Name: inducible, cell type-specific expression in arabidopsis thaliana through lhgr-mediated trans-activation
Uploaded: 2019-04-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation at JoVE.com

עבודה במעבדות שלנו נתמך על ידי קרן מחקר גרמני (DFG) מענקים WO 1660/6-1 (לונדון), GR 2104/4-1 (ל. ת. ג), SFB1101 (לת. ג ו- J.U.L), על ידי המועצה האירופית מחקר הממזגת נכסי הענק (PLANTSTEMS 647148) לת. ג  ייגמר בתיקו נתמכת באמצעות אמי נתר אחוות DFG דרך גרנט WO 1660/2.

ניתן להשיג וקטורים ומודולים מהמאגר ללא כוונת רווח, Addgene (https://www.addgene.org).
1. שכפול באמצעות GreenGate
<ol><li>עיצוב תחל באמצעות המסוכך על המפורטים בטבלה1 החלפת 'NNNN' עם מודול ספציפי סוג מתאם רצפי המפורטים להלן: קדימה: 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) CA* + 3´ רצף מסוים, הפוך: 5´AACA-GGTCTC-A-NNNN (n) + ה...

<ol>
	<li>Moore, I., Samalova, M., Kurup, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivated+and+chemically+inducible+gene+expression+in+plants.">Transactivated and chemically inducible gene expression in plants.</a> The Plant Journal. 45 (4), 651-683 (2006).</li><li>Lampropoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GreenGate---a+novel,+versatile,+and+efficient+cloning+system+for+plant+transgenesis.">GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis.</a> PLoS One. 8 (12), e83043 (2013).</li><li>Baroux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictable+activation+of+tissue-specific+expression+from+a+single+gene+locus+using+the+pOp/LhG4+transactivation+system+in+Arabidopsis.">Predictable activation of tissue-specific expression from a single gene locus using the pOp/LhG4 transactivation system in Arabidopsis.</a> Plant Biotechnology Journal. 3 (1), 91-101 (2005).</li><li>Craft, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+pOp/LhG4+vectors+for+stringent+glucocorticoid-dependent+transgene+expression+in+Arabidopsis.">New pOp/LhG4 vectors for stringent glucocorticoid-dependent transgene expression in Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 41 (6), 899-918 (2005).</li><li>Moore, I., Galweiler, L., Grosskopf, D., Schell, J., Palme, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcription+activation+system+for+regulated+gene+expression+in+transgenic+plants.">A transcription activation system for regulated gene expression in transgenic plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (1), 376-381 (1998).</li><li>Samalova, M., Brzobohaty, B., Moore, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pOp6/LhGR:+a+stringently+regulated+and+highly+responsive+dexamethasone-inducible+gene+expression+system+for+tobacco.">pOp6/LhGR: a stringently regulated and highly responsive dexamethasone-inducible gene expression system for tobacco.</a> The Plant Journal. 41 (6), 919-935 (2005).</li><li>Picard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steroid-binding+domains+for+regulating+the+functions+of+heterologous+proteins+in+cis.">Steroid-binding domains for regulating the functions of heterologous proteins in cis.</a> Trends in Cell Biology. 3 (8), 278-280 (1993).</li><li>Schurholz, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comprehensive+Toolkit+for+Inducible,+Cell+Type-Specific+Gene+Expression+in+Arabidopsis.">A Comprehensive Toolkit for Inducible, Cell Type-Specific Gene Expression in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 178 (1), 40-53 (2018).</li><li>Kubo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+switches+for+protoxylem+and+metaxylem+vessel+formation.">Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation.</a> Genes and Development. 19 (16), 1855-1860 (2005).</li><li>Di Laurenzio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SCARECROW+gene+regulates+an+asymmetric+cell+division+that+is+essential+for+generating+the+radial+organization+of+the+Arabidopsis+root.">The SCARECROW gene regulates an asymmetric cell division that is essential for generating the radial organization of the Arabidopsis root.</a> Cell. 86 (3), 423-433 (1996).</li><li>Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+SCARECROW+function+reveals+a+radial+patterning+mechanism+common+to+root+and+shoot.">Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot.</a> Development. 127 (3), 595-603 (2000).</li><li>Hellens, R. P., Edwards, E. A., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pGreen:+a+versatile+and+flexible+binary+Ti+vector+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation.">pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Plant Molecular Biology. 42 (6), 819-832 (2000).</li><li>Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana+using+the+floral+dip+method.">Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method.</a> Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).</li><li>Kleinboelting, N., Huep, G., Kloetgen, A., Viehoever, P., Weisshaar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABI-Kat+SimpleSearch:+new+features+of+the+Arabidopsis+thaliana+T-DNA+mutant+database.">GABI-Kat SimpleSearch: new features of the Arabidopsis thaliana T-DNA mutant database.</a> Nucleic Acids Research. 40 (Database issue), D1211-D1215 (2012).</li><li>. Selection scheme used at GABI-Kat for resistance to sulfadiazine Available from: <a target="_blank" href="https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html">https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html</a> (2018)</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+addition+quantitative+real-time+PCR+(SAQPCR):+a+novel+approach+for+determination+of+transgene+copy+number+avoiding+PCR+efficiency+estimation.">Standard addition quantitative real-time PCR (SAQPCR): a novel approach for determination of transgene copy number avoiding PCR efficiency estimation.</a> PLoS One. 8 (1), e53489 (2013).</li><li>Wallner, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strigolactone-+and+Karrikin-Independent+SMXL+Proteins+Are+Central+Regulators+of+Phloem+Formation.">Strigolactone- and Karrikin-Independent SMXL Proteins Are Central Regulators of Phloem Formation.</a> Current Biology. 27 (8), 1241-1247 (2017).</li><li>Fletcher, J. C., Brand, U., Running, M. P., Simon, R., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+of+cell+fate+decisions+by+CLAVATA3+in+Arabidopsis+shoot+meristems.">Signaling of cell fate decisions by CLAVATA3 in Arabidopsis shoot meristems.</a> Science. 283 (5409), 1911-1914 (1999).</li><li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cellulose+synthases+in+Arabidopsis+secondary+cell+walls.">Visualization of cellulose synthases in Arabidopsis secondary cell walls.</a> Science. 350 (6257), 198-203 (2015).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VASCULAR-RELATED+NAC-DOMAIN6+and+VASCULAR-RELATED+NAC-DOMAIN7+effectively+induce+transdifferentiation+into+xylem+vessel+elements+under+control+of+an+induction+system.">VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN6 and VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN7 effectively induce transdifferentiation into xylem vessel elements under control of an induction system.</a> Plant Physiology. 153 (3), 906-914 (2010).</li><li>Engineer, C. B., Fitzsimmons, K. C., Schmuke, J. J., Dotson, S. B., Kranz, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+a+Gal4-mediated+LUC/GFP/GUS+enhancer+trap+system+in+Arabidopsis.">Development and evaluation of a Gal4-mediated LUC/GFP/GUS enhancer trap system in Arabidopsis.</a> BMC Plant Biology. 5, 9 (2005).</li><li>Aoyama, T., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glucocorticoid-mediated+transcriptional+induction+system+in+transgenic+plants.">A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants.</a> The Plant Journal. 11 (3), 605-612 (1997).</li><li>Decaestecker, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-TSKO+facilitates+efficient+cell+type-,+tissue-,+or+organ-specific+mutagenesis+in+Arabidopsis.">CRISPR-TSKO facilitates efficient cell type-, tissue-, or organ-specific mutagenesis in Arabidopsis.</a> bioRxiv. , (2018).</li></ol>

כאן, אנו מתארים את השלבים הנחוצים ליצור ולהחיל ערכת כלים מגוונים ומקיפים inducible, תא סוג ספציפי הטרנס-הפעלה. חציית קווים נושאת אפקטור קלטות תחת שליטה של האמרגן פופ עם הנהג קווים מאפשר ללמוד את ההשפעות ביטוי שגויה בדור F1, המאפשר להערכת ההפרעות גנטיות במגוון רחב של סוגי תאים מהירה. לח?...

מגבלה משמעותית בביולוגיה בעידן postgenomic הוא לפענח את התפקיד בהקשר ספציפי של גורם מסוים או ההפרעות גנטיות. מכוננת לפליטת גנטיות כגון אובדן-של-פונקציה ופונקציה רווח-של גישות אפשר לעתים קרובות רק מובילים ניתוח של תהליכי הסתגלות חיים ארוך, טשטוש ההבחנה בין אפקטים ראשיים ומשניים. בנוסף, פונקציות ספציפיות בהקשר יכול להיות רעולי פנים או מדולל על ידי תופעות בקנה מידה גדול ברקמות מרוחק או במהלך בשלבים אחרים של פיתוח. יתר על כן, במקרים קיצוניים, lethality יכול למנוע כל תובנה מכניסטית. באופן אידיאלי, כדי לעקוף בעיות אלה, אחד יכול לנתח את השפעת ההפרעות גנטיות חריפה בתוך הקשר מסוים כגון סוג תא מסוים באופן זמן לפתור. כדי להשיג זאת, כלים גנטיים לביטוי ייחודיים לסוג התא inducible, הם נדרשים1. כדי לספק משאב להערכה מהירה של תגובה אפקטור נתון הדינמיקות ייתכן, שילבנו להקל על שיבוט שמספק את מערכת GreenGate2 עם יעילות מוכחת של מערכת GR-LhG43, 45,,6. יש לנו שנוצר קווים לבטא את הפקטור שעתוק chimeric ש-lhg4 התמזגו איגוד ליגנד לתחום של עכברוש corticoid קולטן (גר)7 תחת השליטה של התא מאופיין היטב סוג ספציפי היזמים8. ב נח תנאים, הגורם שעתוק נשאר מחוץ לגרעין, כמו התחום GR נמדד על ידי HSP90 cytosolic. עם התוספת של דקסאמתאזון ליגנד סינתטי (דקס), רוברטסונית גרעיני מושרה ולסיים LhG4 תמלול קלטות ביטוי תחת שליטה של מקדם cognate סינתטי מסוג pOp , כגון כתב mTurquoise2 כולל הקווים הנהג כדי להמחיש את התחום ביטוי לאחר אינדוקציה.  לפיכך, הקווים הנהג טכנית מכילים גם של קלטת אפקטור. המעבר של הנהג קווים עם שורת נושא של קסטה אפקטור עם, למשל, גן עניין תחת שליטה של האמרגן מסוג pOp אותו ובכך מאפשר את ההערכה המהירה ההשלכות חריפה או לטווח ארוך של הביטוי אפקטור במגוון רחב של סוגי תאים.
כאן, אנו מספקים פרוטוקול המתאר את ההליכים הדרושים כדי ליצור את השורות הנהג ואפקטור ומדגימים איך ביטוי ספציפי של סוג התא יכול להיות המושרה ועקבתי meristem apical את הצילומים, meristem apical את השורש, את cambium של תודרנית. כדי להמחיש את המיומנות וספציפיות של גישה זו, אנו מנצלים את הגורם תמלול ידועה VND7 המסוגל נהיגה thickenings קיר דמוי עצה משנית תא ectopically9. בטיפול F1 מן הכלאה בין את pSCR10,11 הנהג ובין pOp6:VND7 אפקטור הקו שמוביל היווצרות של תאים כמו עצה חוץ רחמי נדן עמילן בתאים של תודרנית גזע.
כדי להקל על הדור של מכלולים דנ א גדולים הנדרשים לבניית פלסמידים ביטוי אפקטור ונהג, השתמשנו GreenGate מהירה ויעילה שיבוט שיטה2. שיבוט של GreenGate בהתבסס על סוג II S אנזימי הגבלה כגון לסביבה31I או isoschizomer שלו, Bsaאני2. אנזימים אלה לחתוך במורד הזרם של אתרי זיהוי אסימטרי שלהם בהפקת המסוכך עם משתנה הרכב הבסיס. על ידי שילוב לסביבה31I /Bsaאני הגבלת אתרי oligonucleotides, הקצאת רצפי הסככה ספציפי לרכיבי ה-DNA, שיבוט מודולרי מושגת, להקל על הדור של מכלולים גדולים. במסגרת GreenGate, מודולי ה-DNA נחלקים קטגוריות ש-a-F המבוססת על רצף הסככה לשמש מתאמי, הם התאספו לפי הסדר הזה. לכן, צבעי יסוד שנועד להגביר את המוצר הרצוי צריך להיות בהתאם המודול שנבחר2 (איור 1 א'). אם יש פנימיים לסביבה31I /Bsaאני באתר ואת הרצף אינה תואמת מודולי כניסה והיעד של GreenGate, תמשיך ללא mutagenizing, אבל עם יעילות נמוכה יותר. לחלופין, השתמש מוטגנזה להסרת לסביבה31I /Bsaאני אתרי הגבלת מטפל לא לשינוי חומצות אמינו במוצרים ג'ין.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>K029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Column purification</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit (250)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture chamber for imaging</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG</td>
			<td>1-well tissue culture chamber, on cover glass II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>D139-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eco31I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FD0294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>injection cannula (0.30 x 12 mm, 30 G x 1/2)</td>
			<td>Sterican, Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>T832.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO lambda blue 63x water immersion objectiv</td>
			<td>Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS medium</td>
			<td>Duchefa, Haarlem, Netherlands</td>
			<td>M0221.0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x&#160; 1.1 NA water immersion objective</td>
			<td>Nikon, Minato, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35/10 mm</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Germany</td>
			<td>627102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60/150 mm</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Germany</td>
			<td>628102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 120/120/17</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Germany</td>
			<td>688102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant agar</td>
			<td>Duchefa, Haarlem, Netherlands</td>
			<td>P1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid extraction</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide (PI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razorblade</td>
			<td>Classic, Wilkinson Sword GmbH</td>
			<td>7005115E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tubes</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silwet L-77</td>
			<td>Kurt Obermeier GmbH &#38; Co. KG, Bad Berleburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>3834.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NanoDrop 2000c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfadiazine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>2228.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Ligase 5 U/&#181;l</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Ligase 30 U/&#181;l</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EL0013</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducible, cell type-specific expression in arabidopsis thaliana through lhgr-mediated trans-activation

הביטוי inducible, רקמות ספציפיות הוא כלי חשוב ורב עוצמה כדי ללמוד את הדינמיקה-עתיים של ההפרעות גנטיות. שילוב של GreenGate גמיש ויעיל שכפול מערכת במערכת מוכחות, benchmarked LhGR (הנקרא כאן GR-LhG4) עבור הביטוי inducible, יש לנו שנוצר הטרנסגניים קווים תודרנית שיכולים להביא את הביטוי אפקטור קלטות במגוון של סוגי תאים מסוים ב- meristems שלוש המפעל הראשי. למטרה זו, בחרנו את המערכת GR-LhG4 בעבר מפותח בהתבסס על פקטור שעתוק chimeric מקדם cognate פופ-סוג להבטיח שליטה הדוקה על מגוון רחב של רמות הביטוי. בנוסף, כדי להמחיש את התחום ביטוי איפה הפעיל הפקטור שעתוק סינתטי, כתב פלורסנט מותאמת לשפות אחרות ER mTurquoise2 תחת שליטה של האמרגן pOp4 או pOp6 מקודד בקווים הנהג. כאן, אנו מתארים את השלבים הנחוצים ליצור קו הנהג או אפקטור ומדגימים איך ביטוי ספציפי של סוג התא יכול להיות המושרה ועקבתי meristem apical את הצילומים, meristem apical את השורש, את cambium של תודרנית. באמצעות מספר או כל מנהל קווים, ההשפעה הספציפית בהקשר לביטוי אחד או גורמים רבים (effectors) תחת שליטה של האמרגן סינתטי פופ יכול להיות מוערך במהירות, לדוגמה בצמחים F1 של הכלאה בין אפקטור אחד מרובה מנהל ההתקן של קווים. גישה זו היא דוגמה לביטוי חוץ רחמי של VND7, גורם שעתוק NAC מסוגל גרימת התצהיר קיר חוץ רחמי משני תאים באופן אוטונומיים תא.

הדור של הנהג וקווים אפקטור באמצעות שיבוט GreenGate
GreenGate שכפול מערכת מבוססת על GoldenGate שיבוט ושימוש endonuclease ההגבלה IIS מסוג Bsaאני או isoschizomer שלו לסביבה31I. האנזים מייצר המסוכך על רחוק מאתר אסימטרי זיהוי שלו, הרכב המסוכך בסיס יכול להיות חופשי, שהיא הבסיס הנבחר טופס המ?...

Watch this Scientific Journal Video about Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation at JoVE.com

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, תאים ייחודיים לסוג ביטוי תודרנית לבנה בתיווך דרך LhGR טרנס-הפעלה

כאן, אנו מתארים את הדור, יישום של קבוצת הטרנסגניים תודרנית לבנה קווי המאפשרת ביטוי inducible, רקמות ספציפיות את meristems הראשי שלוש, את meristem apical לירות, meristem apical את שורש ו את cambium.

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

המטרה העיקרית בביולוגיה התפתחותית היא להבין את התפקיד הספציפי להקשר של גן. וזה יכול להיות קשה להשיג על ידי מוטנטים נוקאאוט קונבנציונליים או על ידי קווי דיכוי יתר מכוננים. השתמשנו במערכת שיבוט השערים הירוקים המודולרית כדי ליצור משאב לביטוי ספציפי לציטו בלתי ניתן לעיכול בשלושת המריסתמים העיקריים של מפעל המודל Arabidopsis thaliana.באמצעות אותה אסטרטגיית שיבוט מודולרית, ניתן ליישם שיטה זו על מיני צמחים אחרים שלא ניתן לשנותם. הדגמה חזותית של הליך זה היא בעלת ערך משום שניתוח ההשפעה של הפעלה טרנס-הפעלה ב meristems של הגבעול ואת apex קצר דורש ניתוח לפני הדמיה, אשר יכול להיות מאתגר למדי. כדי להתחיל, לעקר את הזרעים כמפורט בפרוטוקול הטקסט.לאחר מכן, הכינו את מוראשיג' וסקוק בינוניים בחצי העוצמה ב-pH 5.8 והוסיפו אחוז סוכרוז אחד ו-0.9% אגר. לאחר autoclaving, להוסיף Dex מומס DMSO לצלחות אינדוקציה בריכוז הסופי בין 10 ל 30 מיקרומולר. הוסף כמות שווה של DMSO לוחות הבקרה.שים את הזרעים עבור הדמיה שורש על צלחות לשכבות אותם במשך 48 שעות בחושך בארבע מעלות צלזיוס. שים את הצלחות במצב אנכי באינקובטור צמחים ולגדל אותם במשך חמישה ימים. חמישה ימים לאחר הנביטה, השתמש במיקרוסקופיה של סריקת לייזר קונפוקלי כדי לדמיין את השתילים.כדי להתחיל, להכין ולגדל את הזרעים כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. שישה עד שבעה ימים לאחר הנביטה, מעבירים כל שתיל לאדמה בסיר נפרד. אם גרימת הצמחים על ידי השקיה, להשתמש בתמיסת DEX 25 micromolar במים, מוכן מתוך מלאי של 25 מילימולר DEX מומס באתנול.מים כל יומיים עד שלושה ימים עד לזמן הרצוי של אינדוקציה. אם גרימת על ידי טבילה, להכין מקור של ליטר אחד עם 750 מיליליטר של מים המכילים 0.02%Silwet L77 ו DEX ב 25 מיקרומולרית ריכוז סופי או כמות שוות ערך של DMSO עבור DEX וטיפול מדומה. טובלים צמח אחד לתוך אינדוקציה או פתרון מדומה במשך 30 שניות.יש לחזור על הפעולה כל יומיים-שלושה, עד לזמן הרצוי של ההדמיה. כדי להתחיל, להכין ולגדל את הזרעים כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. שישה עד שבעה ימים לאחר הנביטה, מעבירים כל שתיל לאדמה בסיר נפרד.כאשר הגבעול הוא סביב סנטימטר אחד ארוך, לרסס את SAM שפעת עם בין 10 ל 50 פתרון DEX micromolar במים. עבור אינדוקציה והדמיה בשלבים מאוחרים יותר של הפיתוח, לגרום SAMs של גבעולים ארוכים יותר או יורה בצד. 24 עד 48 שעות לאחר הגיוס, לנתח את SAMs ולהמשיך הדמיה.ראשית, להעביר את השתילים מהצלחת לתו 10 מיקרוגרם למיליליטר של פרופידיום יודיד ונגד אותם במשך חמש דקות. מניחים את השורשים בתא הדמיה מיקרוסקופ ולדמיין אותם באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקל עם מטרה טבילה במים 63x. כדי לדמיין פרופידיום יודיד פלואורסצנטיות, להשתמש באורך גל של 488 ננומטר ולאסוף פליטה בין 590 ל 660 ננומטר.עבור פלואורסצנטיות mTurquoise2, יש להשתמש ב-458 ננומטר ולאיסוף פליטה בין 460 ל-615 ננומטר באמצעות סריקה רציפה. ראשית, לתקן גבעול עם אצבע בצד הנגדי של החלק הרצוי. בעזרת סכין גילוח, חותכים מקטע של כשלושה סנטימטרים ומבצעים מספר חתכים עדינים.שוטפים את סכין הגילוח בצלחת פטרי המכילה מי ברז ואוסף את חלקי הגזע. או להכתים את החלקים או ישירות לטעון אותם על שקופיות מיקרוסקופ. עבור כתמים, להכין מיליליטר אחד של 250 מיקרוגרם לכל פתרון מיליליטר של פרופידיום יודיד בצינור תגובה.מוציאים את מי הברז מצלחת פטרי עם פיפטה ומחליפים אותה בתסכת הפרופידיום יודיד וכתם במשך חמש דקות. לאחר מכן, להסיר את פתרון יודיד פרופיד ולשטוף עם מים. באמצעות מדפים עדין או מברשת צבע עדין, להעביר את החלקים מוכתמים שקופיות מיקרוסקופ.השתמש במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקל עם עדשת טבילת מים טבילה 25x כדי לדמיין את הדגימות. השתמש באור לייזר 561 ננומטר כדי לרגש פרופידיום יודיד פלואורסצנטי ולאסוף פליטה מ 570 כדי 620 ננומטר. השתמש באור לייזר 405 ננומטר כדי לרגש את אפקט הפלואורופור mTurquoise2 המקודד על ידי מבני קו הנהג ולאסוף פליטה מ 425 עד 475 ננומטר.ראשית, השתמש במדפים כדי לחתוך את הגבעול שני סנטימטרים מתחת לקצה לירות. החזק את הגבעול ביד אחת ולהשתמש מטלפים עדין כדי להסיר את ניצני הפרחים פרימורדיה גדולה. כדי להסיר פרימומדיה צעירה, לתקן את SAM במצב זקוף בצלחת פטרי המכיל שלושה אחוזים agarose.לאחר מכן, השתמש במשקפת ומדפים כדי להסיר כל פרימורדיה צעירה קרוב SAM. העבר את SAM נותחה לצינור המכיל 250 מיקרוגרם לכל פתרון מיליליטר של פרופידיום יודיד. תן לכתם המדגם במשך חמש עד 10 דקות תוך הקפדה על הדגימה נשארת שקועה לחלוטין במהלך הליך הכתם.מניחים את SAM מוכתם לתוך צלחת פטרי קטנה המכילה שלושה אחוזים אגרוז בינוני. כסו את ה-SAM במים מזוקקים כפולים. השתמש במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי המצויד בעדשת טבילת מים טבילה 25x כדי לדמיין את ה- SAMs שנותקו.השתמש באור לייזר 561 ננומטר כדי לרגש פרופידיום יודיד פלואורסצנטי ולאסוף פליטות מ 570 כדי 620 ננומטר. השתמש באור לייזר 405 ננומטר כדי לרגש את הפלואורופור mTurquoise2 ולאסוף פליטה מ 425 עד 475 ננומטר. רשום ערימות תמונה המשתרעות על פני 50 מיקרומטר בכיוון Z בגודל צעד של 0.5 מיקרומטר.אינדוקציה עם DEX מובילה לביטוי mTurquoise2 ספציפי לסוג התא בביטוי השורש אנדודרמיס מבשרי פלואם וקמביום, ותאי הגזע ב- meristem apical לירות. כמקרה בדיקה עבור טרנסאקטיביות, נוצר קו אפקט המקודד את גורם התמלול הראשי של קיר התא המשני VND7 לתחום ההפעלה V16. לאחר חמישה ימים של טיפול יחיד עם 15 microliters של DEX או DMSO, קטעי גזע מוכנים להדמיה של lignification חוץ רחמי במסלקת ההתחלה.תאי הנדן הקדומים בדגימות המושרות מראים אות חזק לערוץ ה-propidium iodide, ותאים מסוימים מראים את עיבוי המרסן הטיפוסי של קיר התא בתאי קסים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה ברורה של איך לגרום ביטוי גנים ברקמות שונות וכיצד להכין את הדגימות שלך להדמיה. בעקבות הליך זה, קווי הנהג הוקמה ניתן להשתמש עם מגוון רחב של מבנים משפיעים שנוצרו על ידי משתמשים אחרים על פי האינטרסים המחקר שלהם.קיצור דרך זה אמור לעזור לחוקרי הצמח להעריך במהירות את ההשפעה של ביטוי ספציפי לסוג התא או הפלה של גן מעניין בזמן שמורות. מערכת אינדוקציה ספציפית זו של סוג התא דורשת שימוש ב- dexamethasone קורטיקוסטרואידים. יש להימנע ממגע ישיר, ולכן חשוב ללבוש כפפות ומסכת פנים במהלך הטיפול.

Research

JoVE Journal

Genetics

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

The Terroir Concept Interpreted through Grape Berry Metabolomics and Transcriptomics

קונספט טרואר לפרש דרך הענבים הברים Metabolomics ו transcriptomics

Terroir refers to the combination of environmental factors that affect the characteristics of crops such as grapevine (Vitis vinifera) according to ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

מדידה במקביל של ביטוי גנים השעון הביולוגי ואת הפרשת הורמון בתרביות תאים ראשוניים אדם

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

ביטוי גנים תא בודד באמצעות Multiplex RT-qPCR לאפיון הטרוגניות של אוכלוסיות הלימפה נדירים

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

התרומם על רגליו אחורי פעמים תקועות מציאת גן בתיווך רנ&quot;א סתר החיפושית,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

T7 RNA פולימראז בתיווך Multigene הביטוי מערכת, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

תאים יחידים Gene Expression Profiling שימוש FACS ו qPCR עם סטנדרטים פנימיים

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

ביטוי ערוץ יון לשליטה באמצעות Transfection ועין מתנהל חלוף

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

לימוד מחזור גנים ביטוי מוסדר על ידי שני פרוטוקולי סינכרון התא

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

מערכות מכוננת Inducible עבור שינוי גנטי In Vivo של העכבר Hepatocytes באמצעות הזרקת וריד הזנב Hydrodynamic

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

שיטת Optogenetic לשלוט ולנתח ג'ין תבניות ביטוי באינטראקציות לתא

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...