Name: inducible, cell type-specific expression in arabidopsis thaliana through lhgr-mediated trans-activation
Uploaded: 2019-04-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation at JoVE.com

Arbeit in unseren Laboren wird unterstützt durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Zuschüsse WO 1660/6-1 (bis S.W) und GR 2104/4-1 (TG) und SFB1101 (zur T.G. und J.U.L) und durch einen Europäischen Forschungsrat Consolidator gewähren (PLANTSTEMS 647148), T.G.  S.W wird durch das Emmy-Noether-Stipendium der DFG durch Grant WO 1660/2 unterstützt.

Vektoren und Module erhalten Sie aus dem Non-Profit-Repository, Addgene (https://www.addgene.org).
1. Klonen mit GreenGate
<ol><li>Design-Primer mit den in Tabelle 1aufgeführten Überhängen, unten aufgeführten Modul typenspezifische Adapter Sequenzen "NNNN" ersetzen: nach vorne: 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) CA* + bestimmten Reihenfolge 3´, rückgängig zu machen: 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) mit RFS Ergänzung des spezifischen Sequenz 3´. Fügen Sie die unte...

<ol>
	<li>Moore, I., Samalova, M., Kurup, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivated+and+chemically+inducible+gene+expression+in+plants.">Transactivated and chemically inducible gene expression in plants.</a> The Plant Journal. 45 (4), 651-683 (2006).</li><li>Lampropoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GreenGate---a+novel,+versatile,+and+efficient+cloning+system+for+plant+transgenesis.">GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis.</a> PLoS One. 8 (12), e83043 (2013).</li><li>Baroux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictable+activation+of+tissue-specific+expression+from+a+single+gene+locus+using+the+pOp/LhG4+transactivation+system+in+Arabidopsis.">Predictable activation of tissue-specific expression from a single gene locus using the pOp/LhG4 transactivation system in Arabidopsis.</a> Plant Biotechnology Journal. 3 (1), 91-101 (2005).</li><li>Craft, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+pOp/LhG4+vectors+for+stringent+glucocorticoid-dependent+transgene+expression+in+Arabidopsis.">New pOp/LhG4 vectors for stringent glucocorticoid-dependent transgene expression in Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 41 (6), 899-918 (2005).</li><li>Moore, I., Galweiler, L., Grosskopf, D., Schell, J., Palme, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcription+activation+system+for+regulated+gene+expression+in+transgenic+plants.">A transcription activation system for regulated gene expression in transgenic plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (1), 376-381 (1998).</li><li>Samalova, M., Brzobohaty, B., Moore, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pOp6/LhGR:+a+stringently+regulated+and+highly+responsive+dexamethasone-inducible+gene+expression+system+for+tobacco.">pOp6/LhGR: a stringently regulated and highly responsive dexamethasone-inducible gene expression system for tobacco.</a> The Plant Journal. 41 (6), 919-935 (2005).</li><li>Picard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steroid-binding+domains+for+regulating+the+functions+of+heterologous+proteins+in+cis.">Steroid-binding domains for regulating the functions of heterologous proteins in cis.</a> Trends in Cell Biology. 3 (8), 278-280 (1993).</li><li>Schurholz, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comprehensive+Toolkit+for+Inducible,+Cell+Type-Specific+Gene+Expression+in+Arabidopsis.">A Comprehensive Toolkit for Inducible, Cell Type-Specific Gene Expression in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 178 (1), 40-53 (2018).</li><li>Kubo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+switches+for+protoxylem+and+metaxylem+vessel+formation.">Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation.</a> Genes and Development. 19 (16), 1855-1860 (2005).</li><li>Di Laurenzio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SCARECROW+gene+regulates+an+asymmetric+cell+division+that+is+essential+for+generating+the+radial+organization+of+the+Arabidopsis+root.">The SCARECROW gene regulates an asymmetric cell division that is essential for generating the radial organization of the Arabidopsis root.</a> Cell. 86 (3), 423-433 (1996).</li><li>Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+SCARECROW+function+reveals+a+radial+patterning+mechanism+common+to+root+and+shoot.">Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot.</a> Development. 127 (3), 595-603 (2000).</li><li>Hellens, R. P., Edwards, E. A., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pGreen:+a+versatile+and+flexible+binary+Ti+vector+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation.">pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Plant Molecular Biology. 42 (6), 819-832 (2000).</li><li>Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana+using+the+floral+dip+method.">Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method.</a> Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).</li><li>Kleinboelting, N., Huep, G., Kloetgen, A., Viehoever, P., Weisshaar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABI-Kat+SimpleSearch:+new+features+of+the+Arabidopsis+thaliana+T-DNA+mutant+database.">GABI-Kat SimpleSearch: new features of the Arabidopsis thaliana T-DNA mutant database.</a> Nucleic Acids Research. 40 (Database issue), D1211-D1215 (2012).</li><li>. Selection scheme used at GABI-Kat for resistance to sulfadiazine Available from: <a target="_blank" href="https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html">https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html</a> (2018)</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+addition+quantitative+real-time+PCR+(SAQPCR):+a+novel+approach+for+determination+of+transgene+copy+number+avoiding+PCR+efficiency+estimation.">Standard addition quantitative real-time PCR (SAQPCR): a novel approach for determination of transgene copy number avoiding PCR efficiency estimation.</a> PLoS One. 8 (1), e53489 (2013).</li><li>Wallner, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strigolactone-+and+Karrikin-Independent+SMXL+Proteins+Are+Central+Regulators+of+Phloem+Formation.">Strigolactone- and Karrikin-Independent SMXL Proteins Are Central Regulators of Phloem Formation.</a> Current Biology. 27 (8), 1241-1247 (2017).</li><li>Fletcher, J. C., Brand, U., Running, M. P., Simon, R., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+of+cell+fate+decisions+by+CLAVATA3+in+Arabidopsis+shoot+meristems.">Signaling of cell fate decisions by CLAVATA3 in Arabidopsis shoot meristems.</a> Science. 283 (5409), 1911-1914 (1999).</li><li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cellulose+synthases+in+Arabidopsis+secondary+cell+walls.">Visualization of cellulose synthases in Arabidopsis secondary cell walls.</a> Science. 350 (6257), 198-203 (2015).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VASCULAR-RELATED+NAC-DOMAIN6+and+VASCULAR-RELATED+NAC-DOMAIN7+effectively+induce+transdifferentiation+into+xylem+vessel+elements+under+control+of+an+induction+system.">VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN6 and VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN7 effectively induce transdifferentiation into xylem vessel elements under control of an induction system.</a> Plant Physiology. 153 (3), 906-914 (2010).</li><li>Engineer, C. B., Fitzsimmons, K. C., Schmuke, J. J., Dotson, S. B., Kranz, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+a+Gal4-mediated+LUC/GFP/GUS+enhancer+trap+system+in+Arabidopsis.">Development and evaluation of a Gal4-mediated LUC/GFP/GUS enhancer trap system in Arabidopsis.</a> BMC Plant Biology. 5, 9 (2005).</li><li>Aoyama, T., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glucocorticoid-mediated+transcriptional+induction+system+in+transgenic+plants.">A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants.</a> The Plant Journal. 11 (3), 605-612 (1997).</li><li>Decaestecker, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-TSKO+facilitates+efficient+cell+type-,+tissue-,+or+organ-specific+mutagenesis+in+Arabidopsis.">CRISPR-TSKO facilitates efficient cell type-, tissue-, or organ-specific mutagenesis in Arabidopsis.</a> bioRxiv. , (2018).</li></ol>

Hier beschreiben wir die erforderlichen Schritte zum erzeugen und wenden Sie eine vielseitige und umfassende Toolkit für induzierbaren, Zelle Art spezifische Trans-Aktivierung. Kreuzenden Linien tragen Effektor Kassetten unter Kontrolle des pOp- Promotors mit Fahrer Linien erlaubt der falsche Ausdruck-Effekte in der F1-Generation ermöglicht die schnelle Beurteilung der genetischen Störung in einer Vielzahl von Zelltypen zu studieren. Alternativ Effektor-Konstrukte können verwendet werden, um Fahrer ...

Eine große Einschränkung in der Biologie in die genomische Zeitalter ist, die spezifische Rolle der Kontext eines bestimmten Faktor oder genetische Störung zu entschlüsseln. Konstitutive genetische Störungen wie z. B. Verlust der Funktion und Gain-of-Function Ansätze erlauben oft nur Endpunktanalyse der lebenslangen Anpassungsprozesse, die Unterscheidung zwischen primären und sekundären Effekten zu verschleiern. Darüber hinaus können Kontext spezifische Funktionen maskiert oder verdünnt durch groß angelegte Effekte in entfernte Gewebe oder in anderen Phasen der Entwicklung. Darüber hinaus kann im Extremfall Letalität mechanistische Einsicht entgegen. Ideal, um diese Probleme zu umgehen, könnte man die Wirkung von akuten genetische Störung in einem bestimmten Kontext wie z. B. einem bestimmten Zelltyp in gewissem Sinne zeitaufgelösten analysieren. Um dies zu erreichen, sind genetische Werkzeuge für induzierbaren, Zelle Typ-spezifischen Ausdruck erforderlich1. Um eine Ressource für die schnelle Bewertung der räumlich-zeitliche Dynamik einer Reaktion auf einen bestimmten Effektor zu bieten, haben wir kombiniert die Leichtigkeit des Klonens zur Verfügung gestellt von GreenGate System2 mit nachgewiesener Wirksamkeit der GR-LhG4 System3, 4,5,6. Wir haben eine Reihe von Zeilen, die mit dem Ausdruck der Chimären Transkriptionsfaktor, die LhG4 an den Liganden-bindende Domäne der Ratte Kortikoid-Rezeptor (GR)7 unter der Kontrolle der gut-gekennzeichneten Zelle Typ spezifischen Promotoren8fusioniert erzeugt. Im ruhenden Bedingungen, bleibt der Transkriptionsfaktor außerhalb der Kern der cytosolischen HSP90 die GR-Domäne gebunden ist. Mit dem Zusatz von synthetischen Liganden Dexamethason (Dex) nukleare Translokation wird induziert und LhG4 vermitteln Transkription Expressionskassetten unter Kontrolle eines Promotors cognate synthetische pOp-Typ , z. B. ein mTurquoise2-reporter enthalten in den Treiber-Linien, die Ausdruck-Domäne nach Induktion zu visualisieren.  Die Treiber-Zeilen enthalten somit technisch auch eine Effektor-Kassette. Die Kreuzung aus einer Reihe von Treiber-Linien mit einer Linie, die somit eine Effektor-Kassette mit, beispielsweise ein Gen des Interesses unter Kontrolle des gleichen pOp-Art -Promotors tragen ermöglicht die schnelle Beurteilung der die akuten oder langfristige Folgen der Effektor Ausdruck in einer Vielzahl von Zelltypen.
Hier bieten wir ein Protokoll beschreibt die Verfahren notwendig, um die Treiber und Effektor Linien zu erzeugen und zeigen, wie Zelle Art Konkretisierung kann induziert und folgte im schießen Sprossapikalmeristem Meristem, die Wurzel Sprossapikalmeristem Meristem und das Kambium der Arabidopsis. Um die Fähigkeiten und die Spezifität dieses Ansatzes zu veranschaulichen, nutzen wir die bekannten Transkriptionsfaktor VND7 die Xylem-wie sekundäre Zelle Wand Verdickungen ectopically fahren kann9. Behandlung von F1 aus einer Kreuzung zwischen der pSCR10,11 -Treiber und die pOp6:VND7 Effektor Linie führt zur Bildung von ektopische Xylem-wie Zellen in der Stärke-Hülle, die Stammzellen von Arabidopsis .
Um die Generation der großen DNA-Baugruppen erforderlich für den Bau von Fahrer und Effektor Ausdruck Plasmide zu erleichtern, haben wir die schnelle und effiziente GreenGate Klonen Methode2verwendet. GreenGate Klonen ist basierend auf Typ II S Restriktionsenzyme Eco31I oder seine Isoschizomer BsaI2. Diese Enzyme schneiden ihre asymmetrischen Anerkennung Aufstellungsorte produzieren Überhänge mit unterschiedlicher Basenzusammensetzung nachgeschaltet. Durch den Einbau von Eco31I /Bsaich Beschränkung in Oligonukleotide und Zuteilung von bestimmten Überhang Sequenzen auf DNA-Elemente, modulare Klonen erzielt wird, erleichtert die Erzeugung großer Baugruppen. Im Rahmen GreenGate fallen DNA-Module in Kategorien A-F basiert auf Überhang-Sequenz, die als Adapter dienen und sind in dieser Reihenfolge montiert. Die Primer konzipiert, um Ihr gewünschtes Produkt verstärken sollte daher gemäß dem gewählten Modul2 (Abbildung 1A). Wenn es eine interne Eco31I gibt /BsaI Seite und die Reihenfolge ist nicht kompatibel mit den GreenGate-Eintrag und Ziel-Modulen, können Sie fortfahren, ohne mutagenizing, aber mit geringerer Effizienz. Alternativ können Sie Site-verwiesene Mutagenese Eco31I entfernen /Bsaich Restriktionsschnittstellen kümmert sich nicht um Aminosäuren in Genprodukte zu ändern.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>K029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Column purification</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit (250)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture chamber for imaging</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG</td>
			<td>1-well tissue culture chamber, on cover glass II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>D139-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eco31I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FD0294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>injection cannula (0.30 x 12 mm, 30 G x 1/2)</td>
			<td>Sterican, Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>T832.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO lambda blue 63x water immersion objectiv</td>
			<td>Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS medium</td>
			<td>Duchefa, Haarlem, Netherlands</td>
			<td>M0221.0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x&#160; 1.1 NA water immersion objective</td>
			<td>Nikon, Minato, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35/10 mm</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Germany</td>
			<td>627102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60/150 mm</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Germany</td>
			<td>628102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 120/120/17</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Germany</td>
			<td>688102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant agar</td>
			<td>Duchefa, Haarlem, Netherlands</td>
			<td>P1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid extraction</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide (PI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razorblade</td>
			<td>Classic, Wilkinson Sword GmbH</td>
			<td>7005115E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tubes</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silwet L-77</td>
			<td>Kurt Obermeier GmbH &#38; Co. KG, Bad Berleburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>3834.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NanoDrop 2000c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfadiazine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>2228.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Ligase 5 U/&#181;l</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Ligase 30 U/&#181;l</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EL0013</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducible, cell type-specific expression in arabidopsis thaliana through lhgr-mediated trans-activation

Induzierbaren, gewebespezifische Ausdruck ist ein wichtiges und mächtiges Werkzeug, die räumlich-zeitliche Dynamik der genetischen Störung zu studieren. Kombinieren die flexible und effiziente GreenGate System mit dem bewährten und Benchmarking LhGR System (hier als GR-LhG4) für den induzierbaren Ausdruck Klonen, haben wir eine Reihe von transgenen Arabidopsis Linien erzeugt, die die Expression von einem Effektor fahren können Kassette in einer Reihe von spezifischen Zelltypen in drei Stammwerk Meristeme. Zu diesem Zweck wählten wir das zuvor entwickelte GR-LhG4 System basierend auf eine Chimäre Transkriptionsfaktor und cognate pOp Art Förderer gewährleistet strenge Kontrolle über eine Vielzahl von Ausdruck Niveaus. Darüber hinaus wird die Ausdruck Domäne visualisieren denen synthetische Transkriptionsfaktors tätig ist, ein ER lokalisiert mTurquoise2 fluoreszierenden Reporter unter Kontrolle des Veranstalters pOp4 oder pOp6 Fahrer Linien kodiert. Hier beschreiben wir die erforderlichen Schritte zum Erzeugen einer Treiber oder Effektor Linie und zeigen, wie Zelle Art Konkretisierung kann induziert und schießen Sprossapikalmeristem Meristem, die Wurzel Sprossapikalmeristem Meristem und das Kambium von Arabidopsisfolgten. Mithilfe mehrerer oder aller Fahrer Linien, die Kontext spezifische Wirkung des Ausdrückens einer oder mehrere Faktoren (Effektoren) unter Kontrolle des synthetischen pOp Promotors beurteilt werden können schnell, zum Beispiel in F1 Pflanzen eine Kreuzung zwischen einem Effektor und multiple Fahrer-Linien. Dieser Ansatz ist durch die ektopische Expression von VND7, eine NAC Transkriptionsfaktor, der in der Lage, induzieren ektopische sekundäre Zelle Wand Ablagerung Zelle autonom veranschaulicht.

Generation von Fahrer und Effektor Linien durch Klonen von GreenGate
Die GreenGate Klonen System basiert auf GoldenGate Klonen und Verwendung der Typ IIS Einschränkung Endonuklease Bsaich oder seine Isoschizomer Eco31I. Wie das Enzym produziert Überhänge entfernten vom Standort asymmetrischen Anerkennung der Basenzusammensetzung der Überhänge frei sein können bilden ausgewählt, die die Grundlage die Modularität des Systems. Jeder PCR erzeugte Element,...

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Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Induzierbaren, Zelle Typ-spezifischen Ausdruck in Arabidopsis Thaliana durch LhGR-vermittelten Trans-Aktivierung

Hier beschreiben wir die Erzeugung und Anwendung einer Reihe von transgenen Arabidopsis Thaliana Linien förderliches induzierbaren, gewebespezifische Ausdruck in den drei wichtigsten Meristeme, schießen Sprossapikalmeristem Meristem, die Wurzel Sprossapikalmeristem Meristem und das Kambium.

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

Das Hauptziel der Entwicklungsbiologie ist es, die kontextspezifische Rolle eines Gens zu verstehen. Und dies kann durch konventionelle Knockout-Mutanten oder durch konstitutive Überausdruckslinien schwierig zu erreichen sein. Wir verwendeten das modulare Green Gate Klonsystem, um eine Ressource für induzierbare zytospezifische Expression in den drei Hauptmeristemen der Modellpflanze Arabidopsis thaliana zu erzeugen.Mit der gleichen modularen Klonstrategie kann diese Methode auf andere Pflanzenarten angewendet werden, die für die Transformation unveränderlich sind. Die visuelle Demonstration dieses Verfahrens ist wertvoll, da die Analyse der Wirkung der Transaktivierung in den Meristems des Stammes und der kurzen Spitze eine Zerlegung vor der Bildgebung erfordert, was ziemlich schwierig sein kann. Um zu beginnen, sterilisieren Sie die Samen, wie im Textprotokoll beschrieben.Als nächstes bereiten Sie halbfeste Murashige und Skoog Medium bei pH 5,8 und fügen Sie ein Prozent Saccharose und 0,9% Agar. Nach dem Autoklavieren Dex in DMSO gelöst in einer Endkonzentration zwischen 10 und 30 Mikromolaren zu den Induktionsplatten hinzufügen. Fügen Sie den Steuerplatten eine gleiche Menge DMSO hinzu.Legen Sie die Samen für die Wurzelbildgebung auf Teller und schichten Sie sie für 48 Stunden in der Dunkelheit und bei vier Grad Celsius. Die Platten in eine vertikale Position in einen Pflanzenbrutschrank geben und fünf Tage lang anbauen. Fünf Tage nach der Keimung verwenden Sie die konfokale Laserscanmikroskopie, um die Sämlinge abzubilden.Zu Beginn bereiten und wachsen Sie die Samen, wie im Textprotokoll beschrieben. Sechs bis sieben Tage nach der Keimung jeden Sämling in einem separaten Topf auf den Boden geben. Wenn Sie die Pflanzen durch Gießen induzieren, verwenden Sie eine 25 Mikromolar DEX Lösung in Wasser, hergestellt aus einem Bestand von 25 Millimolar DEX in Ethanol gelöst.Wasser alle zwei bis drei Tage bis zur gewünschten Induktionszeit. Bei induzieren durch Tauchen, bereiten Sie einen Ein-Liter-Becher mit 750 Milliliter Wasser, das 0,02%Silwet L77 und DEX bei 25 Mikromolar Endkonzentration oder eine entsprechende Menge dmSO für die DEX und Mock-Behandlung enthält. Tauchen Sie eine einzelne Pflanze für 30 Sekunden in die Induktions- oder Scheinlösung ein.Wiederholen Sie dies alle zwei bis drei Tage bis zur gewünschten Bildgebungszeit. Zu Beginn bereiten und wachsen Sie die Samen, wie im Textprotokoll beschrieben. Sechs bis sieben Tage nach der Keimung jeden Sämling in einem separaten Topf auf den Boden geben.Wenn der Vorbau etwa einen Zentimeter lang ist, sprühen Sie das fluoreszierende SAM mit einer 10 bis 50 Mikromolaren-DEX-Lösung in Wasser. Für Induktion und Bildgebung in späteren Entwicklungsstadien, sAMs von längeren Stämmen oder Seitentriebe induzieren. 24 bis 48 Stunden nach der Induktion, sezieren Sie die SAMs und gehen Sie mit der Bildgebung.Zuerst die Sämlinge von der Platte auf eine 10 Mikrogramm pro Millileter-Lösung von Propidiumjodid übertragen und fünf Minuten gegenstainen. Legen Sie die Wurzeln in eine Mikroskop-Bildkammer und stellen Sie sie mit einem konfokalen Laserscanmikroskop mit einem 63-fachen Wassertauchobjektiv ab. Um die Propidiumjodidfluoreszenz zu visualisieren, verwenden Sie eine Anregungswellenlänge von 488 Nanometern und sammeln Emissionen zwischen 590 und 660 Nanometern.Verwenden Sie für mTurquoise2-Fluoreszenz 458 Nanometer Anregung und sammeln Sie Emissionen zwischen 460 und 615 Nanometern mithilfe sequenzieller Scans. Fixieren Sie zunächst einen Stiel mit einem Finger auf der gegenüberliegenden Seite des gewünschten Abschnitts. Schneiden Sie mit einer Rasierklinge ein Segment von etwa drei Zentimetern und führen Sie mehrere feine Schnitte durch.Spülen Sie die Rasierklinge in einer Petrischale mit Leitungswasser und sammeln Sie die Stielabschnitte. Beflecken Sie die Abschnitte oder montieren Sie sie direkt auf Mikroskopschlitten. Für die Färbung einen Milliliter einer 250-Mikrogramm-Lösung pro Milliliter Propidiumjodid in einem Reaktionsröhre vorbereiten.Entfernen Sie das Leitungswasser aus der Petrischale mit einer Pipette und ersetzen Sie es durch die Propidiumjodidlösung und färben Sie sie fünf Minuten lang. Entfernen Sie dann die Propidiumjodidlösung und spülen Sie sie mit Wasser ab. Übertragen Sie die gebeizten Abschnitte entweder mit feinen Zangen oder einem feinen Pinsel auf Mikroskopschlitten.Verwenden Sie ein konfokales Laserscanmikroskop mit einer 25-fachen Tauchwasser-Tauchlinse, um die Proben abzubilden. Verwenden Sie ein 561 Nanometer Laserlicht, um Propidiumiodidfluoreszenz zu anregen und Emissionen von 570 bis 620 Nanometern zu sammeln. Verwenden Sie ein 405-Nanometer-Laserlicht, um den von den Treiberlinienkonstrukten kodierten mTurquoise2-Fluorophoreffektor zu erregen und Emissionen von 425 bis 475 Nanometern zu sammeln.Verwenden Sie zunächst Zangen, um den Stiel zwei Zentimeter unter der Triebspitze zu schneiden. Halten Sie den Stiel in einer Hand und verwenden Sie feine Zange, um die Blütenknospen und große Primordien zu entfernen. Um junge Primordien zu entfernen, fixieren Sie das SAM in einer aufrechten Position in einer Petrischale, die drei Prozent Agarose enthält.Als nächstes verwenden Sie ein Binokular und Zange, um alle jungen Primordien in der Nähe des SAM zu entfernen. Übertragen Sie das sezierte SAM in ein Rohr, das eine 250-Mikrogramm-Pro-Milliliter-Lösung propidiumiodid enthält. Lassen Sie die Probe fünf bis zehn Minuten färben, während Sie sicherstellen, dass die Probe während des Färbevorgangs vollständig unterGetaucht bleibt.Legen Sie das gebeizte SAM in eine kleine Petrischale mit drei Prozent Agarosemedium. Bedecken Sie das SAM mit doppelt destilliertem Wasser. Verwenden Sie ein konfokales Laserscanmikroskop, das mit einer 25-fachen Tauchwasser-Tauchlinse ausgestattet ist, um die sezierten SAMs abzubilden.Verwenden Sie ein 561 Nanometer Laserlicht, um Propidiumiodidfluoreszenz zu anregen und Emissionen von 570 bis 620 Nanometern zu sammeln. Verwenden Sie ein 405-Nanometer-Laserlicht, um das mTurquoise2-Fluorophor zu anregen und Emissionen von 425 bis 475 Nanometern zu sammeln. Zeichnen Sie Bildstapel mit einer Länge von 50 Mikrometern in Z-Richtung mit einer Schrittgröße von 0,5 Mikrometern auf.Die Induktion mit DEX führt zu einer zellspezifischen mTurquoise2-Expression im Wurzelendodermis der Phloem-Vorläufer und des Cambiums und der Stammzellen im triebapischen Meristem. Als Testfall für die Transaktivierung wird eine Effektorlinie generiert, die den sekundären Zellwandmaster-Transkriptionsfaktor VND7 kodiert, der mit der V16-Aktivierungsdomäne verschmolzen ist. Nach fünf Tagen Einzelbehandlung mit entweder 15 Mikroliter DEX oder DMSO werden Stammabschnitte für die Visualisierung der ektopischen Lignifikation in der Starthülle vorbereitet.Die Startscheidezellen in induzierten Proben zeigen ein starkes Signal für den Propidiumjodidkanal und einige Zellen zeigen die typische Retikulatverdickung der Zellwand in Xylemzellen. Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein klares Verständnis davon haben, wie Sie die Genexpression in verschiedenen Geweben induzieren und wie Sie Ihre Proben auf die Bildgebung vorbereiten können. Nach diesem Verfahren können die etablierten Treiberlinien mit einer Vielzahl von Effektorkonstrukten verwendet werden, die von anderen Benutzern entsprechend ihren Forschungsinteressen erzeugt werden.Diese Abkürzung sollte Pflanzenforschern helfen, die Wirkung einer zelltypspezifischen Expression oder des Knockdowns eines Gens von Interesse schnell zeitreserviert zu bewerten. Dieses zelltypspezifische Induktionssystem erfordert die Verwendung des Kortikosteroids Dexamethason. Direkter Kontakt sollte vermieden werden, daher ist es wichtig, während der Behandlung Handschuhe und eine Gesichtsmaske zu tragen.

Research

JoVE Journal

Genetics

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

The Terroir Concept Interpreted through Grape Berry Metabolomics and Transcriptomics

Das Terroir-Konzept Interpretiert durch Grape Berry Metabolomics und Transcriptomics

Terroir refers to the combination of environmental factors that affect the characteristics of crops such as grapevine (Vitis vinifera) according to ...

Forschung

Genetik

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Parallel Messung von Circadian Clock Genexpression und Hormon-Sekretion in primären humanen Zellkulturen

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

Einzellige Gene Expression Mit Multiplex-RT-qPCR zum Charakterisieren Heterogene Rare Lymphatische Populations

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Zucht- und RNA-vermittelte Gene Knockdown in der ausblenden Doppelstrang-Käfer,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Induzierbares T7-RNA-Polymerase-vermitteltes Multigen-Expressionssystem, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Einzellige Genexpressionsprofile mittels FACS und qPCR mit internen Standards

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Steuerbare Ionenkanal-Expression durch induzierbare Transiente Transfektion

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

Das Studium der Zellzyklus-regulierten Genexpression durch zwei komplementäre Zellsynchronisationsprotokolle

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Konstitutive und induzierbaren Systeme für genetische In Vivo Änderung der Maus Hepatozyten mit hydrodynamischen Tail Vene Injektion

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Eine optogenetische Methode zu kontrollieren und analysieren gen Expressionsmuster in Zell-Zell-Interaktionen

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...