Name: inducible, cell type-specific expression in arabidopsis thaliana through lhgr-mediated trans-activation
Uploaded: 2019-04-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation at JoVE.com

Lavoro nei nostri laboratori è sostenuto dalla Fondazione di ricerca tedesca (DFG) sovvenzioni WO 1660/6-1 (a S.W.) e GR 2104/4-1 (a T.G.) e SFB1101 (da T.G. e J.U.L) e da un Consiglio europeo della ricerca consolidator concedere (PLANTSTEMS 647148) a T.G.  S.W. è supportato attraverso il Emmy Noether Fellowship del DFG attraverso Grant WO 1660/2.

Vettori e moduli possono essere ottenuti dal repository non-profit, Addgene (https://www.addgene.org).
1. clonazione usando GreenGate
<ol><li>Disegno primer utilizzando gli strapiombi elencati nella tabella 1, sostituendo 'NNNN' con sequenze di adattatore tipo-specifico modulo elencati di seguito: avanti: 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) CA* + 3 ´ sequenza specifica, inversa: 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) + retromarcia complemento di 3 ´ sequenza specifica. Aggiunge...

<ol>
	<li>Moore, I., Samalova, M., Kurup, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivated+and+chemically+inducible+gene+expression+in+plants.">Transactivated and chemically inducible gene expression in plants.</a> The Plant Journal. 45 (4), 651-683 (2006).</li><li>Lampropoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GreenGate---a+novel,+versatile,+and+efficient+cloning+system+for+plant+transgenesis.">GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis.</a> PLoS One. 8 (12), e83043 (2013).</li><li>Baroux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictable+activation+of+tissue-specific+expression+from+a+single+gene+locus+using+the+pOp/LhG4+transactivation+system+in+Arabidopsis.">Predictable activation of tissue-specific expression from a single gene locus using the pOp/LhG4 transactivation system in Arabidopsis.</a> Plant Biotechnology Journal. 3 (1), 91-101 (2005).</li><li>Craft, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+pOp/LhG4+vectors+for+stringent+glucocorticoid-dependent+transgene+expression+in+Arabidopsis.">New pOp/LhG4 vectors for stringent glucocorticoid-dependent transgene expression in Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 41 (6), 899-918 (2005).</li><li>Moore, I., Galweiler, L., Grosskopf, D., Schell, J., Palme, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcription+activation+system+for+regulated+gene+expression+in+transgenic+plants.">A transcription activation system for regulated gene expression in transgenic plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (1), 376-381 (1998).</li><li>Samalova, M., Brzobohaty, B., Moore, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pOp6/LhGR:+a+stringently+regulated+and+highly+responsive+dexamethasone-inducible+gene+expression+system+for+tobacco.">pOp6/LhGR: a stringently regulated and highly responsive dexamethasone-inducible gene expression system for tobacco.</a> The Plant Journal. 41 (6), 919-935 (2005).</li><li>Picard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steroid-binding+domains+for+regulating+the+functions+of+heterologous+proteins+in+cis.">Steroid-binding domains for regulating the functions of heterologous proteins in cis.</a> Trends in Cell Biology. 3 (8), 278-280 (1993).</li><li>Schurholz, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comprehensive+Toolkit+for+Inducible,+Cell+Type-Specific+Gene+Expression+in+Arabidopsis.">A Comprehensive Toolkit for Inducible, Cell Type-Specific Gene Expression in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 178 (1), 40-53 (2018).</li><li>Kubo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+switches+for+protoxylem+and+metaxylem+vessel+formation.">Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation.</a> Genes and Development. 19 (16), 1855-1860 (2005).</li><li>Di Laurenzio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SCARECROW+gene+regulates+an+asymmetric+cell+division+that+is+essential+for+generating+the+radial+organization+of+the+Arabidopsis+root.">The SCARECROW gene regulates an asymmetric cell division that is essential for generating the radial organization of the Arabidopsis root.</a> Cell. 86 (3), 423-433 (1996).</li><li>Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+SCARECROW+function+reveals+a+radial+patterning+mechanism+common+to+root+and+shoot.">Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot.</a> Development. 127 (3), 595-603 (2000).</li><li>Hellens, R. P., Edwards, E. A., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pGreen:+a+versatile+and+flexible+binary+Ti+vector+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation.">pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Plant Molecular Biology. 42 (6), 819-832 (2000).</li><li>Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana+using+the+floral+dip+method.">Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method.</a> Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).</li><li>Kleinboelting, N., Huep, G., Kloetgen, A., Viehoever, P., Weisshaar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABI-Kat+SimpleSearch:+new+features+of+the+Arabidopsis+thaliana+T-DNA+mutant+database.">GABI-Kat SimpleSearch: new features of the Arabidopsis thaliana T-DNA mutant database.</a> Nucleic Acids Research. 40 (Database issue), D1211-D1215 (2012).</li><li>. Selection scheme used at GABI-Kat for resistance to sulfadiazine Available from: <a target="_blank" href="https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html">https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html</a> (2018)</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+addition+quantitative+real-time+PCR+(SAQPCR):+a+novel+approach+for+determination+of+transgene+copy+number+avoiding+PCR+efficiency+estimation.">Standard addition quantitative real-time PCR (SAQPCR): a novel approach for determination of transgene copy number avoiding PCR efficiency estimation.</a> PLoS One. 8 (1), e53489 (2013).</li><li>Wallner, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strigolactone-+and+Karrikin-Independent+SMXL+Proteins+Are+Central+Regulators+of+Phloem+Formation.">Strigolactone- and Karrikin-Independent SMXL Proteins Are Central Regulators of Phloem Formation.</a> Current Biology. 27 (8), 1241-1247 (2017).</li><li>Fletcher, J. C., Brand, U., Running, M. P., Simon, R., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+of+cell+fate+decisions+by+CLAVATA3+in+Arabidopsis+shoot+meristems.">Signaling of cell fate decisions by CLAVATA3 in Arabidopsis shoot meristems.</a> Science. 283 (5409), 1911-1914 (1999).</li><li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cellulose+synthases+in+Arabidopsis+secondary+cell+walls.">Visualization of cellulose synthases in Arabidopsis secondary cell walls.</a> Science. 350 (6257), 198-203 (2015).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VASCULAR-RELATED+NAC-DOMAIN6+and+VASCULAR-RELATED+NAC-DOMAIN7+effectively+induce+transdifferentiation+into+xylem+vessel+elements+under+control+of+an+induction+system.">VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN6 and VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN7 effectively induce transdifferentiation into xylem vessel elements under control of an induction system.</a> Plant Physiology. 153 (3), 906-914 (2010).</li><li>Engineer, C. B., Fitzsimmons, K. C., Schmuke, J. J., Dotson, S. B., Kranz, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+a+Gal4-mediated+LUC/GFP/GUS+enhancer+trap+system+in+Arabidopsis.">Development and evaluation of a Gal4-mediated LUC/GFP/GUS enhancer trap system in Arabidopsis.</a> BMC Plant Biology. 5, 9 (2005).</li><li>Aoyama, T., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glucocorticoid-mediated+transcriptional+induction+system+in+transgenic+plants.">A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants.</a> The Plant Journal. 11 (3), 605-612 (1997).</li><li>Decaestecker, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-TSKO+facilitates+efficient+cell+type-,+tissue-,+or+organ-specific+mutagenesis+in+Arabidopsis.">CRISPR-TSKO facilitates efficient cell type-, tissue-, or organ-specific mutagenesis in Arabidopsis.</a> bioRxiv. , (2018).</li></ol>

Qui, descriviamo i passaggi necessari per generare e applicare un toolkit completo e versatile per inducibile, cella tipo specifico trans-attivazione. Linee trasporto cassette effettrici sotto il controllo del promotore pOp con driver linee incrociate permette di studiare gli effetti di mis-espressione nella generazione F1, consentendo la rapida valutazione genetica perturbazione in una vasta gamma di tipi di cellule. In alternativa, effettore costrutti possono essere utilizzate per trasformare driver l...

Una limitazione importante nella biologia, nell'era della postegnomica è quello di decifrare il ruolo specifico del contesto di un determinato fattore o perturbazione genetica. Genetici costitutivi perturbazioni come approcci di funzione di perdita e guadagno di funzione permettono spesso solo endpoint analisi di processi di adattamento permanente, offuscando la distinzione tra effetti primari e secondari. Inoltre, funzioni specifiche di contesto possono essere mascherate o diluite dagli effetti su larga scala nei tessuti distanti o durante altre fasi di sviluppo. Inoltre, in casi estremi, letalità può precludere qualsiasi visione meccanicistica. Idealmente, per ovviare a questi problemi, si potrebbe analizzare l'effetto di perturbazione acuta genetica all'interno di un contesto specifico come uno specifico tipo cellulare in un modo risolta nel tempo. Per raggiungere questo obiettivo, strumenti genetici per inducibile, espressione di tipo specifico delle cellule sono necessarie1. Per fornire una risorsa per la rapida valutazione spazio-temporale della dinamica di una risposta a un determinato effettore, abbiamo combinato la facilità della clonazione fornito da GreenGate system2 con la provata efficacia del GR-LhG4 system3, 4,5,6. Abbiamo generato una serie di linee che esprimono il fattore di trascrizione chimerica che lhg4 fusa per il dominio di legame del ligando del ratto del corticoide del ricevitore (GR)7 sotto il controllo di ben caratterizzati cella tipo promotori specifici8. In condizioni di riposo, il fattore di trascrizione rimane di fuori del nucleo, come il dominio GR è vincolato il HSP90 citosolico. Con l'aggiunta di ligando sintetico desametasone (Dex), traslocazione nucleare è indotta e LhG4 medierà trascrizione delle cassette di espressione sotto il controllo di un promotore sintetico cognate pOp-tipo , come un reporter di mTurquoise2 tra le linee di driver per visualizzare il dominio di espressione dopo induzione.  Così, le linee di driver tecnicamente inoltre contengono una cassetta dell'effettore. L'attraversamento di un insieme di driver linee con una linea che trasportano una cassetta effettrici con, ad esempio, un gene di interesse sotto il controllo dello stesso tipo di pOp promotore così permette la rapida valutazione delle conseguenze acute o a lungo termine dell'espressione dell'effettore in una vasta gamma di tipi di cellule.
Qui, forniamo un protocollo che descrive le procedure necessarie per generare le linee pilota ed effettrici e dimostrare come espressione specifica del tipo di cella può essere indotta e seguita nel meristema apicale sparare, radice meristema apicale e il cambio di Arabidopsis. Per illustrare la bravura e la specificità di questo approccio, utilizziamo il fattore di trascrizione ben noto VND7 che è in grado di pilotare ectopically cella secondaria xilema-come agenti d'ispessimento parete9. Trattamento di F1 da un incrocio tra la riga di driver pSCR11 10,e la linea di effettori pOp6:VND7 conduce alla formazione ectopica xilema-come delle cellule nel fodero dell'amido staminali cellule di Arabidopsis .
Per facilitare la generazione di grandi assiemi di DNA richiesto per la costruzione di driver ed effettrici plasmidi di espressione, abbiamo usato il veloce ed efficiente GreenGate clonazione metodo2. Clonazione di GreenGate è basato sugli enzimi di limitazione di tipo II S come Eco31I o sua isoschizomer Bsami2. Questi enzimi tagliato a valle dei rispettivi siti di riconoscimento asimmetrica producendo strapiombi con varia composizione base. Incorporando Eco31I /Bsaho siti di restrizione nell'oligonucleotidi e allocare sbalzo specifiche sequenze di elementi del DNA, clonazione modulare è raggiunto, facilitare la generazione di grandi assiemi. Nel quadro GreenGate, moduli di DNA si dividono in categorie A-F basato sulla sequenza di sporgenza che fungono da adattatori e vengono assemblate in quell'ordine. Pertanto, il primer disegnati per amplificare il vostro prodotto desiderato dovrebbe essere secondo il modulo selezionato2 (Figura 1A). Se c'è un interno Eco31I /BsaI sito e la sequenza non è compatibile con i moduli di ingresso e destinazione di GreenGate, si può procedere senza mutagenizing, ma con minore efficienza. In alternativa, utilizzare mutagenesi sito-diretta per rimuovere Eco31I /Bsaho siti di restrizione facendo attenzione a non per cambiare gli amminoacidi in prodotti del gene.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>K029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Column purification</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit (250)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture chamber for imaging</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG</td>
			<td>1-well tissue culture chamber, on cover glass II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>D139-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eco31I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FD0294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>injection cannula (0.30 x 12 mm, 30 G x 1/2)</td>
			<td>Sterican, Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>T832.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO lambda blue 63x water immersion objectiv</td>
			<td>Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS medium</td>
			<td>Duchefa, Haarlem, Netherlands</td>
			<td>M0221.0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x&#160; 1.1 NA water immersion objective</td>
			<td>Nikon, Minato, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35/10 mm</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Germany</td>
			<td>627102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60/150 mm</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Germany</td>
			<td>628102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 120/120/17</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Germany</td>
			<td>688102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant agar</td>
			<td>Duchefa, Haarlem, Netherlands</td>
			<td>P1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid extraction</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide (PI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razorblade</td>
			<td>Classic, Wilkinson Sword GmbH</td>
			<td>7005115E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tubes</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silwet L-77</td>
			<td>Kurt Obermeier GmbH &#38; Co. KG, Bad Berleburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>3834.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NanoDrop 2000c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfadiazine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>2228.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Ligase 5 U/&#181;l</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Ligase 30 U/&#181;l</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EL0013</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducible, cell type-specific expression in arabidopsis thaliana through lhgr-mediated trans-activation

Espressione inducibile, tessuto-specifici è un importante e potente strumento per studiare la dinamica spazio-temporale di perturbazione genetica. Combinando la GreenGate flessibile ed efficiente con il collaudato e analizzato LhGR sistema (qui chiamato GR-LhG4) per l'espressione inducibile di clonazione, abbiamo generato un insieme di linee transgeniche di Arabidopsis che può guidare l'espressione di un effettore Cassetta in una gamma di tipi cellulari specifici nei tre meristemi stabilimento principale. A tal fine, abbiamo scelto il sistema GR-LhG4 precedentemente sviluppato basato su un fattore di trascrizione chimerica e un promotore di cognate pOp-tipo garantendo il controllo stretto sopra una vasta gamma di livelli di espressione. Inoltre, per visualizzare il dominio di espressione dove il fattore di trascrizione sintetica è attivo, un reporter fluorescente mTurquoise2 ER-localizzata sotto il controllo del promotore pOp4 o pOp6 è codificato in linee di driver. Qui, descriviamo i passaggi necessari per generare una linea driver o effettore e dimostrare come espressione specifica del tipo di cella può essere indotta e seguita nel meristema apicale sparare, radice meristema apicale e il cambio di Arabidopsis. Utilizzando linee di alcuni o tutti i driver, l'effetto specifico contesto di esprimere uno o molteplici fattori (effettori) sotto il controllo del promotore sintetico pOp può essere valutati rapidamente, ad esempio in piante F1 di un incrocio tra un effettore e multiplo linee di driver. Questo approccio è esemplificato dall'espressione ectopica di VND7, un fattore di trascrizione NAC in grado di indurre la deposizione di parete cella secondaria ectopica in maniera autonoma delle cellule.

Generazione di driver ed effettrici linee attraverso la clonazione GreenGate
La GreenGate clonazione sistema si basa su GoldenGate clonazione e uso l'endonucleasi di restrizione di tipo IIS Bsaio o la sua isoschizomer Eco31I. Come l'enzima produce sporgenze lontane dal suo sito di riconoscimento asimmetrica, la composizione di base degli strapiombi possono essere liberamente scelto, che è la base forma la modularità del sistema. Ogni elemento di PCR-generat...

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Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Viscoelastica, espressione di tipo specifico delle cellule in Arabidopsis thaliana attraverso LhGR-mediata Trans-attivazione

Qui, descriviamo la generazione e applicazione di un insieme di transgeniche di Arabidopsis thaliana linee espressione inducibile, tessuto-specifica abilitazione in tre meristemi principali, il meristema apicale di sparare, radice meristema apicale e il cambio.

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

L'obiettivo chiave della biologia dello sviluppo è comprendere il ruolo specifico del contesto di un gene. E questo può essere difficile da raggiungere con mutanti knockout convenzionali o con linee di sovraespressione costitutive. Abbiamo utilizzato il sistema modulare di clonazione a cancello verde per generare una risorsa per l'espressione cito-specifica induttibile nei tre meristemi principali dell'impianto modello Arabidopsis thaliana.Utilizzando la stessa strategia di clonazione modulare, questo metodo può essere applicato ad altre specie vegetali immutabili alla trasformazione. La dimostrazione visiva di questa procedura è preziosa perché l'analisi dell'effetto della transattivazione nei meristemi dello stelo e dell'apice corto richiede la dissezione prima dell'imaging, che può essere piuttosto impegnativo. Per iniziare, sterilizzare i semi come delineato nel protocollo di testo.Quindi, preparare il mezzo di resistenza Murashige e Skoog a pH 5,8 e aggiungere l'uno per cento di saccarosio e lo 0,9% di agar. Dopo l'autoclave, aggiungere Dex sciolto in DMSO alle piastre di induzione ad una concentrazione finale compresa tra 10 e 30 micromolari. Aggiungere una quantità uguale di DMSO alle piastre di controllo.Metti i semi per l'imaging delle radici sulle piastre e stratificali per 48 ore nell'oscurità e a quattro gradi Celsius. Metti le piastre in posizione verticale in un incubatore di piante e coltivale per cinque giorni. Cinque giorni dopo la germinazione, utilizzare la microscopia a scansione laser confocale per immagini le piantine.Per iniziare, preparare e coltivare i semi come delineato nel protocollo di testo. Da sei a sette giorni dopo la germinazione, trasferire ogni piantina sul terreno in una pentola separata. Se si inducono le piante annaffiando, utilizzare una soluzione DEX da 25 micromolare in acqua, preparata da uno stock di 25 millimolare DEX sciolto in etanolo.Annaffiare ogni due o tre giorni fino al tempo desiderato di induzione. Se si induce mediante immersione, preparare un bicchiere da un litro con 750 millilitri di acqua contenenti 0,02%Silwet L77 e DEX a concentrazione finale di 25 micromolare o una quantità equivalente di DMSO per il dex e il trattamento fittizio. Immergere una singola pianta nella soluzione di induzione o fittizia per 30 secondi.Ripetere ogni due o tre giorni, fino al tempo desiderato per l'imaging. Per iniziare, preparare e coltivare i semi come delineato nel protocollo di testo. Da sei a sette giorni dopo la germinazione, trasferire ogni piantina sul terreno in una pentola separata.Quando lo stelo è lungo circa un centimetro, spruzzare il MAS influorescente con una soluzione DEX tra 10 e 50 micromolare in acqua. Per l'induzione e l'imaging nelle fasi successive di sviluppo, indurre MAS di steli più lunghi o germogli laterali. Da 24 a 48 ore dopo l'induzione, sezionare i MAS e procedere all'imaging.In primo luogo, trasferire le piantine dalla piastra a una soluzione di 10 microgrammi per millilitro di ioduro di propidio e controsostenirle per cinque minuti. Posiziona le radici in una camera di imaging al microscopio e immaginile utilizzando un microscopio a scansione laser confocale con un obiettivo di immersione in acqua 63x. Per visualizzare la fluorescenza del ioduro propidio, utilizzare una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nanometri e raccogliere emissioni tra 590 e 660 nanometri.Per la fluorescenza mTurquoise2, utilizzare l'eccitazione di 458 nanometri e raccogliere emissioni tra 460 e 615 nanometri utilizzando la scansione sequenziale. Per prima cosa, fissare uno stelo con un dito sul lato opposto della sezione desiderata. Utilizzando una lama di rasoio, tagliare un segmento di circa tre centimetri ed eseguire diversi tagli fini.Risciacquare la lama del rasoio in una piastra di Petri contenente acqua di rubinetto e raccogliere le sezioni del gambo. Macchiare le sezioni o montarle direttamente su vetrini al microscopio. Per la colorazione, preparare un millilitro di una soluzione di 250 microgrammi per millilitro di ioduro di propidio in un tubo di reazione.Rimuovere l'acqua del rubinetto dalla piastra di Petri con una pipetta e sostituirla con la soluzione di ioduro di propidio e macchiare per cinque minuti. Quindi, rimuovere la soluzione di ioduro di propidio e risciacquare con acqua. Utilizzando forcep fini o un pennello fine, trasferire le sezioni macchiate su vetrini al microscopio.Utilizzare un microscopio a scansione laser confocale con un obiettivo ad immersione in acqua 25x per immaginire i campioni. Utilizzare una luce laser di 561 nanometri per eccitare la fluorescenza dello ioduro propidio e raccogliere emissioni da 570 a 620 nanometri. Utilizzare una luce laser di 405 nanometri per eccitare l'effettore fluoroforo mTurquoise2 codificato dai costrutti della linea del driver e raccogliere emissioni da 425 a 475 nanometri.Per prima cosa, usa le forcep per tagliare lo stelo di due centimetri sotto la punta del germoglio. Tenere il gambo in una mano e utilizzare forcep fini per rimuovere i boccioli di fiori e la grande primordia. Per rimuovere la giovane primordia, fissare il SAM in posizione verticale in una piastra di Petri contenente il tre per cento di agarosio.Quindi, utilizzare un binocolo e le forceps per rimuovere qualsiasi giovane primordia vicino al MAS. Trasferire il MAS sezionato in un tubo contenente una soluzione di 250 microgrammi per millilitro di ioduro di propidio. Lasciare macchiare il campione per cinque o 10 minuti assicurandosi che il campione rimanga completamente sommerso durante la procedura di colorazione.Posizionare il MAS macchiato in una piccola piastra di Petri contenente il tre per cento di mezzo di agarosio. Coprire il MAS con acqua distillata doppia. Utilizzare un microscopio a scansione laser confocale dotato di un obiettivo ad immersione in acqua di immersione 25x per l'immagine dei MAS sezionati.Utilizzare una luce laser di 561 nanometri per eccitare la fluorescenza del ioduro propidio e raccogliere emissioni da 570 a 620 nanometri. Utilizzare una luce laser di 405 nanometri per eccitare il fluoroforo mTurquoise2 e raccogliere emissioni da 425 a 475 nanometri. Registra pile di immagini che si estendono per 50 micrometri nella direzione Z con una dimensione del passo di 0,5 micrometri.L'induzione con DEX porta all'espressione mTurquoise2 specifica di tipo cellulare nell'endodermide della radice, nei precursori del phloem e nel cambium, e nelle cellule staminali nel meristem apicale shoot. Come test case per la trasattivazione, viene generata una linea di effettore che codifica il fattore di trascrizione master della parete cellulare secondaria VND7 fuso al dominio di attivazione V16. Dopo cinque giorni di trattamento singolo con 15 microlitri di DEX o DMSO, le sezioni staminali vengono preparate per la visualizzazione della lignificazione ectopica nella tona iniziale.Le cellule di sheath iniziale nei campioni indotti mostrano un segnale forte per il canale di ioduro propidio e alcune cellule mostrano il tipico ispessimento reticolato della parete cellulare nelle cellule xilemiche. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una chiara comprensione di come indurre l'espressione genica in diversi tessuti e come preparare i tuoi campioni per l'imaging. Seguendo questa procedura, le linee di guida stabilite possono essere utilizzate con un'ampia varietà di costrutti di effettori generati da altri utenti in base ai loro interessi di ricerca.Questa scorciatoia dovrebbe aiutare i ricercatori delle piante a valutare rapidamente l'effetto dell'espressione specifica di tipo cellulare o della abbattimento di un gene di interesse in un modo riservato al tempo. Questo sistema di induzione specifico di tipo cellulare richiede l'uso del desametasone corticosteroideo. Il contatto diretto deve essere evitato, quindi è importante indossare guanti e una maschera facciale durante il trattamento.

Research

JoVE Journal

Genetics

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

The Terroir Concept Interpreted through Grape Berry Metabolomics and Transcriptomics

Il concetto Terroir interpretato attraverso uva a bacca Metabolomica e Trascrittomica

Terroir refers to the combination of environmental factors that affect the characteristics of crops such as grapevine (Vitis vinifera) according to ...

Ricerca

Genetica

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Misura parallela di circadiano Clock espressione genica e la secrezione dell&#39;ormone in colture cellulari primarie umane

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

Unicellulare espressione genica Utilizzando Multiplex RT-qPCR per caratterizzare eterogeneità delle rare popolazioni linfoidi

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Allevamento e RNA a doppio filamento mediata silenziamento genico nel Hide Beetle,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Inducibile T7 RNA Polymerase-mediato sistema di espressione multigene, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Unicellulare profili di espressione genica Utilizzando FACS e qPCR con standard interni

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Controllabile Espressione Ion Canale attraverso inducibile trasfezione transiente

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

Studiare l&#39;espressione del gene regolamentata mediante ciclo cellulare da due protocolli complementari di sincronizzazione delle cellule

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Sistemi costitutive e inducibile per la modificazione genetica In Vivo degli epatociti Mouse usando l'iniezione della vena della coda idrodinamica

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Un metodo di optogenetica per controllare e analizzare il pattern di espressione genica nelle interazioni della cellula--cellula

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...