Name: inducible, cell type-specific expression in arabidopsis thaliana through lhgr-mediated trans-activation
Uploaded: 2019-04-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation at JoVE.com

我々 の研究室での仕事はドイツ研究振興協会 (DFG) によってサポートされている助成金ヲ 1660/6-1 (南西) におよび GR 2104/4-1 (T.G.) と (TG および J.U.L) に SFB1101 と欧州研究評議会によってコンソリ データ付与 (PLANTSTEMS 647148) T.G. 南西は DFG を通じて助成を 1660/2 エミー賞ネーター的な団体を通してサポートされています。

ベクトルおよびモジュールは、非営利のリポジトリでは、Addgene (https://www.addgene.org) から入手できます。
1. GreenGate を使用してクローニング
<ol><li>表1 オーバー ハングを使用して設計プライマー、モジュール型固有のアダプター シーケンス 'NNNN' に置き換える以下: 前方: 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) CA* + 特定のシーケンス 3´ を逆に: 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) + ...

<ol>
	<li>Moore, I., Samalova, M., Kurup, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivated+and+chemically+inducible+gene+expression+in+plants.">Transactivated and chemically inducible gene expression in plants.</a> The Plant Journal. 45 (4), 651-683 (2006).</li><li>Lampropoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GreenGate---a+novel,+versatile,+and+efficient+cloning+system+for+plant+transgenesis.">GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis.</a> PLoS One. 8 (12), e83043 (2013).</li><li>Baroux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictable+activation+of+tissue-specific+expression+from+a+single+gene+locus+using+the+pOp/LhG4+transactivation+system+in+Arabidopsis.">Predictable activation of tissue-specific expression from a single gene locus using the pOp/LhG4 transactivation system in Arabidopsis.</a> Plant Biotechnology Journal. 3 (1), 91-101 (2005).</li><li>Craft, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+pOp/LhG4+vectors+for+stringent+glucocorticoid-dependent+transgene+expression+in+Arabidopsis.">New pOp/LhG4 vectors for stringent glucocorticoid-dependent transgene expression in Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 41 (6), 899-918 (2005).</li><li>Moore, I., Galweiler, L., Grosskopf, D., Schell, J., Palme, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcription+activation+system+for+regulated+gene+expression+in+transgenic+plants.">A transcription activation system for regulated gene expression in transgenic plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (1), 376-381 (1998).</li><li>Samalova, M., Brzobohaty, B., Moore, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pOp6/LhGR:+a+stringently+regulated+and+highly+responsive+dexamethasone-inducible+gene+expression+system+for+tobacco.">pOp6/LhGR: a stringently regulated and highly responsive dexamethasone-inducible gene expression system for tobacco.</a> The Plant Journal. 41 (6), 919-935 (2005).</li><li>Picard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steroid-binding+domains+for+regulating+the+functions+of+heterologous+proteins+in+cis.">Steroid-binding domains for regulating the functions of heterologous proteins in cis.</a> Trends in Cell Biology. 3 (8), 278-280 (1993).</li><li>Schurholz, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comprehensive+Toolkit+for+Inducible,+Cell+Type-Specific+Gene+Expression+in+Arabidopsis.">A Comprehensive Toolkit for Inducible, Cell Type-Specific Gene Expression in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 178 (1), 40-53 (2018).</li><li>Kubo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+switches+for+protoxylem+and+metaxylem+vessel+formation.">Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation.</a> Genes and Development. 19 (16), 1855-1860 (2005).</li><li>Di Laurenzio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SCARECROW+gene+regulates+an+asymmetric+cell+division+that+is+essential+for+generating+the+radial+organization+of+the+Arabidopsis+root.">The SCARECROW gene regulates an asymmetric cell division that is essential for generating the radial organization of the Arabidopsis root.</a> Cell. 86 (3), 423-433 (1996).</li><li>Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+SCARECROW+function+reveals+a+radial+patterning+mechanism+common+to+root+and+shoot.">Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot.</a> Development. 127 (3), 595-603 (2000).</li><li>Hellens, R. P., Edwards, E. A., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pGreen:+a+versatile+and+flexible+binary+Ti+vector+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation.">pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Plant Molecular Biology. 42 (6), 819-832 (2000).</li><li>Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana+using+the+floral+dip+method.">Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method.</a> Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).</li><li>Kleinboelting, N., Huep, G., Kloetgen, A., Viehoever, P., Weisshaar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABI-Kat+SimpleSearch:+new+features+of+the+Arabidopsis+thaliana+T-DNA+mutant+database.">GABI-Kat SimpleSearch: new features of the Arabidopsis thaliana T-DNA mutant database.</a> Nucleic Acids Research. 40 (Database issue), D1211-D1215 (2012).</li><li>. Selection scheme used at GABI-Kat for resistance to sulfadiazine Available from: <a target="_blank" href="https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html">https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html</a> (2018)</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+addition+quantitative+real-time+PCR+(SAQPCR):+a+novel+approach+for+determination+of+transgene+copy+number+avoiding+PCR+efficiency+estimation.">Standard addition quantitative real-time PCR (SAQPCR): a novel approach for determination of transgene copy number avoiding PCR efficiency estimation.</a> PLoS One. 8 (1), e53489 (2013).</li><li>Wallner, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strigolactone-+and+Karrikin-Independent+SMXL+Proteins+Are+Central+Regulators+of+Phloem+Formation.">Strigolactone- and Karrikin-Independent SMXL Proteins Are Central Regulators of Phloem Formation.</a> Current Biology. 27 (8), 1241-1247 (2017).</li><li>Fletcher, J. C., Brand, U., Running, M. P., Simon, R., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+of+cell+fate+decisions+by+CLAVATA3+in+Arabidopsis+shoot+meristems.">Signaling of cell fate decisions by CLAVATA3 in Arabidopsis shoot meristems.</a> Science. 283 (5409), 1911-1914 (1999).</li><li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cellulose+synthases+in+Arabidopsis+secondary+cell+walls.">Visualization of cellulose synthases in Arabidopsis secondary cell walls.</a> Science. 350 (6257), 198-203 (2015).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VASCULAR-RELATED+NAC-DOMAIN6+and+VASCULAR-RELATED+NAC-DOMAIN7+effectively+induce+transdifferentiation+into+xylem+vessel+elements+under+control+of+an+induction+system.">VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN6 and VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN7 effectively induce transdifferentiation into xylem vessel elements under control of an induction system.</a> Plant Physiology. 153 (3), 906-914 (2010).</li><li>Engineer, C. B., Fitzsimmons, K. C., Schmuke, J. J., Dotson, S. B., Kranz, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+a+Gal4-mediated+LUC/GFP/GUS+enhancer+trap+system+in+Arabidopsis.">Development and evaluation of a Gal4-mediated LUC/GFP/GUS enhancer trap system in Arabidopsis.</a> BMC Plant Biology. 5, 9 (2005).</li><li>Aoyama, T., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glucocorticoid-mediated+transcriptional+induction+system+in+transgenic+plants.">A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants.</a> The Plant Journal. 11 (3), 605-612 (1997).</li><li>Decaestecker, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-TSKO+facilitates+efficient+cell+type-,+tissue-,+or+organ-specific+mutagenesis+in+Arabidopsis.">CRISPR-TSKO facilitates efficient cell type-, tissue-, or organ-specific mutagenesis in Arabidopsis.</a> bioRxiv. , (2018).</li></ol>

ここでは、生成および誘導型、セル型特定トランスの汎用性と包括的なツールキットを適用に必要な手順を述べる-活性化。ドライバーの行とポップのプロモーターの制御下でエフェクター カセットを運ぶラインを渡る F1 世代、幅広い種類の細胞で遺伝的摂動の迅速な評価を有効にすることで誤表現効果を勉強できます。また、エフェクターの構造は、ドライバーの行に変換す?...

ポストゲノム時代における生物学の主要な制限は、特定の要因や遺伝的摂動のコンテキストの特定の役割を解読することです。関数の損失と利得の機能のアプローチなど遺伝的摂動構成では、プライマリとセカンダリの効果の違いを難読化、生涯適応プロセスのエンドポイント解析頻繁のみ許可します。さらに、コンテキストの特定の機能をマスクまたは遠い組織または開発の他の段階で大規模な効果によって希釈できます。また、極端な場合、致死することができます任意の機械論的な洞察力を妨げるもの。理想的には、これらの問題を回避するために、時間分解の方法で特定のセル型などの特定のコンテキスト内で急性の遺伝的摂動の効果を分析 1 つ。そのためには、誘導、細胞型特異的発現の遺伝学的ツール、必要な1です。与えられたエフェクターへの応答の時空間ダイナミクスの迅速な評価のため、リソースを提供するために我々 は定める GreenGate システム2 GR LhG4 システム3,の実証済みの有効性とクローン作成の容易さを結合した4,5,6。我々 は、LhG4 はよく特徴付けられる細胞の種類特定のプロモーター8の制御の下でラットのコルチコイド受容体 (GR)7のリガンド結合ドメインに融合キメラ転写因子を表現する行のセットを生成しています。GR ドメインは細胞質 HSP90 に拘束条件を安静時の転写因子の核外ままです。合成リガンド デキサメタゾン (Dex) の追加により、核移行が誘導される LhG4 は式カセット mTurquoise2 記者などの同種合成pOp 型プロモーターの制御下での転写を仲介して誘導後定義式のドメインを視覚化するドライバーの行に含まれます。 したがって、ドライバーの行技術的にまた含まれているエフェクタ カセット。したがって、たとえば、同じpOp 型プロモーターの制御下で興味の遺伝子とエフェクター カセットを運ぶライン ドライバーの行のセットの交差により、エフェクター表現の急性または長期的な結果を迅速に評価幅広い種類の細胞。
ここで、ドライバーとエフェクターの行を生成し、細胞型特異的発現が誘導し、茎頂や根の頂端分裂組織の形成に続いて方法を示して必要な手順を記述したプロトコルを提供します。シロイヌナズナ。力とこの方法の特異性を説明するためによく知られているトランスクリプション要因 VND7 異所萌出へ木部二次細胞壁肥厚を運転することができる利用9。シロイヌナズナの細胞幹デンプン鞘内異所性木部細胞の形成につながるpSCR10,11ドライバー ラインとpOp6:VND7エフェクター ライン間のクロスから F1 を治療します。
ドライバーとエフェクターの発現プラスミドを構築するために必要な大規模な DNA アセンブリの生成を容易にするには、方法2のクローン作成の迅速かつ効率的な GreenGate を使用しました。GreenGate クローニングは2エコ31I やその isoschizomer Bsaなどタイプ II 制限酵素に基づいています。これらの酵素はカット基本組成を変化させてオーバー ハングを生産、不斉認識サイトの下流。エコ31I を組み込むことによって/Bsa私制限サイト オリゴヌクレオチドと DNA 要素に特定の突出部分シーケンスの割り当て、モジュラー クローン作成を実現、大規模なアセンブリの生成を促進します。GreenGate フレームワークで DNA モジュールはアダプターとして機能し、その順序で組み立てられて A ~ F オーバー ハング シーケンスに基づいてカテゴリに分類されます。したがって、ご希望の商品を増幅するプライマーは選択したモジュール2 (図 1 a) に従ってする必要があります。内部エコ31I/Bsa私はサイトとシーケンスは GreenGate エントリと宛先モジュールと互換性がない、mutagenizing、なく低い効率を進むことが。また、サイト指示された突然変異誘発を使用してエコ31I を削除する/Bsa私遺伝子産物中のアミノ酸を変更するように注意して、制限のサイト。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>K029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Column purification</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit (250)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture chamber for imaging</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG</td>
			<td>1-well tissue culture chamber, on cover glass II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>D139-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eco31I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FD0294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>injection cannula (0.30 x 12 mm, 30 G x 1/2)</td>
			<td>Sterican, Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>T832.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO lambda blue 63x water immersion objectiv</td>
			<td>Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS medium</td>
			<td>Duchefa, Haarlem, Netherlands</td>
			<td>M0221.0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x&#160; 1.1 NA water immersion objective</td>
			<td>Nikon, Minato, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35/10 mm</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Germany</td>
			<td>627102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60/150 mm</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Germany</td>
			<td>628102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 120/120/17</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Germany</td>
			<td>688102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant agar</td>
			<td>Duchefa, Haarlem, Netherlands</td>
			<td>P1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid extraction</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide (PI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razorblade</td>
			<td>Classic, Wilkinson Sword GmbH</td>
			<td>7005115E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tubes</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silwet L-77</td>
			<td>Kurt Obermeier GmbH &#38; Co. KG, Bad Berleburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>3834.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NanoDrop 2000c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfadiazine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>2228.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Ligase 5 U/&#181;l</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Ligase 30 U/&#181;l</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EL0013</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducible, cell type-specific expression in arabidopsis thaliana through lhgr-mediated trans-activation

誘導、組織固有の式は遺伝的摂動の時空間的ダイナミクスを研究するための重要かつ強力なツールです。エフェクターの式をドライブすることができます形質転換シロイヌナズナ行セットを生成しているクローン作成実績とベンチマークを行った LhGR システム (ここでは GR LhG4 と呼ばれる) 誘導式の柔軟かつ効率的な GreenGate 組み合わせることで、3 つの主要な植物の分裂で特定の細胞型の範囲でのカセット。このため、我々 はキメラ転写因子と表現のレベルの広い範囲にわたってタイトなコントロールを確保する同種pOp 型プロモーターに基づいて開発済みの GR LhG4 システムを選んだ。さらに、合成転写因子がアクティブ式ドメインを視覚化するpOp4 または pOp6プロモーターの制御下で ER ローカライズ mTurquoise2 蛍光レポーターはドライバーの行でエンコードされます。ここでは、ドライバーまたはエフェクター ラインを生成し、細胞型特異的発現の誘導および茎頂、根の頂端分裂組織とシロイヌナズナのひこばえに続いてできる方法を示すに必要な手順について述べる。使用するには、いくつかまたはすべてのドライバー ライン、1 つのコンテキスト特定効果かポップ合成プロモーターの制御下で複数の要因 (エフェクター) を 1 つのエフェクターと複数間のクロスの F1 植物で急速に、たとえば評価できます。ドライバーの行。このアプローチは、VND7、細胞自律的に異所性の二次細胞壁形成を誘導することができる NAC 転写因子の異所性発現によって例証されます。

GreenGate クローニングを介してドライバーとエフェクターの行の世代
クローニング システム GreenGate、GoldenGate のクローニングとBsaタイプ IIS の制限の endonuclease の使用に基づいて私またはその isoschizomerエコ31I。その不斉認識のサイトでオーバー ハングの基本組成から遠い酵素生成張り出しが自由にすることができます選択すると、基礎となるシ?...

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Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

誘導、細胞型における発現シロイヌナズナLhGR を介したトランス-活性化

ここでは、我々 は生成を記述して形質転換シロイヌナズナのセットのアプリケーション線 3 主な分裂、茎頂や根の頂端分裂組織形成層で有効にする、組織固有の誘導式です。

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

発生生物学の主な目標は、遺伝子の文脈固有の役割を理解することです。そして、これは従来のノックアウト突然変異体によって、または構成的な過剰発現線によって達成することは困難であり得る。モジュラーグリーンゲートクローニングシステムを用いて、モデル植物シロイヌナズナの3つの主要なメリステムに誘導可能な細胞特異的発現のためのリソースを生成しました。同じモジュラークローニング戦略を使用して、この方法は、変換に不変である他の植物種に適用することができます。この手順の視覚的なデモンストレーションは、ステムと短い頂点のメリステムにおけるトランス活性化の効果を分析するには、イメージング前に解剖が必要であり、非常に困難であるため、貴重です。まず、テキストプロトコルで概説されているように種子を殺菌します。次に、pH 5.8で半強度のムラシゲとスクーグ培地を準備し、1%のスクロースと0.9%寒天を加えます。オートクレーブ処理後、DMSOに溶解したDexを誘導プレートに10~30マイクロモルの最終濃度で加えます。コントロールプレートに同量のDMSOを追加します。皿の上に根イメージングのための種子を置き、暗闇の中で48時間、摂氏4度でそれらを層化します。プレートを植物のインキュベーターの垂直位置に入れ、5日間成長させます。発芽の5日後、共焦点レーザー走査顕微鏡を使用して苗を画像化します。まず、テキスト プロトコルで説明されているようにシードを準備し、拡大します。発芽後6~7日後、各苗を別々の鍋に移します。水を入れ、植物を誘導する場合は、25ミクロモルDEX溶液を水中に使用し、エタノールに溶解した25ミリモルDEXのストックから調製した。2~3日ごとに水が誘導の所望の時間まで。浸漬によって誘導する場合は、25マイクロモル最終濃度またはDEXと模擬処理のためのDMSOの同等量で0.02%シルウェットL77とDEXを含む水の750ミリリットルで1リットルビーカーを調製します。1つの植物を誘導または模擬溶液に30秒間浸します。2~3日ごとに、望ましい撮影時間まで繰り返します。まず、テキスト プロトコルで説明されているようにシードを準備し、拡大します。発芽後6~7日後、各苗を別々の鍋に移します。茎の長さ約1センチメートルの場合、水中に10〜50マイクロモルDEX溶液を使用して蛍光SAMをスプレーします。開発の後期段階での誘導およびイメージングのために、より長い茎または側面の芽のSAMを誘導する。誘導後24~48時間、SAMを解剖し、イメージングに進みます。まず、ウオジジウムプロピジウムのミリレター溶液あたり10マイクログラムにプレートから苗を移し、それらを5分間対抗します。根を顕微鏡イメージングチャンバーに入れ、63倍の水浸し目的を持つ共焦点レーザー走査顕微鏡を使用して画像化します。ヨウ化プロピジウム蛍光を可視化するには、励起波長488ナノメートルを使用し、590~660ナノメートルの発光を収集します。mTurquoise2蛍光の場合は、458ナノメートルの励起を使用し、順次スキャンを使用して460〜615ナノメートルの間の放出を収集します。まず、目的のセクションの反対側に指でステムを固定します。カミソリの刃を使用して、約3センチメートルのセグメントをカットし、いくつかの細かいカットを実行します。水道水を含むペトリ皿にカミソリの刃をすすいで、茎のセクションを収集します。セクションを汚すか、顕微鏡スライドに直接取り付けます。染色のために、反応管にヨウ化プロピジウムの1ミリリットル溶液あたり250マイクログラムの1ミリリットルを調製する。ペトリ皿から水道水をピペットで取り出し、ヨウ化プロピジウム溶液と5分間汚れに置き換えます。次にヨウ化プロピジウム溶液を取り出し、水ですすいでください。細かい鉗子か細かい絵筆を使用して、顕微鏡のスライドに染色された切片を移す。25x浸漬レンズを備えた共焦点レーザー走査顕微鏡を使用して、サンプルを画像化します。561ナノメートルのレーザー光を使用して、ヨウ化プロピジウム蛍光を励起し、570〜620ナノメートルの発光を収集します。405ナノメートルのレーザー光を使用して、ドライバーライン構築物でコードされたmTurquoise2フルオロフォアエフェクターを励起し、425〜475ナノメートルの放出を収集します。まず、鉗子を使用して、シュートチップの2センチメートル下の茎を切断します。片手で茎を保持し、花の芽と大きなプリモディアを除去するために細かい鉗子を使用しています。若いプリモリアを取り除くために、3%のアガロースを含むペトリ皿の直立した位置にSAMを固定します。次に、双眼鏡と鉗子を使用して、SAMに近い若いプリモディアを取り除く。解剖したSAMをヨウ化プロピジウムの1ミリリットル溶液あたり250マイクログラムを含むチューブに移す。染色手順中にサンプルが完全に水没していることを確認しながら、サンプルを5〜10分間染色します。染色したSAMを3%のアガロース培地を含む小さなペトリ皿に入れます。SAMを二重蒸留水で覆います。25x浸漬レンズを搭載した共焦点レーザー顕微鏡を使用して、解剖されたSAMを画像化します。561ナノメートルのレーザー光を使用して、ヨウ化プロピジウム蛍光を励起し、570〜620ナノメートルの排出量を収集します。405ナノメートルのレーザー光を使用して、mTurquoise2フルオロフォアを励起し、425〜475ナノメートルの発光を収集します。Z方向に50マイクロメートルに及ぶ画像スタックを、0.5マイクロメートルのステップサイズで記録します。DEXによる誘導は、細胞型特異的mTurquoise2発現を、葉膜前駆体およびカンビウムの根内皮および、そして、シュートの中の幹細胞に由来する。トランスアクチベートの試験事例として、V16活性化ドメインに融合した第二細胞壁マスター転写因子VND7をコードするエフェクターラインが生成される。DEXまたはDMSOの15マイクロリットルで5日間の単一処理の後、ステム切片は開始シースにおける異所性批准の視覚化のために調製される。誘導サンプル中の開始シース細胞は、ヨウ化プロピジウムチャネルに対する強いシグナルを示し、いくつかの細胞は、キシレム細胞における細胞壁の典型的な網状肥厚を示す。このビデオを見た後、あなたは異なる組織で遺伝子発現を誘導する方法とイメージングのためにあなたのサンプルを準備する方法を明確に理解する必要があります。この手順に従って、確立されたドライバラインは、研究の関心に応じて他のユーザーによって生成された多種多様なエフェクター構造で使用することができます。このショートカットは、植物研究者が細胞型特異的発現または関心遺伝子のノックダウンの効果を時間予約された方法で迅速に評価するのに役立つはずです。この細胞型特異的誘導系は、コルチコステロイドデキサメタゾンの使用を必要とする。直接接触は避けるべきなので、治療中は手袋とフェイスマスクを着用することが重要です。

Research

JoVE Journal

Genetics

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

The Terroir Concept Interpreted through Grape Berry Metabolomics and Transcriptomics

グレープベリーメタボロミクスとトランスクリプトを通して解釈テロワールコンセプト

Terroir refers to the combination of environmental factors that affect the characteristics of crops such as grapevine (Vitis vinifera) according to ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

ヒト初代細胞培養物における概日時計遺伝子発現やホルモン分泌のパラレル測定

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

レアリンパ集団の不均一性を特徴づけるためにマルチプレックスRT-qPCRのを使用した単一細胞の遺伝子発現

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

隠すビートルにノックダウン飼育し、二本鎖RNA媒介遺伝子、<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

誘導性T7 RNAポリメラーゼ媒介マルチ遺伝子発現システム、pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

内部標準でFACSおよび定量PCRを用いた単一細胞遺伝子発現プロファイリング

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

誘導性一過性トランスフェクションを介して制御可能なイオンチャネルの発現

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

2つの相補的細胞同期プロトコルによる細胞周期制御遺伝子発現の研究

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

流体の尾静脈注射を使用してマウス肝細胞の生体内で遺伝的変更の構成および誘導システム

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

制御、細胞間相互作用における遺伝子発現パターンを分析して光遺伝学的方法

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...