Name: inducible, cell type-specific expression in arabidopsis thaliana through lhgr-mediated trans-activation
Uploaded: 2019-04-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation at JoVE.com

Arbeid i våre laboratorier støttes av tysk Research Foundation (DFG) tilskudd WO 1660/6-1 (til S.W.) og GR 2104/4-1 (til TG) og SFB1101 (til TG og J.U.L) og en europeisk forskningsråd consolidator gir (PLANTSTEMS 647148) til TG  S.W. støttes gjennom Emmy Noether fellesskap av DFG gjennom Grant WO 1660/2.

Vektorer og moduler kan fås fra non-profit depotet, Addgene (https://www.addgene.org).
1. kloning bruker GreenGate
<ol><li>Design primere med overheng oppført i tabell 1, erstatte 'NNNN' med modulen spesifikk adapter sekvenser nedenfor: fremover: 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) CA* + bestemt sekvens 3´, omvendt: 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) + revers bemanning av bestemt sekvens 3´. Legg understreket baser for å sikre at vedlikehold av lesing rammen. Modulen ...

<ol>
	<li>Moore, I., Samalova, M., Kurup, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivated+and+chemically+inducible+gene+expression+in+plants.">Transactivated and chemically inducible gene expression in plants.</a> The Plant Journal. 45 (4), 651-683 (2006).</li><li>Lampropoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GreenGate---a+novel,+versatile,+and+efficient+cloning+system+for+plant+transgenesis.">GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis.</a> PLoS One. 8 (12), e83043 (2013).</li><li>Baroux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictable+activation+of+tissue-specific+expression+from+a+single+gene+locus+using+the+pOp/LhG4+transactivation+system+in+Arabidopsis.">Predictable activation of tissue-specific expression from a single gene locus using the pOp/LhG4 transactivation system in Arabidopsis.</a> Plant Biotechnology Journal. 3 (1), 91-101 (2005).</li><li>Craft, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+pOp/LhG4+vectors+for+stringent+glucocorticoid-dependent+transgene+expression+in+Arabidopsis.">New pOp/LhG4 vectors for stringent glucocorticoid-dependent transgene expression in Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 41 (6), 899-918 (2005).</li><li>Moore, I., Galweiler, L., Grosskopf, D., Schell, J., Palme, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcription+activation+system+for+regulated+gene+expression+in+transgenic+plants.">A transcription activation system for regulated gene expression in transgenic plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (1), 376-381 (1998).</li><li>Samalova, M., Brzobohaty, B., Moore, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pOp6/LhGR:+a+stringently+regulated+and+highly+responsive+dexamethasone-inducible+gene+expression+system+for+tobacco.">pOp6/LhGR: a stringently regulated and highly responsive dexamethasone-inducible gene expression system for tobacco.</a> The Plant Journal. 41 (6), 919-935 (2005).</li><li>Picard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steroid-binding+domains+for+regulating+the+functions+of+heterologous+proteins+in+cis.">Steroid-binding domains for regulating the functions of heterologous proteins in cis.</a> Trends in Cell Biology. 3 (8), 278-280 (1993).</li><li>Schurholz, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comprehensive+Toolkit+for+Inducible,+Cell+Type-Specific+Gene+Expression+in+Arabidopsis.">A Comprehensive Toolkit for Inducible, Cell Type-Specific Gene Expression in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 178 (1), 40-53 (2018).</li><li>Kubo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+switches+for+protoxylem+and+metaxylem+vessel+formation.">Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation.</a> Genes and Development. 19 (16), 1855-1860 (2005).</li><li>Di Laurenzio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SCARECROW+gene+regulates+an+asymmetric+cell+division+that+is+essential+for+generating+the+radial+organization+of+the+Arabidopsis+root.">The SCARECROW gene regulates an asymmetric cell division that is essential for generating the radial organization of the Arabidopsis root.</a> Cell. 86 (3), 423-433 (1996).</li><li>Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+SCARECROW+function+reveals+a+radial+patterning+mechanism+common+to+root+and+shoot.">Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot.</a> Development. 127 (3), 595-603 (2000).</li><li>Hellens, R. P., Edwards, E. A., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pGreen:+a+versatile+and+flexible+binary+Ti+vector+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation.">pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Plant Molecular Biology. 42 (6), 819-832 (2000).</li><li>Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana+using+the+floral+dip+method.">Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method.</a> Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).</li><li>Kleinboelting, N., Huep, G., Kloetgen, A., Viehoever, P., Weisshaar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABI-Kat+SimpleSearch:+new+features+of+the+Arabidopsis+thaliana+T-DNA+mutant+database.">GABI-Kat SimpleSearch: new features of the Arabidopsis thaliana T-DNA mutant database.</a> Nucleic Acids Research. 40 (Database issue), D1211-D1215 (2012).</li><li>. Selection scheme used at GABI-Kat for resistance to sulfadiazine Available from: <a target="_blank" href="https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html">https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html</a> (2018)</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+addition+quantitative+real-time+PCR+(SAQPCR):+a+novel+approach+for+determination+of+transgene+copy+number+avoiding+PCR+efficiency+estimation.">Standard addition quantitative real-time PCR (SAQPCR): a novel approach for determination of transgene copy number avoiding PCR efficiency estimation.</a> PLoS One. 8 (1), e53489 (2013).</li><li>Wallner, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strigolactone-+and+Karrikin-Independent+SMXL+Proteins+Are+Central+Regulators+of+Phloem+Formation.">Strigolactone- and Karrikin-Independent SMXL Proteins Are Central Regulators of Phloem Formation.</a> Current Biology. 27 (8), 1241-1247 (2017).</li><li>Fletcher, J. C., Brand, U., Running, M. P., Simon, R., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+of+cell+fate+decisions+by+CLAVATA3+in+Arabidopsis+shoot+meristems.">Signaling of cell fate decisions by CLAVATA3 in Arabidopsis shoot meristems.</a> Science. 283 (5409), 1911-1914 (1999).</li><li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cellulose+synthases+in+Arabidopsis+secondary+cell+walls.">Visualization of cellulose synthases in Arabidopsis secondary cell walls.</a> Science. 350 (6257), 198-203 (2015).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VASCULAR-RELATED+NAC-DOMAIN6+and+VASCULAR-RELATED+NAC-DOMAIN7+effectively+induce+transdifferentiation+into+xylem+vessel+elements+under+control+of+an+induction+system.">VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN6 and VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN7 effectively induce transdifferentiation into xylem vessel elements under control of an induction system.</a> Plant Physiology. 153 (3), 906-914 (2010).</li><li>Engineer, C. B., Fitzsimmons, K. C., Schmuke, J. J., Dotson, S. B., Kranz, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+a+Gal4-mediated+LUC/GFP/GUS+enhancer+trap+system+in+Arabidopsis.">Development and evaluation of a Gal4-mediated LUC/GFP/GUS enhancer trap system in Arabidopsis.</a> BMC Plant Biology. 5, 9 (2005).</li><li>Aoyama, T., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glucocorticoid-mediated+transcriptional+induction+system+in+transgenic+plants.">A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants.</a> The Plant Journal. 11 (3), 605-612 (1997).</li><li>Decaestecker, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-TSKO+facilitates+efficient+cell+type-,+tissue-,+or+organ-specific+mutagenesis+in+Arabidopsis.">CRISPR-TSKO facilitates efficient cell type-, tissue-, or organ-specific mutagenesis in Arabidopsis.</a> bioRxiv. , (2018).</li></ol>

Her beskriver vi nødvendig for å generere og bruke en allsidig og omfattende verktøykasse for induserbart, celle type bestemt trans-aktivisering. Krysset linjer bærer effektor kassetter under kontroll pOp med driveren linjer kan studere mis uttrykk effektene i F1 generasjon, slik at rask vurdering av genetisk forstyrrelsene i en rekke celletyper. Alternativt effektor konstruksjonene kan brukes til å transformere driveren linjer eller ved å tilpasse kloning strategi, fører og effektor konstruere k...

En stor begrensning i biologi i postgenomic tid er å dechiffrere rollen sammenheng spesifikke for en bestemt faktor eller genetisk forstyrrelsene. Konstituerende genetisk forstyrrelser som tap-av-funksjon og gevinst-av-funksjon tilnærminger ofte bare tillate end-point analyse av livslang tilpasning prosesser, obfuscating skillet mellom primær og sekundær effekter. I tillegg kan sammenheng bestemte funksjoner, maskert eller utvannet av storskala effekter i fjerne vev eller andre faser av utviklingen. Videre, i ekstreme tilfeller, dødelighet kan utelukke noen mekanistisk innsikt. For å omgå disse problemene, kan en ideal, analysere effekten av akutt genetisk forstyrrelsene i en bestemt kontekst som en bestemt celle type på en gang-løst måte. For å oppnå dette, er genetisk verktøy for induserbart, celle type-spesifikk uttrykk nødvendig1. Hvis du vil gi en ressurs for rask vurdering av spatiotemporal dynamikken i et svar på en gitt effektor, har vi kombinert enkel kloning levert av GreenGate system2 med bevist effekten av GR-LhG4 systemet3, 4,5,6. Vi har generert et sett med linjer uttrykke chimeric transkripsjon faktoren LhG4 smeltet ligand binding domenet av rotte corticoid reseptor (GR)7 under kontroll av godt karakterisert celle type bestemte arrangørene8. I hvile forhold, fortsatt transkripsjon faktor utenfor kjernen, GR domenet er bundet av cytosolic HSP90. Med tillegg av syntetiske ligand deksametason (Dex), kjernefysiske translokasjon er indusert og LhG4 vil formidle transkripsjon av uttrykket kassetter under kontroll av en beslektet syntetiske type pOp promoter, som en mTurquoise2 reporter inkludert i driveren linjene visualisere uttrykk domenet etter innledningen.  Dermed driveren linjene teknisk inneholder også en effektor kassett. Krysset av driveren linjer med en linje som bærer en effektor kassett med, for eksempel en genet av interesse under kontroll samme type pOp dermed lar rask vurdering av akutt eller langsiktige konsekvensene av effektor uttrykk i en rekke celletyper.
Her gir vi en protokoll som beskriver prosedyrene generere driveren og effektor linjene og demonstrere hvordan celle type spesifikke uttrykk kan indusert og fulgte i skyte apikal meristem, rot apikal meristem og cambium av Arabidopsis. For å illustrere dyktighet og spesifisitet av denne tilnærmingen, vi utnytter den velkjente transkripsjon faktoren VND7 som kan kjøre vedvev-lignende videregående cellen vegg thickenings ectopically9. Behandle F1 fra et kryss mellom pSCR10,11 driver linjen og pOp6:VND7 effektor linje fører til dannelse av ektopisk vedvev som celler i stivelse skjede celler av Arabidopsis stem.
For å lette generasjonen av store DNA samlinger kreves for å konstruere driveren og effektor uttrykk plasmider, brukte vi den rask og effektiv GreenGate kloning metode2. GreenGate kloning er basert på type II S begrensning enzymer som Eco31I eller dens isoschizomer Bsajeg2. Disse enzymene kuttet nedstrøms asymmetrisk anerkjennelse områdene produsere overheng med varierende base sammensetning. Ved å innlemme Eco31I /Bsajeg begrensning nettsteder i oligonucleotides og tildele bestemte overheng sekvenser til DNA elementer, modulære kloning er oppnådd, tilrettelegge generering av store samlinger. I GreenGate rammen faller DNA moduler i kategorier A-F basert på overheng sekvens som fungerer som kort og er samlet i den rekkefølgen. Derfor bør primerne utviklet for å forsterke din ønsket produkt være i henhold til den valgte modul2 (figur 1A). Hvis det er en intern Eco31I /Bsajeg området og rekkefølgen er ikke kompatibel med GreenGate oppføringen og destinasjon moduler, kan du fortsette uten mutagenizing, men med lavere effektivitet. Også bruke nettstedet-rettet mutagenese fjerne Eco31I /Bsajeg begrensning nettsteder ta vare ikke for å endre aminosyrer i genet produkter.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>K029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Column purification</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit (250)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture chamber for imaging</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG</td>
			<td>1-well tissue culture chamber, on cover glass II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>D139-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eco31I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FD0294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>injection cannula (0.30 x 12 mm, 30 G x 1/2)</td>
			<td>Sterican, Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>T832.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO lambda blue 63x water immersion objectiv</td>
			<td>Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS medium</td>
			<td>Duchefa, Haarlem, Netherlands</td>
			<td>M0221.0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x&#160; 1.1 NA water immersion objective</td>
			<td>Nikon, Minato, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35/10 mm</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Germany</td>
			<td>627102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60/150 mm</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Germany</td>
			<td>628102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 120/120/17</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Germany</td>
			<td>688102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant agar</td>
			<td>Duchefa, Haarlem, Netherlands</td>
			<td>P1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid extraction</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide (PI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razorblade</td>
			<td>Classic, Wilkinson Sword GmbH</td>
			<td>7005115E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tubes</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silwet L-77</td>
			<td>Kurt Obermeier GmbH &#38; Co. KG, Bad Berleburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>3834.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NanoDrop 2000c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfadiazine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>2228.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Ligase 5 U/&#181;l</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Ligase 30 U/&#181;l</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EL0013</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducible, cell type-specific expression in arabidopsis thaliana through lhgr-mediated trans-activation

Induserbart, vev-spesifikke uttrykk er en viktig og kraftig verktøy for å studere spatio-temporale dynamikken i genetisk forstyrrelsene. Kombinerer fleksibel og effektiv GreenGate kloning systemet med velprøvde og benchmarked LhGR system (her kalt GR-LhG4) for induserbart uttrykket, har vi generert et sett av transgene Arabidopsis linjer som kan kjøre uttrykk for en effektor kassett i en rekke spesifikke celletyper i de tre hoved plante meristems. Dette valgte vi tidligere utviklet GR-LhG4 systemet basert på en chimeric transkripsjon faktor og en beslektet type pOp promoter sikre stram kontroll over et bredt spekter av uttrykk. I tillegg for å visualisere uttrykk domenet der syntetiske transkripsjon faktoren er aktiv, er en ER lokalisert mTurquoise2 fluorescerende reporter under kontroll pOp4 eller pOp6 kodet i driveren linjer. Her beskriver vi nødvendig for å generere en driver eller effektor linje og demonstrere hvordan celle type spesifikke uttrykk kan indusert og fulgte i skyte apikal meristem, rot apikal meristem og cambium av Arabidopsis. Ved hjelp av flere eller alle linjer, kontekst spesifikk effekten av uttrykke en eller flere faktorer (effektor) under kontroll syntetiske pOp kan vurderes raskt, for eksempel i F1 planter en mellomting mellom en effektor og flere driveren linjer. Denne tilnærmingen er eksemplifisert ved ektopisk uttrykk for VND7, en NAC transkripsjon faktor kan indusere ektopisk videregående cellen vegg avsettelse i en celle autonom måte.

Generasjon av driveren og effektor linjer gjennom GreenGate kloning
GreenGate kloning systemet er basert på GoldenGate kloning og bruk type IIS begrensning endonuclease Bsajeg eller sin isoschizomer øko31I. Som enzymet produserer overheng fjernt fra nettstedet sitt asymmetrisk anerkjennelse, base sammensetningen av overheng kan fritt danner valgt, som er grunnlaget modularitet av systemet. Hvert PCR-generert element, for eksempel en promoter sekvens, CDer e...

Watch this Scientific Journal Video about Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation at JoVE.com

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Induserbart, celle Type-spesifikk uttrykk i Arabidopsis thaliana gjennom LhGR-mediert Trans-aktivisering

Her beskriver vi generering og søknad av en sette av transgene Arabidopsis thaliana linjer muliggjør induserbart, vev-spesifikke uttrykk i de tre viktigste meristems, skyte apikal meristem, rot apikal meristem og cambium.

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

Hovedmålet med utviklingsbiologi er å forstå et gens kontekstspesifikke rolle. Og dette kan være vanskelig å oppnå ved konvensjonelle knockout mutanter eller ved konstituerende overuttrykkslinjer. Vi brukte det modulære grønne portkloningsystemet til å generere en ressurs for induserbart cytospesifikt uttrykk i de tre viktigste meristems av modellanlegget Arabidopsis thaliana.Ved hjelp av samme modulære kloningsstrategi kan denne metoden brukes på andre plantearter som ikke kan transformasjonens. Visuell demonstrasjon av denne prosedyren er verdifull fordi analyse av effekten av transaktivering i meristems av stammen og den korte apex krever disseksjon før avbildning, noe som kan være ganske utfordrende. For å begynne, steriliser frøene som beskrevet i tekstprotokollen.Deretter forbereder halvstyrke Murashige og Skoog medium på pH 5,8 og legger til en prosent sukrose og 0,9% agar. Etter autoklavering, tilsett Dex oppløst i DMSO til induksjonsplatene ved en endelig konsentrasjon mellom 10 og 30 mikromos. Legg til like mye DMSO i kontrollplatene.Sett frøene for rotavbildning på plater og stratifisere dem i 48 timer i mørket og ved fire grader Celsius. Sett platene i vertikal stilling i en planteinkubator og dyrke dem i fem dager. Fem dager etter spiring, bruk konfokal laserskanning mikroskopi for å bilde plantene.For å begynne, forberede og dyrke frøene som beskrevet i tekstprotokollen. Seks til syv dager etter spiring, overføre hver frøplante til jord i en egen pott. Hvis du induserer plantene ved vanning, bruk en 25 mikromolar DEX-løsning i vann, tilberedt fra en bestand på 25 millimolar DEX oppløst i etanol.Vann hver to til tre dager til ønsket tid for induksjon. Hvis du induserer ved å dyppe, lag et en-liters beger med 750 milliliter vann som inneholder 0,02% Silwet L77 og DEX ved 25 mikromolar endelig konsentrasjon eller tilsvarende mengde DMSO for DEX og mock behandling. Dypp en enkelt plante i induksjons- eller mock-løsningen i 30 sekunder.Gjenta hver to til tre dager, til ønsket bildetid. For å begynne, forberede og dyrke frøene som beskrevet i tekstprotokollen. Seks til syv dager etter spiring, overføre hver frøplante til jord i en egen pott.Når stammen er rundt en centimeter lang, spray den influorescent SAM med mellom 10 og 50 mikromolar DEX løsning i vann. For induksjon og avbildning i senere utviklingsstadier, indusere SAMs av lengre stengler eller sideskudd. 24 til 48 timer etter induksjon, dissekere SAMs og gå videre til bildebehandling.Først overfører du plantene fra platen til et 10 mikrogram per millileterløsning av propidiumjodid og motvirker dem i fem minutter. Plasser røttene i et mikroskop bildekammer og bilde dem ved hjelp av en confocal laser skanning mikroskop med en 63x vann nedsenking mål. For å visualisere propidiumjodidfluorescens, bruk en eksitasjonsbølgelengde på 488 nanometer og samle utslipp mellom 590 og 660 nanometer.For mTurquoise2 fluorescens, bruk 458 nanometer for excitation og samle utslipp mellom 460 og 615 nanometer ved hjelp av sekvensiell skanning. Først fikser du en stamme med en finger på motsatt side av ønsket seksjon. Bruk et barberblad, kutt et segment på omtrent tre centimeter og utfør flere fine kutt.Skyll barberbladet i en petriskål som inneholder vann fra springen og samle stammen seksjoner. Enten flekke seksjonene eller direkte montere dem på mikroskop lysbilder. For farging, forberede en milliliter av en 250 mikrogram per milliliter løsning av propidiumjodid i et reaksjonsrør.Fjern vann fra springen fra petriskålen med en pipette og erstatt det med propidiumjodidløsningen og flekken i fem minutter. Fjern deretter propidiumjodidoppløsningen og skyll med vann. Bruk enten fine tang eller en fin pensel, overfør de beisede seksjonene til mikroskoplyser.Bruk et konfokal laserskanningsmikroskop med en 25x dyppevannsnedsenkingslinse for å avbilde prøvene. Bruk et 561 nanometer laserlys til å opphisse propidiumjodidfluorescens og samle utslipp fra 570 til 620 nanometer. Bruk et 405 nanometer laserlys for å opphisse mTurquoise2 fluorophore effector kodet av driveren linje konstruksjoner og samle utslipp fra 425 til 475 nanometer.Først bruker du tang til å kutte stammen to centimeter under skytespissen. Hold stammen i den ene hånden og bruk fine tang for å fjerne blomsterknoppene og store primordia. For å fjerne ung primordia, fikse SAM i oppreist stilling i en petriskål som inneholder tre prosent agarose.Deretter bruker du en kikkert og tang for å fjerne eventuelle unge primordia nær SAM. Overfør den dissekerte SAM til et rør som inneholder et 250 mikrogram per milliliter oppløsning av propidiumjodid. La prøveflekken ligge i fem til ti minutter samtidig som prøven forblir helt nedsenket under fargingsprosedyren.Plasser den beisede SAM i en liten petriskål som inneholder tre prosent agarose medium. Dekk SAM med dobbelt destillert vann. Bruk et konfokal laserskanningsmikroskop utstyrt med en 25x dyppevannsnedsenkingslinse for å avbilde de dissekerte SAMene.Bruk et 561 nanometer laserlys til å opphisse propidiumjodidfluorescens og samle utslipp fra 570 til 620 nanometer. Bruk et 405 nanometer laserlys for å opphisse mTurquoise2 fluorofor og samle utslipp fra 425 til 475 nanometer. Ta opp bildestabler som strekker seg over 50 mikrometer i Z-retningen med en trinnstørrelse på 0,5 mikrometer.Induksjon med DEX fører til celle-type spesifikke mTurquoise2 uttrykk i roten endodermis phloem forløpere og cambium, og stamcellene i skyte apical meristem. Som et test tilfelle for transaktivering genereres en effektorlinje som koder den sekundære celleveggmaltranskripsjonsfaktoren VND7 til V16-aktiveringsdomenet. Etter fem dager med enkeltbehandling med enten 15 mikroliter dex eller DMSO, er stammeseksjoner forberedt for visualisering av ektopisk lignifisering i starthylsen.Starthylsecellene i induserte prøver viser et sterkt signal for propidiumjodidkanalen, og noen celler viser den typiske reticulate fortykning av celleveggen i xylem-celler. Etter å ha sett denne videoen, bør du ha en klar forståelse av hvordan du induserer genuttrykk i forskjellige vev og hvordan du forbereder prøvene dine for avbildning. Etter denne prosedyren kan de etablerte driverlinjene brukes med et bredt utvalg av effektorkonstruksjoner generert av andre brukere i henhold til deres forskningsinteresser.Denne snarveien bør hjelpe planteforskere til raskt å vurdere effekten av celletypespesifikt uttrykk eller knockdown av et gen av interesse på en tid reservert måte. Dette celle-type spesifikke induksjonssystemet krever bruk av kortikosteroid deksametason. Direkte kontakt bør unngås, så det er viktig å bruke hansker og ansiktsmaske under behandlingen.

Research

JoVE Journal

Genetics

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

The Terroir Concept Interpreted through Grape Berry Metabolomics and Transcriptomics

Den Terroir Concept Tolket gjennom Grape Berry Metabolomics og transcriptomics

Terroir refers to the combination of environmental factors that affect the characteristics of crops such as grapevine (Vitis vinifera) according to ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Parallell Måling av biologiske klokke genekspresjon og hormon i Human primære cellekulturer

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

Encellede Gene Expression Bruke Multiplex RT-qPCR å karakter heterogenitet av sjeldne lymfoide populasjoner

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Oppdrett og Double-stranded RNA-mediert Gene knockdown i Hide Beetle,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Inducerbart T7 RNA Polymerase-mediert Multigen Expressions System, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Encellede Gene Expression Profilering hjelp FACS og qPCR med interne standarder

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Kontrollerbar Ion Channel Expression gjennom induserbar Transient Transfeksjon

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

Studier av celle-regulert genuttrykk av to komplementære cellesynkroniseringsprotokoller

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Grunnleggende og induserbart systemer for genetisk i Vivo endring av musen hepatocytter bruker etter halen blodåre injeksjon

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

En Optogenetic metode for å styre og analysere Gene Expression mønstre i celle til celle interaksjoner

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...