induire des MS de tiges plus longues ou des pousses latérales. 24 à 48 heures après l’induction, disséquer les SAM et passer à l’imagerie.Tout d’abord, transférer les semis de la plaque à une solution de 10 microgrammes par millileter de propidium iodure et les contre-détenir pendant cinq minutes. Placez les racines dans une chambre d’imagerie au microscope et imagez-les à l’aide d’un microscope à balayage laser confocal avec un objectif d’immersion d’eau 63x. Pour visualiser la fluorescence de l’iodure propidium, utilisez une longueur d’onde d’excitation de 488 nanomètres et recueillez les émissions entre 590 et 660 nanomètres.Pour la fluorescence mTurquoise2, utilisez 458 nanomètres d’excitation et collectez les émissions entre 460 et 615 nanomètres à l’aide d’un balayage séquentiel. Tout d’abord, fixer une tige avec un doigt sur le côté opposé de la section désirée. À l’aide d’une lame de rasoir, couper un segment d’environ trois centimètres et effectuer plusieurs coupes fines.Rincer la lame de rasoir dans une boîte de Pétri contenant de l’eau du robinet et recueillir les sections de tige. Soit tacher les sections ou les monter directement sur des diapositives de microscope. Pour la coloration, préparer un millilitre d’une solution millilitre de 250 microgrammes par millilitre d’iodure de propidium dans un tube de réaction.Retirer l’eau du robinet de la boîte de Pétri à l’aide d’une pipette et la remplacer par la solution d’iodure de propidium et la tache pendant cinq minutes. Ensuite, retirez la solution d’iodure de propidium et rincez à l’eau. À l’aide de forceps fins ou d’un pinceau fin, transférez les sections tachées aux toboggans au microscope.Utilisez un microscope à balayage laser confocal avec une lentille d’immersion d’eau plongeante 25x pour l’image des échantillons. Utilisez une lumière laser de 561 nanomètres pour exciter la fluorescence de l’iodure de propidium et recueillir des émissions de 570 à 620 nanomètres. Utilisez une lumière laser de 405 nanomètres pour exciter l’effecteur fluorophore mTurquoise2 codé par la ligne pilote construit et recueillir des émissions de 425 à 475 nanomètres.Tout d’abord, utilisez des forceps pour couper la tige deux centimètres au-dessous de la pointe de la pousse. Tenez la tige dans une main et utilisez des forceps fins pour enlever les boutons floraux et les grandes primordies. Pour enlever la jeune primordie, fixez le SAM en position verticale dans une boîte de Pétri contenant trois pour cent d’agarose.Ensuite, utilisez une jumelle et des forceps pour enlever toute jeune primordie à proximité du SAM. Transférer le SAM disséqué dans un tube contenant une solution de 250 microgrammes par millilitre d’iodure de propidium. Laissez l’échantillon tacher pendant cinq à dix minutes tout en vous assurant que l’échantillon reste complètement immergé pendant la procédure de coloration.Placez le SAM taché dans une petite boîte de Pétri contenant trois pour cent de milieu d’agarose. Couvrir le SAM d’eau distillée double. Utilisez un microscope à balayage laser confocal équipé d’une lentille d’immersion d’eau plongeante 25x pour imager les SAM disséqués.Utilisez une lumière laser de 561 nanomètres pour exciter la fluorescence de l’iodure de propidium et recueillir des émissions de 570 à 620 nanomètres. Utilisez une lumière laser de 405 nanomètres pour exciter le fluorophore mTurquoise2 et recueillir des émissions de 425 à 475 nanomètres. Enregistrez des piles d’images couvrant 50 micromètres dans la direction Z avec une taille d’étape de 0,5 micromètre.L’induction avec DEX conduit à l’expression spécifique de type cellulaire mTurquoise2 dans l’endodème de racine les précurseurs de phloème et le cambium, et les cellules souches dans le meristem apical de pousse. Comme cas d’essai pour la transactivation, une ligne effectrice codant le facteur de transcription principal de la paroi cellulaire secondaire VND7 fusionnée au domaine d’activation V16, est générée. Après cinq jours de traitement unique avec 15 microlitres de DEX ou DMSO, les sections de tige sont préparées pour la visualisation de la lignification ectopique dans la gaine de début.Les cellules de gaine de démarrage dans les échantillons induits montrent un signal fort pour le canal iodure de propidium et certaines cellules montrent l’épaississement réticule typique de la paroi cellulaire dans les cellules xylèmes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une compréhension claire de la façon d’induire l’expression des gènes dans différents tissus et comment préparer vos échantillons pour l’imagerie. Suivant cette procédure, les lignes de conducteur établies peuvent être utilisées avec une grande variété de constructions effectrices générées par d’autres utilisateurs en fonction de leurs intérêts de recherche.Ce raccourci devrait aider les chercheurs en plantes à évaluer rapidement l’effet de l’expression spécifique de type cellulaire ou du renversement d’un gène d’intérêt d’une manière réservée dans le temps. Ce système d’induction spécifique de type cellulaire nécessite l’utilisation de la dexaméthasone corticostéroïde. Le contact direct doit être évité, il est donc important de porter des gants et un masque pendant le traitement.

Research

JoVE Journal

Genetics

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

The Terroir Concept Interpreted through Grape Berry Metabolomics and Transcriptomics

Le concept Terroir Interprété par Grape Berry métabolomique et transcriptomique

Terroir refers to the combination of environmental factors that affect the characteristics of crops such as grapevine (Vitis vinifera) according to ...

Recherche

Génétique

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Mesure parallèle d&#39;expression Circadian Clock génique et la sécrétion d&#39;hormones dans des cultures de cellules humaines primaires

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

Unicellulaire Gene Expression utilisant Multiplex RT-qPCR à Caractériser Hétérogénéité des rares populations lymphoïdes

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

L&#39;élevage et d&#39;ARN double brin médiée Gene Knockdown dans le Hide Beetle,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Système d&#39;expression multigène médié par l&#39;ARN T7 à ADN polymère induible, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Unicellulaire profil d&#39;expression génique utilisant FACS et qPCR avec les normes internes

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Contrôlable Expression Ion canal par transfection transitoire inductible

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

Étude de l&#39;expression génétique régulée par un cycle cellulaire par deux protocoles complémentaires de synchronisation cellulaire

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Systèmes inductibles et constitutives génétique In Vivo modification des hépatocytes de souris à l’aide d’Injection dans la veine queue hydrodynamique

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Une méthode Optogenetic pour contrôler et analyser les profils d’Expression génique dans les Interactions cellule-cellule

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...