Name: inducible, cell type-specific expression in arabidopsis thaliana through lhgr-mediated trans-activation
Uploaded: 2019-04-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation at JoVE.com

हमारी प्रयोगशालाओं में कार्य जर्मन अनुसंधान प्रतिष्ठान (डीएफजी) द्वारा समर्थित है अनुदान दो 1660/6-1 (को दप) और जीआर 2104/4-1 (को टीजी) और SFB1101 (टीजी और जे यू एल) और एक यूरोपीय अनुसंधान परिषद consolidator अनुदान (PLANTSTEMS ६४७१४८) द्वारा टीजी  दप ग्रांट WO 1660/2 के माध्यम से DFG की एमी Noether फैलोशिप के माध्यम से समर्थित है ।

वैक्टर और मॉड्यूल गैर लाभ भंडार, Addgene (https://www.addgene.org) से प्राप्त किया जा सकता है ।
1. क्लोनिंग का उपयोग कर GreenGate
<ol><li>डिजाइन प्राइमरों तालिका 1में सूचीबद्ध overhangs का उपयोग कर, मॉड्यूल प्रकार के साथ ' nnnn ' ?...

<ol>
	<li>Moore, I., Samalova, M., Kurup, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivated+and+chemically+inducible+gene+expression+in+plants.">Transactivated and chemically inducible gene expression in plants.</a> The Plant Journal. 45 (4), 651-683 (2006).</li><li>Lampropoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GreenGate---a+novel,+versatile,+and+efficient+cloning+system+for+plant+transgenesis.">GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis.</a> PLoS One. 8 (12), e83043 (2013).</li><li>Baroux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictable+activation+of+tissue-specific+expression+from+a+single+gene+locus+using+the+pOp/LhG4+transactivation+system+in+Arabidopsis.">Predictable activation of tissue-specific expression from a single gene locus using the pOp/LhG4 transactivation system in Arabidopsis.</a> Plant Biotechnology Journal. 3 (1), 91-101 (2005).</li><li>Craft, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+pOp/LhG4+vectors+for+stringent+glucocorticoid-dependent+transgene+expression+in+Arabidopsis.">New pOp/LhG4 vectors for stringent glucocorticoid-dependent transgene expression in Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 41 (6), 899-918 (2005).</li><li>Moore, I., Galweiler, L., Grosskopf, D., Schell, J., Palme, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcription+activation+system+for+regulated+gene+expression+in+transgenic+plants.">A transcription activation system for regulated gene expression in transgenic plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (1), 376-381 (1998).</li><li>Samalova, M., Brzobohaty, B., Moore, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pOp6/LhGR:+a+stringently+regulated+and+highly+responsive+dexamethasone-inducible+gene+expression+system+for+tobacco.">pOp6/LhGR: a stringently regulated and highly responsive dexamethasone-inducible gene expression system for tobacco.</a> The Plant Journal. 41 (6), 919-935 (2005).</li><li>Picard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steroid-binding+domains+for+regulating+the+functions+of+heterologous+proteins+in+cis.">Steroid-binding domains for regulating the functions of heterologous proteins in cis.</a> Trends in Cell Biology. 3 (8), 278-280 (1993).</li><li>Schurholz, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comprehensive+Toolkit+for+Inducible,+Cell+Type-Specific+Gene+Expression+in+Arabidopsis.">A Comprehensive Toolkit for Inducible, Cell Type-Specific Gene Expression in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 178 (1), 40-53 (2018).</li><li>Kubo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+switches+for+protoxylem+and+metaxylem+vessel+formation.">Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation.</a> Genes and Development. 19 (16), 1855-1860 (2005).</li><li>Di Laurenzio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SCARECROW+gene+regulates+an+asymmetric+cell+division+that+is+essential+for+generating+the+radial+organization+of+the+Arabidopsis+root.">The SCARECROW gene regulates an asymmetric cell division that is essential for generating the radial organization of the Arabidopsis root.</a> Cell. 86 (3), 423-433 (1996).</li><li>Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+SCARECROW+function+reveals+a+radial+patterning+mechanism+common+to+root+and+shoot.">Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot.</a> Development. 127 (3), 595-603 (2000).</li><li>Hellens, R. P., Edwards, E. A., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pGreen:+a+versatile+and+flexible+binary+Ti+vector+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation.">pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Plant Molecular Biology. 42 (6), 819-832 (2000).</li><li>Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana+using+the+floral+dip+method.">Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method.</a> Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).</li><li>Kleinboelting, N., Huep, G., Kloetgen, A., Viehoever, P., Weisshaar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABI-Kat+SimpleSearch:+new+features+of+the+Arabidopsis+thaliana+T-DNA+mutant+database.">GABI-Kat SimpleSearch: new features of the Arabidopsis thaliana T-DNA mutant database.</a> Nucleic Acids Research. 40 (Database issue), D1211-D1215 (2012).</li><li>. Selection scheme used at GABI-Kat for resistance to sulfadiazine Available from: <a target="_blank" href="https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html">https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html</a> (2018)</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+addition+quantitative+real-time+PCR+(SAQPCR):+a+novel+approach+for+determination+of+transgene+copy+number+avoiding+PCR+efficiency+estimation.">Standard addition quantitative real-time PCR (SAQPCR): a novel approach for determination of transgene copy number avoiding PCR efficiency estimation.</a> PLoS One. 8 (1), e53489 (2013).</li><li>Wallner, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strigolactone-+and+Karrikin-Independent+SMXL+Proteins+Are+Central+Regulators+of+Phloem+Formation.">Strigolactone- and Karrikin-Independent SMXL Proteins Are Central Regulators of Phloem Formation.</a> Current Biology. 27 (8), 1241-1247 (2017).</li><li>Fletcher, J. C., Brand, U., Running, M. P., Simon, R., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+of+cell+fate+decisions+by+CLAVATA3+in+Arabidopsis+shoot+meristems.">Signaling of cell fate decisions by CLAVATA3 in Arabidopsis shoot meristems.</a> Science. 283 (5409), 1911-1914 (1999).</li><li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cellulose+synthases+in+Arabidopsis+secondary+cell+walls.">Visualization of cellulose synthases in Arabidopsis secondary cell walls.</a> Science. 350 (6257), 198-203 (2015).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VASCULAR-RELATED+NAC-DOMAIN6+and+VASCULAR-RELATED+NAC-DOMAIN7+effectively+induce+transdifferentiation+into+xylem+vessel+elements+under+control+of+an+induction+system.">VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN6 and VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN7 effectively induce transdifferentiation into xylem vessel elements under control of an induction system.</a> Plant Physiology. 153 (3), 906-914 (2010).</li><li>Engineer, C. B., Fitzsimmons, K. C., Schmuke, J. J., Dotson, S. B., Kranz, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+a+Gal4-mediated+LUC/GFP/GUS+enhancer+trap+system+in+Arabidopsis.">Development and evaluation of a Gal4-mediated LUC/GFP/GUS enhancer trap system in Arabidopsis.</a> BMC Plant Biology. 5, 9 (2005).</li><li>Aoyama, T., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glucocorticoid-mediated+transcriptional+induction+system+in+transgenic+plants.">A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants.</a> The Plant Journal. 11 (3), 605-612 (1997).</li><li>Decaestecker, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-TSKO+facilitates+efficient+cell+type-,+tissue-,+or+organ-specific+mutagenesis+in+Arabidopsis.">CRISPR-TSKO facilitates efficient cell type-, tissue-, or organ-specific mutagenesis in Arabidopsis.</a> bioRxiv. , (2018).</li></ol>

यहां, हम उत्पंन करने के लिए आवश्यक कदम का वर्णन और inducible, सेल प्रकार विशिष्ट ट्रांससक्रियण के लिए एक बहुमुखी और व्यापक toolkit लागू होते हैं । चालक लाइनों के साथ पॉप प्रमोटर के नियंत्रण में effector कैसेट ले ?...

Postgenomic युग में जीव विज्ञान में एक प्रमुख सीमा एक दिया कारक या आनुवंशिक क्षोभ की संदर्भ विशिष्ट भूमिका को समझने के लिए है । इस तरह के नुकसान के रूप में संचक आनुवंशिक perturbations समारोह और लाभ के समारोह के दृष्टिकोण अक्सर केवल अनुमति जीवन के अंत बिंदु विश्लेषण-लंबी अनुकूलन प्रक्रियाओं, प्राथमिक और द्वितीयक प्रभाव के बीच भेद obfuscating । इसके अलावा, संदर्भ विशिष्ट कार्यों नकाबपोश या दूर ऊतकों में बड़े पैमाने पर प्रभाव या विकास के अन्य चरणों के दौरान पतला किया जा सकता है. इसके अलावा, चरम मामलों में, घातकता किसी भी यंत्रवादी अंतर्दृष्टि को बाधित कर सकता है । आदर्श रूप में, इन मुद्दों को दरकिनार करने के लिए, एक समय में एक विशिष्ट कोशिका प्रकार के रूप में एक विशिष्ट संदर्भ के भीतर तीव्र आनुवंशिक क्षोभ के प्रभाव का विश्लेषण कर सकता है एक तरह से हल । यह प्राप्त करने के लिए, आनुवंशिक उपकरण inducible के लिए, सेल प्रकार विशिष्ट अभिव्यक्ति1आवश्यक हैं । एक दिए गए effector के लिए एक प्रतिक्रिया की spatiotemporal गतिशीलता के तेजी से मूल्यांकन के लिए एक संसाधन प्रदान करने के लिए, हम जीआर-LhG4 प्रणाली के सिद्ध प्रभावकारिता के साथ GreenGate2 प्रणाली द्वारा प्रदान की क्लोनिंग की आसानी संयुक्त है3, 4,5,6. हम चिंराट ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर LhG4 अभिव्यक्त लाइनों का एक सेट उत्पंन किया है चूहा corticoid रिसेप्टर (जीआर)7 अच्छी तरह से विशेषता सेल प्रकार विशिष्ट प्रमोटरों के नियंत्रण के अंतर्गत के लिगामेंट बाध्यकारी डोमेन के लिए संगलित त । आराम की स्थिति में, प्रतिलेखन कारक नाभिक के बाहर रहता है, के रूप में जीआर डोमेन cytosolic HSP90 से बंधे है । सिंथेटिक लिडऔर dexamethasone (Dex) के अलावा, परमाणु स्थानांतरण प्रेरित है और LhG4 अभिव्यक्ति कैसेट के प्रतिलेखन एक सजात सिंथेटिक पॉप-प्रकार के प्रमोटर के नियंत्रण में, जैसे एक mTurquoise2 रिपोर्टर के रूप में मध्यस्थता करेगा शामिल करने के बाद अभिव्यक्ति डोमेन विज़ुअलाइज़ करने के लिए ड्रायवर पंक्तियाँ में सम्मिलित किया गया है ।  इस प्रकार, चालक लाइनों तकनीकी रूप से भी एक effector कैसेट होते हैं । एक के साथ एक effector कैसेट ले जाने की रेखा के साथ चालक लाइनों के एक सेट के पार, उदाहरण के लिए, एक ही पॉप के नियंत्रण में ब्याज की एक जीन प्रकार प्रमोटर इस प्रकार effector अभिव्यक्ति के तीव्र या दीर्घकालिक परिणामों के तेजी से मूल्यांकन की अनुमति देता है सेल प्रकार की एक विस्तृत श्रृंखला में ।
यहां, हम एक के लिए ड्राइवर और effector लाइनों उत्पंन और कैसे सेल प्रकार विशिष्ट अभिव्यक्ति प्रेरित किया जा सकता है और गोली मार शीर्षस्थ विभज्योतक, रूट शीर्षस्थ विभज्योतक और केंबियम में पालन करने के लिए आवश्यक प्रक्रियाओं का वर्णन प्रोटोकॉल प्रदान अरैडिडोप्सिस । इस दृष्टिकोण के कौशल और विशिष्टता का वर्णन करने के लिए, हम अच्छी तरह से ज्ञात ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर VND7 जो दारू की तरह माध्यमिक कोशिका दीवार thickenings ectopically9ड्राइविंग में सक्षम है का उपयोग । Pscr10,11 चालक लाइन और pOp6 के बीच एक क्रॉस से F1 इलाज : VND7 effector लाइन arabidopsis स्टेम के स्टार्च म्यान कोशिकाओं में अस्थानिक जाइलम की तरह कोशिकाओं के गठन की ओर जाता है.
चालक और effector अभिव्यक्ति plasmids के निर्माण के लिए आवश्यक बड़े डीएनए विधानसभाओं के उत्पादन की सुविधा के लिए, हम तेजी से और कुशल GreenGate क्लोनिंग विधि2का इस्तेमाल किया । GreenGate क्लोनिंग प्रकार द्वितीय एस इको31i या उसके isoschizomer Bsaमैं2के रूप में प्रतिबंध एंजाइमों पर आधारित है । इन एंजाइमों उनकी असममित मांयता साइटों के अनुप्रवाह में कटौती आधार संरचना के साथ overhangs उत्पादन । पारिस्थितिकी31i/Bsai को शामिल करके ओलिओन्यूक्लिओटाइड में प्रतिबंध साइटों और डीएनए तत्वों के लिए विशिष्ट अधिकता दृश्यों का आवंटन, मॉड्यूलर क्लोनिंग हासिल की है, बड़ी विधानसभाओं के उत्पादन की सुविधा । Greengate ढांचे में, डीएनए मॉड्यूल एक-एफ श्रेणियों में गिर अधिकता अनुक्रम कि एडेप्टर के रूप में काम करते है और उस क्रम में इकट्ठे होते है पर आधारित है । इसलिए, अपने वांछित उत्पाद बढ़ाना करने के लिए डिज़ाइन प्राइमरों चयनित मॉड्यूल2 के साथ अनुसार होना चाहिए (चित्र 1a). अगर वहां एक आंतरिक पर्यावरण31i/Bsaमैं साइट और अनुक्रम greengate प्रवेश और गंतव्य मॉड्यूल के साथ संगत नहीं है, तो आप mutagenizing बिना आगे बढ़ सकते हैं, लेकिन कम दक्षता के साथ । वैकल्पिक रूप से, साइट का उपयोग करें निर्देशित mutagenesis को हटाने केलिए पारिस्थितिकी31i/

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>K029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Column purification</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit (250)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture chamber for imaging</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG</td>
			<td>1-well tissue culture chamber, on cover glass II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>D139-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eco31I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FD0294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>injection cannula (0.30 x 12 mm, 30 G x 1/2)</td>
			<td>Sterican, Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>T832.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO lambda blue 63x water immersion objectiv</td>
			<td>Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS medium</td>
			<td>Duchefa, Haarlem, Netherlands</td>
			<td>M0221.0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x&#160; 1.1 NA water immersion objective</td>
			<td>Nikon, Minato, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35/10 mm</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Germany</td>
			<td>627102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60/150 mm</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Germany</td>
			<td>628102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 120/120/17</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Germany</td>
			<td>688102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant agar</td>
			<td>Duchefa, Haarlem, Netherlands</td>
			<td>P1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid extraction</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide (PI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razorblade</td>
			<td>Classic, Wilkinson Sword GmbH</td>
			<td>7005115E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tubes</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silwet L-77</td>
			<td>Kurt Obermeier GmbH &#38; Co. KG, Bad Berleburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>3834.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NanoDrop 2000c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfadiazine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>2228.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Ligase 5 U/&#181;l</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Ligase 30 U/&#181;l</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EL0013</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducible, cell type-specific expression in arabidopsis thaliana through lhgr-mediated trans-activation

Inducible, ऊतक विशिष्ट अभिव्यक्ति एक महत्वपूर्ण और शक्तिशाली करने के लिए आनुवंशिक क्षोभ के spatio-लौकिक गतिशीलता का अध्ययन उपकरण है । सिद्ध और बेंचमार्क LhGR प्रणाली के साथ लचीला और कुशल GreenGate क्लोनिंग प्रणाली का मेल (यहां जीआर-LhG4) inducible अभिव्यक्ति के लिए कहा, हम ट्रांसजेनिक Arabidopsis लाइनों का एक सेट है कि एक effector की अभिव्यक्ति ड्राइव कर सकते है उत्पंन किया है तीन मुख्य संयंत्र meristems में विशिष्ट कोशिका प्रकार की एक श्रृंखला में कैसेट । यह अंत करने के लिए, हम पहले से विकसित जीआर-LhG4 प्रणाली एक chimeric ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर और एक सजात पॉप प्रकार अभिव्यक्ति के स्तर की एक विस्तृत श्रृंखला पर तंग नियंत्रण सुनिश्चित करने के प्रमोटर के आधार पर चुना । इसके अलावा, जहां सिंथेटिक ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर सक्रिय है अभिव्यक्ति डोमेन विज़ुअलाइज़ करने के लिए, एक एर-स्थानीयकृत mTurquoise2 फ्लोरोसेंट रिपोर्टर नियंत्रण में pOp4 या pOp6 प्रमोटर ड्राइवर लाइनों में एंकोडेड है । यहाँ, हम एक ड्राइवर या effector लाइन उत्पन्न करने के लिए आवश्यक कदम का वर्णन और कैसे सेल प्रकार विशिष्ट अभिव्यक्ति प्रेरित किया जा सकता है और गोली मार शीर्षस्थ विभज्योतक, रूट शीर्षस्थ विभज्योतक और arabidopsisके केंबियम में पालन करने के लिए प्रदर्शन. कई या सभी ड्राइवर लाइनों का उपयोग करके, एक या कई कारकों (effectors) सिंथेटिक पॉप प्रमोटर के नियंत्रण में व्यक्त करने के संदर्भ विशिष्ट प्रभाव तेजी से मूल्यांकन किया जा सकता, उदाहरण के लिए एक पार के F1 पौधों में एक effectors और कई के बीच ड्राइवर रेखाएं । इस दृष्टिकोण VND7 की अस्थानिक अभिव्यक्ति, एक एनएसी प्रतिलेखन कारक एक सेल स्वायत्त तरीके से अस्थानिक माध्यमिक सेल दीवार बयान उत्प्रेरण में सक्षम द्वारा उदाहरण है ।

चालक और effector लाइनों के GreenGate क्लोनिंग के माध्यम से उत्पादन
GreenGate क्लोनिंग प्रणाली GoldenGate क्लोनिंग पर आधारित है और प्रकार का उपयोग करें IIS प्रतिबंध endonuclease बीएसएमैं या उसके isoschizomer पारिस्थितिक?...

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Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, सेल प्रकार- Arabidopsis में विशेष अभिव्यक्ति lhgr के माध्यम से thaliana-मध्यस्थता ट्रांस-सक्रियण

यहाँ हम ट्रांसजेनिक अरेबिडोप्सिस थालियाना लाइनों के एक सेट के उत्पादन और अनुप्रयोग का वर्णन करते हैं, जो तीन मुख्य विभज्योतक में, ऊतक-विशिष्ट अभिव्यक्ति को सक्षम करने में समर्थ बनाता है, प्ररोह-शीर्षस्थ विभज्योतक, मूल शीर्षस्थ विभज्योतक, और कैंबीयम ।

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

विकासात्मक जीव विज्ञान में मुख्य लक्ष्य एक जीन के संदर्भ-विशिष्ट भूमिका को समझना है । और यह पारंपरिक नॉकआउट म्यूटेंट द्वारा या गठनात्मक अतिव्यक्तता लाइनों द्वारा प्राप्त करना मुश्किल हो सकता है। हमने मॉडल संयंत्र अरेबिडोप्सिस थैलियाना के तीन मुख्य मेरिस्टेम्स में कठिन साइटो-विशिष्ट अभिव्यक्ति के लिए एक संसाधन उत्पन्न करने के लिए मॉड्यूलर ग्रीन गेट क्लोनिंग सिस्टम का उपयोग किया।एक ही मॉड्यूलर क्लोनिंग रणनीति का उपयोग करके, इस विधि को अन्य पौधों की प्रजातियों पर लागू किया जा सकता है जो परिवर्तन के लिए अपरिवर्तनीय हैं। इस प्रक्रिया का दृश्य प्रदर्शन मूल्यवान है क्योंकि स्टेम के मेरिस्टेम्स में ट्रांस-एक्टिवेशन के प्रभाव का विश्लेषण करना और छोटे शीर्ष को इमेजिंग से पहले विच्छेदन की आवश्यकता होती है, जो काफी चुनौतीपूर्ण हो सकता है। शुरू करने के लिए, पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित बीजों को स्टरलाइज करें।इसके बाद, पीएच 5.8 पर आधी ताकत मुर्शिज और स्कूग माध्यम तैयार करें और एक प्रतिशत सुक्रोज और 0.9% एगर जोड़ें। ऑटोक्लेविंग के बाद, 10 से 30 माइक्रोमोलर के बीच अंतिम एकाग्रता पर इंडक्शन प्लेटों में डीएमएसओ में भंग डेक जोड़ें। नियंत्रण प्लेटों में डीएमएसओ की बराबर मात्रा जोड़ें।प्लेटों पर रूट इमेजिंग के लिए बीज रखो और अंधेरे में ४८ घंटे के लिए और चार डिग्री सेल्सियस पर उन्हें स्तरीकृत । प्लेटों को एक पौधे के इनक्यूबेटर में ऊर्ध्वाधर स्थिति में रखें और उन्हें पांच दिनों तक उगाएं। अंकुरण के पांच दिन बाद, रोपण को छवि बनाने के लिए कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी का उपयोग करें।शुरू करने के लिए, तैयार करने और पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित बीज विकसित करने के लिए। अंकुरण के छह से सात दिन बाद, प्रत्येक अंकुर को एक अलग बर्तन में मिट्टी में स्थानांतरित करें। यदि पौधों को पानी से प्रेरित करते हैं, तो इथेनॉल में भंग 25 मिलीमोलर डेक्स के स्टॉक से तैयार पानी में 25 माइक्रोमोलर डेक्स समाधान का उपयोग करें।इंडक्शन के वांछित समय तक हर दो से तीन दिन में पानी। यदि सूई से उत्प्रेरण करते हैं, तो 25 माइक्रोमोलर अंतिम एकाग्रता या डेक्स और मॉक ट्रीटमेंट के लिए डीएमएसओ की बराबर राशि पर 0.02% सिलवेट एल77 और डेक्स युक्त 750 मिलीलीटर पानी के साथ एक लीटर बीकर तैयार करें। एक पौधे को 30 सेकंड के लिए इंडक्शन या मॉक सॉल्यूशन में डुबोएं।इमेजिंग के वांछित समय तक, हर दो से तीन दिनों में दोहराएं। शुरू करने के लिए, तैयार करने और पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित बीज विकसित करने के लिए। अंकुरण के छह से सात दिन बाद, प्रत्येक अंकुर को एक अलग बर्तन में मिट्टी में स्थानांतरित करें।जब तने के आसपास एक सेंटीमीटर लंबा है, पानी में 10 और ५० माइक्रोमोलर डेक्स समाधान के बीच के साथ influorescent सैम स्प्रे । विकास के बाद के चरणों में प्रेरण और इमेजिंग के लिए, लंबे समय तक उपजी या साइड शूट के एसएएम को प्रेरित करें। इंडक्शन के 24 से 48 घंटे बाद एसएएम को विच्छेदन करें और इमेजिंग के लिए आगे बढ़ें।सबसे पहले, प्लेट से रोपण को प्रोपिडियम आयोडाइड के 10 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर समाधान में स्थानांतरित करें और उन्हें पांच मिनट के लिए काउंटरटेन करें। जड़ों को माइक्रोस्कोप इमेजिंग कक्ष में रखें और 63x पानी विसर्जन उद्देश्य के साथ एक कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग करके उन्हें छवि दें। प्रोपिडियम आयोडाइड फ्लोरेसेंस की कल्पना करने के लिए, 488 नैनोमीटर की एक्सटिटेशन वेवलेंथ का उपयोग करें और 590 और 660 नैनोमीटर के बीच उत्सर्जन एकत्र करें।mTurquoise2 फ्लोरेसेंस के लिए, 458 नैनोमीटर उत्तेजन का उपयोग करें और अनुक्रमिक स्कैनिंग का उपयोग करके 460 और 615 नैनोमीटर के बीच उत्सर्जन एकत्र करें। सबसे पहले, वांछित अनुभाग के विपरीत दिशा में एक उंगली के साथ एक स्टेम को ठीक करें। एक रेजर ब्लेड का उपयोग करना, लगभग तीन सेंटीमीटर के एक खंड में कटौती और कई ठीक कटौती प्रदर्शन करते हैं ।नल के पानी युक्त पेट्री डिश में रेजर ब्लेड कुल्ला और स्टेम वर्गों को इकट्ठा। या तो वर्गों दाग या सीधे उन्हें माइक्रोस्कोप स्लाइड पर माउंट। धुंधला करने के लिए, एक प्रतिक्रिया ट्यूब में प्रोपिडियम आयोडाइड के 250 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर समाधान का एक मिलीलीटर तैयार करें।पेट्री डिश से नल के पानी को पिपेट से निकालकर प्रोपिडियम आयोडाइड सॉल्यूशन और दाग से पांच मिनट तक बदल दें। इसके बाद प्रोपिडियम आयोडाइड का घोल निकालकर पानी से कुल्ला करें। या तो ठीक संदंश या एक ठीक तूलिका का उपयोग करना, दाग वर्गों को माइक्रोस्कोप स्लाइड में स्थानांतरित करें।नमूनों की छवि के लिए 25x सूई पानी विसर्जन लेंस के साथ एक कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। प्रोपिडियम आयोडाइड फ्लोरेसेंस को उत्तेजित करने और 570 से 620 नैनोमीटर तक उत्सर्जन एकत्र करने के लिए 561 नैनोमीटर लेजर लाइट का उपयोग करें। ड्राइवर लाइन निर्माण द्वारा एन्कोड किए गए mTurquoise2 फ्लोरोफोरे प्रभावक को उत्तेजित करने के लिए 405 नैनोमीटर लेजर लाइट का उपयोग करें और 425 से 475 नैनोमीटर तक उत्सर्जन एकत्र करें।सबसे पहले, शूट टिप से दो सेंटीमीटर नीचे स्टेम को काटने के लिए संदंश का उपयोग करें। एक हाथ में तने को पकड़ें और फूलों की कलियों और बड़े प्राइमोर्डिया को हटाने के लिए बारीक संदंश का उपयोग करें। युवा प्राइमोर्डिया को हटाने के लिए, तीन प्रतिशत agarose युक्त पेट्री डिश में एक ईमानदार स्थिति में सैम को ठीक करें ।इसके बाद, सैम के करीब किसी भी युवा प्राइमोर्डिया को हटाने के लिए दूरबीन और संदंश का उपयोग करें। विच्छेदित सैम को प्रोपिडियम आयोडाइड के 250 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर समाधान वाली ट्यूब में स्थानांतरित करें। नमूना दाग पांच से 10 मिनट के लिए करते हुए सुनिश्चित करें कि नमूना धुंधला प्रक्रिया के दौरान पूरी तरह से जलमग्न रहता है ।दाग सैम को एक छोटे से पेट्री डिश में रखें जिसमें तीन प्रतिशत एगर उठे माध्यम होते हैं। सैम को डबल डिस्टिल्ड पानी से ढक दें। विच्छेदित एसएएम की छवि के लिए 25x सूई पानी विसर्जन लेंस से लैस एक कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।प्रोपिडियम आयोडाइड फ्लोरेसेंस को उत्तेजित करने और 570 से 620 नैनोमीटर तक उत्सर्जन एकत्र करने के लिए 561 नैनोमीटर लेजर लाइट का उपयोग करें। mTurquoise2 फ्लोरोफोर को उत्तेजित करने और 425 से 475 नैनोमीटर तक उत्सर्जन एकत्र करने के लिए 405 नैनोमीटर लेजर लाइट का उपयोग करें। 0.5 माइक्रोमीटर के एक कदम आकार के साथ जेड दिशा में 50 माइक्रोमीटर फैले रिकॉर्ड छवि ढेर।डेक्स के साथ प्रेरण से रूट एंडोडरमिस में सेल-टाइप विशिष्ट mTurquoise2 अभिव्यक्ति की ओर जाता है फ्लोएम अग्रदूत और कैम्बियम, और शूट एपिकल मेरिस्टेम में स्टेम सेल। ट्रांसएक्टिवेशन के लिए एक परीक्षण मामले के रूप में, माध्यमिक सेल वॉल मास्टर ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर VND7 को एन्कोडिंग करने वाली एक प्रभावक लाइन उत्पन्न होती है। डेक्स या डीएमएसओ के या तो 15 माइक्रोलीटर के साथ एकल उपचार के पांच दिनों के बाद, स्टेम सेक्शन शुरू म्यान में एक्टोपिक लिग्निफिकेशन के दृश्य के लिए तैयार किए जाते हैं।प्रेरित नमूनों में शुरू म्यान कोशिकाओं प्रोपिडियम आयोडाइड चैनल के लिए एक मजबूत संकेत दिखाते है और कुछ कोशिकाओं दारू कोशिकाओं में सेल की दीवार के ठेठ रेटिकुलेट मोटा दिखा । इस वीडियो को देखने के बाद, आपको स्पष्ट समझ होनी चाहिए कि विभिन्न ऊतकों में जीन अभिव्यक्ति को कैसे प्रेरित किया जाए और इमेजिंग के लिए अपने नमूने कैसे तैयार करें। इस प्रक्रिया के बाद, स्थापित ड्राइवर लाइनों का उपयोग उनके शोध हितों के अनुसार अन्य उपयोगकर्ताओं द्वारा उत्पन्न विभिन्न प्रकार के प्रभावक निर्माणों के साथ किया जा सकता है।इस शॉर्टकट संयंत्र शोधकर्ताओं को तेजी से सेल प्रकार विशिष्ट अभिव्यक्ति या एक समय आरक्षित तरीके से ब्याज के एक जीन के नॉकआउट के प्रभाव का आकलन करने में मदद करनी चाहिए । इस सेल-टाइप स्पेसिफिक इंडक्शन सिस्टम में कोर्टिकोस्टेरॉयड डेक्सामेथासोन के इस्तेमाल की जरूरत होती है। सीधे संपर्क से बचना चाहिए, इसलिए इलाज के दौरान दस्ताने और फेस मास्क पहनना जरूरी है।

Research

JoVE Journal

Genetics

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

The Terroir Concept Interpreted through Grape Berry Metabolomics and Transcriptomics

Terroir संकल्पना अंगूर बेरी Metabolomics और transcriptomics के माध्यम से व्याख्या

Terroir refers to the combination of environmental factors that affect the characteristics of crops such as grapevine (Vitis vinifera) according to ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

मानव प्राथमिक सेल संस्कृतियों में circadian घड़ी जीन अभिव्यक्ति और हार्मोन के स्राव के समानांतर मापन

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

एकल कोशिका जीन एक्सप्रेशन मल्टीप्लेक्स RT-qPCR का उपयोग दुर्लभ Lymphoid आबादी की विविधता विशेषताएँ

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

पालन ​​और मिटायें बीटल में डबल असहाय शाही सेना की मध्यस्थता जीन पछाड़ना,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Inducible T7 आरएनए पोलीमरेज़ मध्यस्थता बहुउद्देशीय अभिव्यक्ति प्रणाली, पीएमजीएक्स

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

एकल कोशिका जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा आंतरिक मानकों के साथ FACS और qPCR का उपयोग

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Inducible क्षणिक अभिकर्मक के माध्यम से चलाया आयन चैनल अभिव्यक्ति

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

दो पूरक सेल तुल्यकालन प्रोटोकॉल द्वारा सेल चक्र-विनियमित जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन करना

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

गठन और Inducible सिस्टम के लिए आनुवंशिक Vivo में संशोधन माउस हेपैटोसाइट्स का उपयोग Hydrodynamic टेल नस इंजेक्शन

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

एक Optogenetic विधि को नियंत्रित करने और सेल में जीन अभिव्यक्ति पैटर्न का विश्लेषण करने वाली सेल बातचीत

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...