Name: inducible, cell type-specific expression in arabidopsis thaliana through lhgr-mediated trans-activation
Uploaded: 2019-04-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation at JoVE.com

우리의 실험실에 일은 독일 연구 재단 (DFG)에 의해 지원 보조금 WO 1660/6-1 (남서) 및 GR 2104/4-1 (T.G.) 및 SFB1101 (T.G. J.U.L)를 통합 유럽 연구 위원회에 의해 T.G.를 (PLANTSTEMS 647148)를 부여  남서는 그랜트 WO 1660/2 통해 DFG의에 미 뇌터 교제를 통해 지원 됩니다.

벡터 및 모듈 비영리 저장소, Addgene (https://www.addgene.org)에서 얻을 수 있습니다.
1. 복제 GreenGate를 사용 하 여
<ol><li>표 1에 나열 된 돌출부를 사용 하 여 디자인 뇌관, 아래 모듈 타입 전용 어댑터 시퀀스 'NNNN' 교체: 앞으로: 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) CA* + 특정 시퀀스 3´, 반전: 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) + 역 특정 시퀀스 3´ 보완 독서 프레임의 유지 보수를 보장 하?...

<ol>
	<li>Moore, I., Samalova, M., Kurup, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivated+and+chemically+inducible+gene+expression+in+plants.">Transactivated and chemically inducible gene expression in plants.</a> The Plant Journal. 45 (4), 651-683 (2006).</li><li>Lampropoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GreenGate---a+novel,+versatile,+and+efficient+cloning+system+for+plant+transgenesis.">GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis.</a> PLoS One. 8 (12), e83043 (2013).</li><li>Baroux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictable+activation+of+tissue-specific+expression+from+a+single+gene+locus+using+the+pOp/LhG4+transactivation+system+in+Arabidopsis.">Predictable activation of tissue-specific expression from a single gene locus using the pOp/LhG4 transactivation system in Arabidopsis.</a> Plant Biotechnology Journal. 3 (1), 91-101 (2005).</li><li>Craft, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+pOp/LhG4+vectors+for+stringent+glucocorticoid-dependent+transgene+expression+in+Arabidopsis.">New pOp/LhG4 vectors for stringent glucocorticoid-dependent transgene expression in Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 41 (6), 899-918 (2005).</li><li>Moore, I., Galweiler, L., Grosskopf, D., Schell, J., Palme, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcription+activation+system+for+regulated+gene+expression+in+transgenic+plants.">A transcription activation system for regulated gene expression in transgenic plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (1), 376-381 (1998).</li><li>Samalova, M., Brzobohaty, B., Moore, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pOp6/LhGR:+a+stringently+regulated+and+highly+responsive+dexamethasone-inducible+gene+expression+system+for+tobacco.">pOp6/LhGR: a stringently regulated and highly responsive dexamethasone-inducible gene expression system for tobacco.</a> The Plant Journal. 41 (6), 919-935 (2005).</li><li>Picard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steroid-binding+domains+for+regulating+the+functions+of+heterologous+proteins+in+cis.">Steroid-binding domains for regulating the functions of heterologous proteins in cis.</a> Trends in Cell Biology. 3 (8), 278-280 (1993).</li><li>Schurholz, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comprehensive+Toolkit+for+Inducible,+Cell+Type-Specific+Gene+Expression+in+Arabidopsis.">A Comprehensive Toolkit for Inducible, Cell Type-Specific Gene Expression in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 178 (1), 40-53 (2018).</li><li>Kubo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+switches+for+protoxylem+and+metaxylem+vessel+formation.">Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation.</a> Genes and Development. 19 (16), 1855-1860 (2005).</li><li>Di Laurenzio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SCARECROW+gene+regulates+an+asymmetric+cell+division+that+is+essential+for+generating+the+radial+organization+of+the+Arabidopsis+root.">The SCARECROW gene regulates an asymmetric cell division that is essential for generating the radial organization of the Arabidopsis root.</a> Cell. 86 (3), 423-433 (1996).</li><li>Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+SCARECROW+function+reveals+a+radial+patterning+mechanism+common+to+root+and+shoot.">Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot.</a> Development. 127 (3), 595-603 (2000).</li><li>Hellens, R. P., Edwards, E. A., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pGreen:+a+versatile+and+flexible+binary+Ti+vector+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation.">pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Plant Molecular Biology. 42 (6), 819-832 (2000).</li><li>Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana+using+the+floral+dip+method.">Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method.</a> Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).</li><li>Kleinboelting, N., Huep, G., Kloetgen, A., Viehoever, P., Weisshaar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABI-Kat+SimpleSearch:+new+features+of+the+Arabidopsis+thaliana+T-DNA+mutant+database.">GABI-Kat SimpleSearch: new features of the Arabidopsis thaliana T-DNA mutant database.</a> Nucleic Acids Research. 40 (Database issue), D1211-D1215 (2012).</li><li>. Selection scheme used at GABI-Kat for resistance to sulfadiazine Available from: <a target="_blank" href="https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html">https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html</a> (2018)</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+addition+quantitative+real-time+PCR+(SAQPCR):+a+novel+approach+for+determination+of+transgene+copy+number+avoiding+PCR+efficiency+estimation.">Standard addition quantitative real-time PCR (SAQPCR): a novel approach for determination of transgene copy number avoiding PCR efficiency estimation.</a> PLoS One. 8 (1), e53489 (2013).</li><li>Wallner, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strigolactone-+and+Karrikin-Independent+SMXL+Proteins+Are+Central+Regulators+of+Phloem+Formation.">Strigolactone- and Karrikin-Independent SMXL Proteins Are Central Regulators of Phloem Formation.</a> Current Biology. 27 (8), 1241-1247 (2017).</li><li>Fletcher, J. C., Brand, U., Running, M. P., Simon, R., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+of+cell+fate+decisions+by+CLAVATA3+in+Arabidopsis+shoot+meristems.">Signaling of cell fate decisions by CLAVATA3 in Arabidopsis shoot meristems.</a> Science. 283 (5409), 1911-1914 (1999).</li><li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cellulose+synthases+in+Arabidopsis+secondary+cell+walls.">Visualization of cellulose synthases in Arabidopsis secondary cell walls.</a> Science. 350 (6257), 198-203 (2015).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VASCULAR-RELATED+NAC-DOMAIN6+and+VASCULAR-RELATED+NAC-DOMAIN7+effectively+induce+transdifferentiation+into+xylem+vessel+elements+under+control+of+an+induction+system.">VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN6 and VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN7 effectively induce transdifferentiation into xylem vessel elements under control of an induction system.</a> Plant Physiology. 153 (3), 906-914 (2010).</li><li>Engineer, C. B., Fitzsimmons, K. C., Schmuke, J. J., Dotson, S. B., Kranz, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+a+Gal4-mediated+LUC/GFP/GUS+enhancer+trap+system+in+Arabidopsis.">Development and evaluation of a Gal4-mediated LUC/GFP/GUS enhancer trap system in Arabidopsis.</a> BMC Plant Biology. 5, 9 (2005).</li><li>Aoyama, T., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glucocorticoid-mediated+transcriptional+induction+system+in+transgenic+plants.">A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants.</a> The Plant Journal. 11 (3), 605-612 (1997).</li><li>Decaestecker, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-TSKO+facilitates+efficient+cell+type-,+tissue-,+or+organ-specific+mutagenesis+in+Arabidopsis.">CRISPR-TSKO facilitates efficient cell type-, tissue-, or organ-specific mutagenesis in Arabidopsis.</a> bioRxiv. , (2018).</li></ol>

여기, 우리는 생성 하 고 유도할 수 있는, 세포 유형 특정 트랜스에 대 한 다양 하 고 포괄적인 툴킷 적용 하는 데 필요한 단계를 설명-활성화. 드라이버 라인 팝 발기인의 통제 이펙터 카세트를 들고 경계선을 넘어 다양 한 셀 형식에에서 유전 섭 동의 급속 한 평가 활성화 F1 세대에 잘못 표현 효과 연구 수 있습니다. 또는, 이펙터 구문을 변환 드라이버 라인을 사용할 수 있습니다 또?...

Postgenomic 시대에 생물학에서 주요 한계는 주어진된 요소 또는 유전 섭 동의 컨텍스트 특정 역할을 해독 이다. 기능 손실 및 이득의 기능 접근 등 제정 유전 섭 종종 평생 적응 프로세스, 기본 및 보조 효과 사이 구별을 난독 처리 끝점 분석 허용. 또한, 컨텍스트 특정 기능 마스크 수 또는 먼 조직에 또는 개발의 다른 단계 동안 대규모 효과 의해 희석. 또한, 극단적인 경우에 치 사 율 어떤 기계적 통찰력을 배제 수 있습니다. 이상적으로, 이러한 문제를 회피 한 수 분석 특정 셀 형식과 같은 특정 컨텍스트 내에서 급성 유전 섭 동 효과 시간 해결 방식. 이를 위해, 유도할 수 있는, 세포 유형 특정 식에 대 한 유전 도구 필요1있습니다. 주어진된 이펙터에 대 한 응답의 spatiotemporal 역학의 급속 한 평가 대 한 리소스를 제공 하 우리는 GR LhG4 시스템3, 의 검증 된 효능 함께 GreenGate 시스템2 에서 제공 하는 복제의 용이성을 결합 4,,56. 우리 잘 특징이 셀 유형 특정 발기인8의 통제 쥐 corticoid 수용 체 (GR)7 의 ligand 바인딩 도메인에 융합 LhG4 공상 전사 요소를 표현 하는 라인의 집합 생성. 조건, 휴식에서 녹음 방송 요인 남아 있다 핵, 외부 GR 도메인 cytosolic HSP90 바인딩됩니다. 더불어 합성 리간드 dexamethasone (덱 스), 핵 전 좌 유도 및 LhG4 mTurquoise2 기자 같은 동족 합성 팝업 형 모터의 통제 식 카세트의 녹음을 중재할 것 이다 유도 후 식 도메인을 시각화 하기 위해 드라이버 라인에 포함.  따라서, 드라이버 라인 기술적으로 또한 포함 한 이펙터 카세트. 따라서, 예를 들어 같은 팝업 형 모터의 통제 관심사의 유전자와 이펙터 카세트를 들고 라인 드라이버 집합의 교차점 허용 이펙터 식의 급성 또는 장기 결과의 급속 한 평가 세포 유형의 다양 한 range.
여기, 우리는 드라이버와 이펙터 라인을 생성 하 고 셀 형식 특정 식을 유도 하 고 촬영 정점 분열 조직, 뿌리 정점 분열 조직에의 레이어의 다음 수 어떻게 설명 하는 데 필요한 절차를 설명 하는 프로토콜 제공 애기입니다. 노하우와이 방법의 특이성을 설명 하기 위해 잘 알려진 전사 인자 VND7 xylem 같은 2 차 세포 벽 thickenings ectopically 운전 수 있는 활용9. 전 칼 집 애기 의 셀 줄기에서 소성 xylem 같은 세포의 형성에 이르게 pSCR10,11 드라이버 선 및 pOp6:VND7 이펙터 선 사이 십자가에서 f 1을 치료.
드라이버 및 이펙터 식 플라스 미드를 구축에 필요한 큰 DNA 어셈블리의 생성을 촉진 하기 위하여 우리는 신속 하 고 효율적인 GreenGate 복제 방법2를 사용 합니다. GreenGate 복제 기반 에코31I 등의 isoschizomer Bsa유형 II S 제한 효소 나2. 이 효소 그들의 비대칭 인식 사이트 기본 구성 변화와 돌출부를 생산의 다운스트림 잘라. 에코31I 통합 /Bsa나 oligonucleotides에 제한 사이트 및 DNA 요소에 특정 오버행 시퀀스 할당, 모듈 복제 달성, 대형 어셈블리의 생성을 촉진. GreenGate 프레임 워크에서 DNA 모듈 어댑터 역할을 하 고 그 순서 대로 조립 오버행 시퀀스를 기반으로 하는 A F 범주로을. 따라서, 원하는 제품을 증폭 위한 뇌관 선택된 모듈2 (그림 1A) 되어야 합니다. 경우는 내부 에코31I /Bsa사이트 및 시퀀스 GreenGate 항목 및 대상 모듈와 호환 되지 않습니다, mutagenizing, 없이 그러나 낮은 효율성으로 진행할 수 있습니다. 또는, 사이트 지시 된 mutagenesis 에코31I 제거를 사용 하 여 /Bsa나 유전자 제품에서 아미노산을 변경 하지 않도록 주의 복용 금지 사이트.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>K029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Column purification</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit (250)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture chamber for imaging</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG</td>
			<td>1-well tissue culture chamber, on cover glass II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>D139-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eco31I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FD0294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>injection cannula (0.30 x 12 mm, 30 G x 1/2)</td>
			<td>Sterican, Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>T832.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO lambda blue 63x water immersion objectiv</td>
			<td>Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS medium</td>
			<td>Duchefa, Haarlem, Netherlands</td>
			<td>M0221.0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x&#160; 1.1 NA water immersion objective</td>
			<td>Nikon, Minato, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35/10 mm</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Germany</td>
			<td>627102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60/150 mm</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Germany</td>
			<td>628102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 120/120/17</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Germany</td>
			<td>688102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant agar</td>
			<td>Duchefa, Haarlem, Netherlands</td>
			<td>P1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid extraction</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide (PI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razorblade</td>
			<td>Classic, Wilkinson Sword GmbH</td>
			<td>7005115E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tubes</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silwet L-77</td>
			<td>Kurt Obermeier GmbH &#38; Co. KG, Bad Berleburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>3834.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NanoDrop 2000c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfadiazine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>2228.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Ligase 5 U/&#181;l</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Ligase 30 U/&#181;l</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EL0013</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducible, cell type-specific expression in arabidopsis thaliana through lhgr-mediated trans-activation

유도할 수 있는, 조직-특정 식은 유전 섭 동 spatio 시간적 역학을 공부 하는 중요 하 고 강력한 도구입니다. 입증 하 고 벤치마킹 LhGR 시스템 (여기 GR LhG4에 게 불리는) 유도할 수 있는 식에 대 한 시스템을 복제 하는 유연 하 고 효율적인 GreenGate 결합, 우리 생성 집합 유전자 변형 애기는 이펙터의 식을 구동할 수 있습니다. 3 주요 식물 meristems에서 특정 세포 유형의 범위에서 카세트. 이 위해, 우리는 공상 전사 인자와 다양 한 식 수준 이상 꽉 컨트롤을 보장 동족 팝업 형 발기인에 따라 이전 개발 된 GR LhG4 시스템을 선택 했다. 또한, 합성 전사 인자 활성 식 도메인을 시각화 하려면 pOp4 또는 pOp6 발기인의 통제는 응급실 지역화 mTurquoise2 형광 기자는 드라이버 라인에 인코딩됩니다. 여기, 우리는 드라이버 또는 이펙터 라인을 생성 하 고 셀 형식 특정 식을 유도 하 고 촬영 정점 분열 조직 뿌리 정점 분열 조직, 애기의 레이어의 다음 수 어떻게 설명 하는 데 필요한 단계를 설명 합니다. 사용 하 여 여러 개 또는 모든 드라이버 라인, 하나 표현 컨텍스트 특정 효과 또는 다중 요인 (이펙터) 합성 팝 발기인의 통제 평가 될 수 있다, 예를 들어 한 이펙터 및 다중 사이 십자가의 F1 식물에 드라이버 라인입니다. 이 접근은 VND7, 셀 자율적인 방식으로 소성 2 차 세포 벽 증 착을 유도 할 수 NAC 녹음 방송 요인의 소성 식으로 궁 행.

GreenGate 복제를 통해 드라이버와 이펙터 라인의 세대
GoldenGate 복제 및 사용 유형 IIS 금지 endonuclease Bsa를 기반으로 하는 시스템을 복제 하는 GreenGate 나 또는 그것의 isoschizomer 에코31I. 효소 생산 돌출부 먼 비대칭 인식 사이트는 돌출부의 기본 구성에서 자유롭게 될 수 있는 선택, 기초 시스템의 모듈화를 형성 한다. 각 PCR 생성 요소, 예를 들어: 발기인 ?...

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Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

유도할 수 있는, 애기 thaliana 통해 LhGR 중재 트랜스에 셀 형식 관련 식-활성화

여기, 우리 세대를 설명 하 고 유전자 변형 애기 thaliana 의 집합의 응용 프로그램 세 가지 주요 meristems, 싹 정점 분열 조직, 뿌리 정점 분열 조직에는 레이어의 활성화 유도할 수 있는, 조직 관련 식 라인.

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

발달 생물학의 주요 목표는 유전자의 문맥 특정 역할을 이해하는 것입니다. 그리고 이것은 기존의 녹아웃 돌연변이체 또는 구성 과발현 라인에 의해 달성하기 어려울 수 있습니다. 모듈식 그린 게이트 복제 시스템을 사용하여 모델 식물 인 Arabidopsis thaliana의 세 가지 주요 메리스템에서 유도 할 수없는 사이토 별 발현에 대한 자원을 생성했습니다.동일한 모듈식 복제 전략을 사용하여 변환이 불가능한 다른 식물 종에 적용할 수 있습니다. 이 절차의 시각적 데모는 줄기의 머리스템에서 의 트랜스 활성화의 효과를 분석하고 짧은 정점은 매우 어려울 수있는 이미징 전에 해부를 필요로하기 때문에 가치가있다. 먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 씨앗을 소독합니다.다음으로, pH 5.8에서 반강도 무라시게와 스쿠오 그 매체를 준비하고 1% 자당과 0.9%의 한천을 추가합니다. 오토클레이브 후, DMSO에 용해된 덱스를 10~30마이크로몰러 사이의 최종 농도로 유도 플레이트에 첨가한다. 컨트롤 플레이트에 동일한 양의 DMSO를 추가합니다.접시에 뿌리 이미징씨앗을 넣고 어둠 속에서 48시간 동안, 섭씨 4도에 계층화하십시오. 플레이트를 식물 인큐베이터에 수직으로 배치하고 5일 동안 자랍니다. 발아 후 5 일, 모종을 이미지하는 공초점 레이저 스캐닝 현미경 을 사용합니다.먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 씨앗을 준비하고 성장합니다. 발아 후 6~7일 후에 각 묘목을 별도의 냄비에 토양으로 옮기습니다. 물을 유도하여 식물을 유도하는 경우, 물에 25 마이크로 몰러 DEX 용액을 사용하여 에탄올에 용해 된 25 밀리머 DEX의 재고로부터 제조하십시오.유도의 원하는 시간까지 2 ~ 3 일마다 물을. 담그음으로써 유도하는 경우, DEX 및 모의 처리를 위해 25 마이크로몰라 최종 농도 또는 상응하는 양의 DMSO에서 0.02%의 실웨트 L77 및 DEX를 함유한 750밀리리터의 물로 1리터 비커를 준비한다. 단일 식물을 유도 또는 모의 용액에 30초 간 담급넣습니다.이미징의 원하는 시간까지 2~3일마다 반복합니다. 먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 씨앗을 준비하고 성장합니다. 발아 후 6~7일 후에 각 묘목을 별도의 냄비에 토양으로 옮기습니다.줄기가 약 1센티미터 길이일 때, 물에 10~50마이크로몰러 DEX 용액을 가진 불성 SAM을 분사하십시오. 개발의 후반 단계에서 유도 및 이미징을 위해, 더 긴 줄기 또는 측면 촬영의 SAM을 유도. 유도 후 24~48시간 후, SAM을 해부하고 이미징을 진행합니다.먼저, 모종을 소당에서 밀리리터 용액당 10 마이크로그램으로 옮기고 5분 동안 이를 반소합니다. 뿌리를 현미경 이미징 챔버에 넣고 63 배 의 물 침수 목표를 가진 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 이미지를 배치합니다. 공증요오드 형광을 시각화하려면 488 나노미터의 발산 파장을 사용하고 590~660나노미터 사이의 방출을 수집합니다.mTurquoise2 형광의 경우 458 나노미터 흥분을 사용하고 순차적 스캐닝을 사용하여 460~615나노미터 사이의 배출을 수집합니다. 먼저 원하는 섹션의 반대편에 손가락으로 줄기를 고정합니다. 면도날을 사용하여 약 3센티미터의 세그먼트를 자르고 여러 개의 미세 컷을 수행합니다.수돗물이 들어 있는 페트리 접시에 면도날을 헹구고 줄기 부분을 수집합니다. 섹션을 얼룩지게하거나 현미경 슬라이드에 직접 장착하십시오. 염색을 위해 반응 튜브에 프로피듐 요오드의 밀리리터 용액 당 250 마이크로그램의 1 밀리리터를 준비하십시오.페트리 접시에서 수돗물을 파이펫으로 제거하고 프로피듐 요오드 용액으로 교체하고 5 분 동안 얼룩을 대체하십시오. 그런 다음, 프로피듐 요오드 용액을 제거하고 물로 헹구는 다. 미세 한 집게 또는 미세 한 페인트 브러시를 사용 하 여, 현미경 슬라이드에 스테인드 섹션을 전송.25배 의 침수 렌즈가 있는 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 샘플을 이미지화합니다. 561 나노미터 레이저 광을 사용하여 프로피듐 요오드 형광을 자극하고 570 ~ 620 나노미터에서 배출을 수집합니다. 405 나노미터 레이저 광을 사용하여 드라이버 라인 구조에 의해 인코딩된 mTurquoise2 플루오로포레 이펙터를 자극하고 425~475나노미터의 배출을 수집합니다.먼저 집게를 사용하여 촬영 팁 아래 줄기를 2센티미터 줄입니다. 한 손에 줄기를 잡고 꽃 싹과 큰 원시를 제거하기 위해 미세 한 집게를 사용합니다. 젊은 원시를 제거하려면 3 %의 아가로즈가 들어있는 페트리 접시에서 SAM을 똑바로 세워 놓습니다.다음으로 쌍안경과 집게를 사용하여 SAM에 가까운 어린 원시인을 제거하십시오. 해부된 SAM을 프로피듐 요오드의 밀리리터 용액당 250 마이크로그램을 포함하는 튜브로 옮기다. 샘플이 염색 절차 중에 완전히 침수되었는지 확인하면서 5~10분 동안 샘플을 염색하게 합니다.스테인드 SAM을 아가로즈 3%가 함유한 작은 페트리 접시에 넣습니다. 이중 증류수로 SAM을 덮습니다. 25배 침수 렌즈가 장착된 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 해부된 SAM을 이미지화하십시오.561 나노미터 레이저 광을 사용하여 프로피듐 요오드 형광을 자극하고 570 ~ 620 나노미터에서 배출을 수집합니다. 405 나노미터 레이저 광을 사용하여 mTurquoise2 형광을 자극하고 425 ~ 475 나노미터에서 배출을 수집합니다. 0.5 마이크로미터의 스텝 크기로 Z 방향으로 50 마이크로미터에 걸쳐 이미지 스택을 기록합니다.DEX를 통한 유도는 세포형 특이적 mTurquoise2 발현을 뿌리 내분신내막내막과 캄비움, 및 촬영 에 있는 줄기세포로 이끈다. 트랜스활성화를 위한 테스트 사례로서, V16 활성화 도메인에 융합된 이차 세포벽 마스터 전사 인자 VND7을 인코딩하는 이펙터 라인이 생성된다. DEX 또는 DMSO의 15 마이크로리터를 가진 5일간의 단일 처리 후에, 줄기 단면도는 시작 칼집에 있는 자궁 화합의 시각화를 위해 준비됩니다.유도된 견본에 있는 개시 칼집 세포는 propidium 요오드 채널에 대한 강한 신호를 보여주고 몇몇 세포는 자일렘 세포에 있는 세포벽의 전형적인 망상 두껍게 하는 것을 보여줍니다. 이 비디오를 시청한 후에는 다른 조직에서 유전자 발현을 유도하는 방법과 이미징을 위해 샘플을 준비하는 방법에 대한 명확한 이해가 있어야 합니다. 이 절차에 따라, 확립 된 드라이버 라인은 자신의 연구 관심사에 따라 다른 사용자가 생성 한 다양한 이펙터 구성과 함께 사용할 수 있습니다.이 바로 가기는 식물 연구원이 세포 모형 특정 발현 또는 시간 예약된 방식으로 관심있는 유전자의 녹다운의 효력을 급속하게 평가하는 것을 도울 것입니다. 이 세포 형 특정 유도 시스템은 코르티코 스테로이드 덱사메타손의 사용을 필요로한다. 직접 접촉은 피해야하므로 치료 중에 장갑과 얼굴 마스크를 착용하는 것이 중요합니다.

Research

JoVE Journal

Genetics

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

The Terroir Concept Interpreted through Grape Berry Metabolomics and Transcriptomics

포도 베리 대사 체학 및 Transcriptomics을 통해 해석 떼루아 개념

Terroir refers to the combination of environmental factors that affect the characteristics of crops such as grapevine (Vitis vinifera) according to ...

연구

유전학

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

인간의 기본 세포 배양의 일주기 시계 유전자 발현 및 호르몬 분비의 병렬 측정

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

멀티 플렉스 RT-qPCR에 사용 단일 세포 유전자 발현은 희귀 림프 인구의 이질성의 특성을

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

양육 및 숨기기 비틀에 RNA 매개 유전자 최저를 두 번 좌초,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

유도 성 T7 RNA 중합 효소 매개 멀티젠 발현 시스템, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

내부 기준에 FACS 및 qPCR에 사용 단일 세포 유전자 발현 프로파일 링

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

유도 성 과도 형질을 통해 제어 이온 채널 식

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

두 개의 상보적인 세포 동기화 프로토콜에 의한 세포주기 조절 유전자 발굴 연구

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

유체역학 꼬리 정 맥 주입을 사용 하 여 마우스 Hepatocytes의 유전 Vivo에서 수정에 대 한 제정 및 유도할 수 있는 시스템

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

제어 하 고 셀 상호 작용에서 유전자 표현 패턴을 분석 하는 Optogenetic 메서드

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...