Name: inducible, cell type-specific expression in arabidopsis thaliana through lhgr-mediated trans-activation
Uploaded: 2019-04-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation at JoVE.com

Работа в нашей лаборатории поддерживается Немецкий исследовательский фонд (DFG) гранты WO 1660/6-1 (с.в.) и GR 2104/4-1 (т.г.) и SFB1101 (для т.г. и J.U.L) и Европейский исследовательский совет консолидатором предоставить т.г. (PLANTSTEMS 647148)  С.в. поддерживается через братство Эмми Нётер DFG через Грант WO 1660/2.

Векторы и модули можно получить из некоммерческих репозитория, Addgene (https://www.addgene.org).
1. клонирование, используя GreenGate
<ol><li>Праймеры дизайн с использованием свесы, перечисленные в таблице 1, заменив модуль адаптера конкретного типа последовательности «NNNN» перечисл...

<ol>
	<li>Moore, I., Samalova, M., Kurup, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivated+and+chemically+inducible+gene+expression+in+plants.">Transactivated and chemically inducible gene expression in plants.</a> The Plant Journal. 45 (4), 651-683 (2006).</li><li>Lampropoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GreenGate---a+novel,+versatile,+and+efficient+cloning+system+for+plant+transgenesis.">GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis.</a> PLoS One. 8 (12), e83043 (2013).</li><li>Baroux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictable+activation+of+tissue-specific+expression+from+a+single+gene+locus+using+the+pOp/LhG4+transactivation+system+in+Arabidopsis.">Predictable activation of tissue-specific expression from a single gene locus using the pOp/LhG4 transactivation system in Arabidopsis.</a> Plant Biotechnology Journal. 3 (1), 91-101 (2005).</li><li>Craft, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+pOp/LhG4+vectors+for+stringent+glucocorticoid-dependent+transgene+expression+in+Arabidopsis.">New pOp/LhG4 vectors for stringent glucocorticoid-dependent transgene expression in Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 41 (6), 899-918 (2005).</li><li>Moore, I., Galweiler, L., Grosskopf, D., Schell, J., Palme, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcription+activation+system+for+regulated+gene+expression+in+transgenic+plants.">A transcription activation system for regulated gene expression in transgenic plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (1), 376-381 (1998).</li><li>Samalova, M., Brzobohaty, B., Moore, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pOp6/LhGR:+a+stringently+regulated+and+highly+responsive+dexamethasone-inducible+gene+expression+system+for+tobacco.">pOp6/LhGR: a stringently regulated and highly responsive dexamethasone-inducible gene expression system for tobacco.</a> The Plant Journal. 41 (6), 919-935 (2005).</li><li>Picard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steroid-binding+domains+for+regulating+the+functions+of+heterologous+proteins+in+cis.">Steroid-binding domains for regulating the functions of heterologous proteins in cis.</a> Trends in Cell Biology. 3 (8), 278-280 (1993).</li><li>Schurholz, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comprehensive+Toolkit+for+Inducible,+Cell+Type-Specific+Gene+Expression+in+Arabidopsis.">A Comprehensive Toolkit for Inducible, Cell Type-Specific Gene Expression in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 178 (1), 40-53 (2018).</li><li>Kubo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+switches+for+protoxylem+and+metaxylem+vessel+formation.">Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation.</a> Genes and Development. 19 (16), 1855-1860 (2005).</li><li>Di Laurenzio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SCARECROW+gene+regulates+an+asymmetric+cell+division+that+is+essential+for+generating+the+radial+organization+of+the+Arabidopsis+root.">The SCARECROW gene regulates an asymmetric cell division that is essential for generating the radial organization of the Arabidopsis root.</a> Cell. 86 (3), 423-433 (1996).</li><li>Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+SCARECROW+function+reveals+a+radial+patterning+mechanism+common+to+root+and+shoot.">Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot.</a> Development. 127 (3), 595-603 (2000).</li><li>Hellens, R. P., Edwards, E. A., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pGreen:+a+versatile+and+flexible+binary+Ti+vector+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation.">pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Plant Molecular Biology. 42 (6), 819-832 (2000).</li><li>Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana+using+the+floral+dip+method.">Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method.</a> Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).</li><li>Kleinboelting, N., Huep, G., Kloetgen, A., Viehoever, P., Weisshaar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABI-Kat+SimpleSearch:+new+features+of+the+Arabidopsis+thaliana+T-DNA+mutant+database.">GABI-Kat SimpleSearch: new features of the Arabidopsis thaliana T-DNA mutant database.</a> Nucleic Acids Research. 40 (Database issue), D1211-D1215 (2012).</li><li>. Selection scheme used at GABI-Kat for resistance to sulfadiazine Available from: <a target="_blank" href="https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html">https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html</a> (2018)</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+addition+quantitative+real-time+PCR+(SAQPCR):+a+novel+approach+for+determination+of+transgene+copy+number+avoiding+PCR+efficiency+estimation.">Standard addition quantitative real-time PCR (SAQPCR): a novel approach for determination of transgene copy number avoiding PCR efficiency estimation.</a> PLoS One. 8 (1), e53489 (2013).</li><li>Wallner, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strigolactone-+and+Karrikin-Independent+SMXL+Proteins+Are+Central+Regulators+of+Phloem+Formation.">Strigolactone- and Karrikin-Independent SMXL Proteins Are Central Regulators of Phloem Formation.</a> Current Biology. 27 (8), 1241-1247 (2017).</li><li>Fletcher, J. C., Brand, U., Running, M. P., Simon, R., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+of+cell+fate+decisions+by+CLAVATA3+in+Arabidopsis+shoot+meristems.">Signaling of cell fate decisions by CLAVATA3 in Arabidopsis shoot meristems.</a> Science. 283 (5409), 1911-1914 (1999).</li><li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cellulose+synthases+in+Arabidopsis+secondary+cell+walls.">Visualization of cellulose synthases in Arabidopsis secondary cell walls.</a> Science. 350 (6257), 198-203 (2015).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VASCULAR-RELATED+NAC-DOMAIN6+and+VASCULAR-RELATED+NAC-DOMAIN7+effectively+induce+transdifferentiation+into+xylem+vessel+elements+under+control+of+an+induction+system.">VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN6 and VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN7 effectively induce transdifferentiation into xylem vessel elements under control of an induction system.</a> Plant Physiology. 153 (3), 906-914 (2010).</li><li>Engineer, C. B., Fitzsimmons, K. C., Schmuke, J. J., Dotson, S. B., Kranz, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+a+Gal4-mediated+LUC/GFP/GUS+enhancer+trap+system+in+Arabidopsis.">Development and evaluation of a Gal4-mediated LUC/GFP/GUS enhancer trap system in Arabidopsis.</a> BMC Plant Biology. 5, 9 (2005).</li><li>Aoyama, T., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glucocorticoid-mediated+transcriptional+induction+system+in+transgenic+plants.">A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants.</a> The Plant Journal. 11 (3), 605-612 (1997).</li><li>Decaestecker, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-TSKO+facilitates+efficient+cell+type-,+tissue-,+or+organ-specific+mutagenesis+in+Arabidopsis.">CRISPR-TSKO facilitates efficient cell type-, tissue-, or organ-specific mutagenesis in Arabidopsis.</a> bioRxiv. , (2018).</li></ol>

Здесь, мы описывают шаги, необходимые для создания и применения универсальный и всеобъемлющий инструментарий для индуцибельной, ячейки типа конкретных транс-активации. Пересечения линий, перевозящих эффекторных кассеты под контролем промотора поп с линии драйвер позволяет ...

Одним из основных ограничений в биологии в постгеномную эру является расшифровать конкретную роль контекста данного фактора или генетических возмущений. Учредительного генетических возмущений, таких, как потеря функции и выгоды функция подходы часто только позволяют концевой анализ пожизненный адаптационных процессов, запутывание различие между первичными и вторичными эффектами. Кроме того конкретные функции контекста может быть масках или разбавленный воздействием крупных масштабах в отдаленных тканях или на других этапах развития. Кроме того в крайних случаях, летальность может препятствовать любой механистической проницательность. Идеально чтобы обойти эти проблемы, можно проанализировать эффект острого генетических возмущений в конкретном контексте такие конкретные ячейки типа в духе времени решена. Для достижения этой цели требуется1генетических средства для индуцибельной, выражение определенного типа клеток. Для обеспечения ресурсов для быстрой оценки динамики пространственно-временных ответа на заданный эффекторных, мы объединили легкость клонирования, представленной GreenGate системе2 с доказанной эффективностью системы GR-LhG43, 45,,6. Мы породили набор линий, выражая химерных транскрипционный фактор, который LhG4 сливается с лигандом связывающий домен крысы корковых рецептор (GR)7 под контролем хорошо изученных ячейки типа конкретных промоутеров8. В отдыхая условий, транскрипционный фактор остается вне ядра, как GR домена связана цитозольной HSP90. С добавлением синтетических лигандом дексаметазона (Dex) индуцированной ядерных транслокации и LhG4 будет посредничать транскрипции выражение кассет под контролем промотора родственных синтетической поп типа , таких как репортер mTurquoise2 включены в линии драйвер для визуализации выражение домена после индукции.  Таким образом водитель линии технически также содержат эффекторных кассеты. Пересечение набора драйверов линии с линией, перевозящих эффекторных кассету с, например, ген интереса под контролем промотора же поп типа таким образом позволяет быстрой оценки острой или долгосрочных последствий эффекторных выражения в широком диапазоне типов клеток.
Здесь мы предоставляем протокол описания процедур, необходимых для создания линии водителя и эффекторных и продемонстрировать как конкретное выражение типа клеток может быть индуцированных и стрелять апикальной Меристемы, корень апикальной Меристемы и камбий из Арабидопсис. Чтобы проиллюстрировать доблесть и специфичность данного подхода, мы используем известные транскрипционный фактор VND7, который способен вождения утолщений стены клетки ксилемы как средних ectopically9. Лечение F1 от помесь pSCR10,11 драйвер линией и линией эффекторных pOp6:VND7 приводит к образованию внематочная клетки ксилемы как в оболочке крахмала, что стволовые клетки Arabidopsis .
Для облегчения поколения больших сборок ДНК, необходимые для построения драйвера и эффекторных выражение плазмид, мы использовали быстро и эффективно GreenGate, клонирование метод2. Клонирование GreenGate основаны на тип II S энзимов ограничения такие как эко31I или его isoschizomer Bsa2. Эти ферменты отрезать вниз по течению от их асимметричной признание сайтов производства свесы с различной базовый состав. Включив эко31I /Bsaя ограничения сайтов в олигонуклеотиды и выделения конкретных навеса последовательностей ДНК элементы, Модульная клонирования достигается, содействие поколения больших сборок. В рамках GreenGate ДНК модули делятся на категории, A-F на основе последовательности навеса, которые служат адаптеры и собраны в этом порядке. Таким образом грунты, предназначенные для того чтобы усилить ваш желаемый продукт должен соответствовать выбранный модуль2 (рис. 1A). Если есть внутренней эко31I /Bsaя сайта и последовательность не совместим с модулями записи и назначения GreenGate, вы можете продолжить без mutagenizing, но с более низкой эффективности. Кроме того, для удаления эко31I использовать сайт Направленный мутагенез /Bsaя места ограничения, стараясь не изменять аминокислот в продуктах ген.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>K029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Column purification</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit (250)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture chamber for imaging</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG</td>
			<td>1-well tissue culture chamber, on cover glass II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>D139-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eco31I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FD0294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>injection cannula (0.30 x 12 mm, 30 G x 1/2)</td>
			<td>Sterican, Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>T832.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO lambda blue 63x water immersion objectiv</td>
			<td>Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS medium</td>
			<td>Duchefa, Haarlem, Netherlands</td>
			<td>M0221.0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x&#160; 1.1 NA water immersion objective</td>
			<td>Nikon, Minato, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35/10 mm</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Germany</td>
			<td>627102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60/150 mm</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Germany</td>
			<td>628102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 120/120/17</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Germany</td>
			<td>688102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant agar</td>
			<td>Duchefa, Haarlem, Netherlands</td>
			<td>P1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid extraction</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide (PI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razorblade</td>
			<td>Classic, Wilkinson Sword GmbH</td>
			<td>7005115E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tubes</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silwet L-77</td>
			<td>Kurt Obermeier GmbH &#38; Co. KG, Bad Berleburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>3834.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NanoDrop 2000c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfadiazine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>2228.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Ligase 5 U/&#181;l</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Ligase 30 U/&#181;l</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EL0013</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducible, cell type-specific expression in arabidopsis thaliana through lhgr-mediated trans-activation

Индуцибельной, ткани конкретного выражения является важным и мощным инструментом для изучения пространственно временной динамики генетической возмущений. Сочетание гибкой и эффективной GreenGate, клонирование системы с проверенной и протестированные LhGR системы (здесь называют GR-LhG4) для индуцибельной выражения, мы породили ряд трансгенных линий Arabidopsis, которые могут управлять выражение эффекторных Кассета в диапазоне типов конкретных клеток в трех главных растений меристем. С этой целью мы выбрали ранее разработанной GR-LhG4 система, основанная на химерных транскрипционный фактор и родственных поп тип промоутер, обеспечить жесткий контроль над широкий спектр выражение уровня. Кроме того чтобы визуализировать выражение домена, где активен синтетических транскрипционный фактор, флуоресцентные корреспонденту ER-локализованных mTurquoise2 под контролем промотора pOp4 или pOp6 кодируется в линии драйвер. Здесь мы описывают шаги, необходимые для создания драйверов или эффекторных линии и продемонстрировать как конкретное выражение типа клеток может быть индуцированных и стрелять апикальной Меристемы, корень апикальной Меристемы и камбий Arabidopsis. С помощью нескольких или всех драйверов линии, специфическое действие контекста выражения одного или нескольких факторов (эффекторы) под контролем промотора синтетической поп можно оценить быстро, например F1 растений Креста между одной эффекторных и несколько линии драйвер. Этот подход подтверждается внематочная выражением VND7, НАК транскрипционный фактор способны индуцировать внематочная средних клеток стенки осаждения автономным образом клетки.

Поколение водителя и эффекторных линий через GreenGate клонирования
GreenGate, клонирование системы основана на GoldenGate клонирования и использования эндонуклеазы ограничения типа IIS Bsaя или его isoschizomer эко31I. Как фермента производит свесы далеких от асимметрично...

Watch this Scientific Journal Video about Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation at JoVE.com

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Индуцибельной, выражение определенного типа клеток в Arabidopsis thaliana через LhGR-опосредованной транс-активация

Здесь мы описываем поколения и применение свода трансгенных Arabidopsis thaliana линии благоприятных индуцибельной, ткани конкретных выражение в трех основных меристем и стрелять апикальной Меристемы, корень апикальной Меристемы, камбий.

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

Основная цель в биологии развития заключается в том, чтобы понять контекстную роль гена. И этого может быть трудно достичь обычными нокаут-мутантами или составными линиями переэкспрессии. Мы использовали модульную систему клонирования зеленых ворот для создания ресурса для неиссякаемого цитоспецифического выражения в трех основных меристемах модельного растения Arabidopsis thaliana.Используя ту же модульную стратегию клонирования, этот метод может быть применен к другим видам растений, которые неизменяемы для трансформации. Визуальная демонстрация этой процедуры ценна, потому что анализ эффекта трансактивации в меристемах стебля и короткой вершине требует вскрытия перед визуализацией, что может быть довольно сложной задачей. Для начала стерилизовать семена, как указано в текстовом протоколе.Далее, подготовить половину силы Murashige и Skoog среды на рН 5,8 и добавить один процент сахарозы и 0,9%agar. После автоклавирования добавьте Декс, растворенный в DMSO, в индукционные пластины в конечной концентрации от 10 до 30 микромолеров. Добавьте равное количество DMSO к контрольным пластинам.Положите семена для корневой визуализации на пластины и расслоить их в течение 48 часов в темноте и при четырех градусах по Цельсию. Поместите пластины в вертикальное положение в инкубатор растений и выращивайте их в течение пяти дней. Через пять дней после прорастания используйте конфокальные лазерные сканирующие микроскопии для изображения саженцев.Для начала подготовьте и вырастите семена, изложенные в текстовом протоколе. Через шесть-семь дней после прорастания перенесите каждого саженца на почву в отдельном горшке. При индуцировании растений путем полива, используйте 25 микромоляных раствор DEX в воде, приготовленные из бульона 25 миллимоляров DEX растворяется в этаноле.Вода каждые два-три дня до желаемого времени индукции. При индуцировании путем погружения, подготовить один литр стакана с 750 миллилитров воды, содержащей 0,02%Silwet L77 и DEX на 25 микромолярной конечной концентрации или эквивалентное количество DMSO для DEX и макет лечения. Опустите одно растение в индукционный или макет раствора в течение 30 секунд.Повторяйте каждые два-три дня, до желаемого времени визуализации. Для начала подготовьте и вырастите семена, изложенные в текстовом протоколе. Через шесть-семь дней после прорастания перенесите каждого саженца на почву в отдельном горшке.Когда стебель составляет около одного сантиметра в длину, спрей influorescent SAM с между 10 и 50 микромоляных DEX раствор в воде. Для индукции и визуализации на более поздних стадиях развития индуцировать SAMs более длинных стеблей или боковых побегов. Через 24-48 часов после индукции, вскрыть SAMs и приступить к визуализации.Во-первых, перенесите саженцы с тарелки на 10 микрограмм на миллилетный раствор йодида пропидия и пристегните их в течение пяти минут. Поместите корни в камеру визуализации микроскопа и изведайте их с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа с целью 63-х погружений в воду. Чтобы визуализировать флуоресценцию пропидия йодида, используйте возбудительную длину волны 488 нанометров и соберите выбросы между 590 и 660 нанометров.Для флуоресценции mTurquoise2 используйте 458 нанометров и собирайте выбросы между 460 и 615 нанометров с помощью последовательного сканирования. Во-первых, исправить стебель пальцем на противоположной стороне желаемого раздела. Используя лезвие бритвы, вырежьте сегмент примерно на три сантиметра и выполните несколько тонких разрезов.Промыть лезвие бритвы в чашке Петри, содержащей водопроводную воду и собирать стволовые секции. Либо пятно разделов или непосредственно смонтировать их на микроскоп слайды. Для окрашивания приготовьте один миллилитр 250 микрограмм на миллилитр раствора йодида пропидия в реакционной трубке.Удалить водопроводную воду из чашки Петри с пипеткой и заменить его раствором йодида пропидия и пятно в течение пяти минут. Затем удалите раствор йодида пропидия и промойте водой. Используя либо тонкие типсы, либо тонкую кисть, перенесите окрашенные секции на микроскопные слайды.Используйте конфокальный лазерный сканирующий микроскоп с 25-м объективом погружения в воду для изображения образцов. Используйте лазерный свет 561 нанометров для возбуждения флуоресценции йодида пропидия и сбора выбросов от 570 до 620 нанометров. Используйте 405 нанометровый лазерный свет, чтобы возбудить флюорофорный эффектор mTurquoise2, закодированный конструкцией линии драйвера, и собрать выбросы от 425 до 475 нанометров.Во-первых, используйте типсы, чтобы сократить стебель на два сантиметра ниже наконечника съемки. Держите стебель в одной руке и использовать тонкие типсы, чтобы удалить цветочные почки и большие primordia. Чтобы удалить молодую имордию, зафиксните SAM в вертикальном положении в чашке Петри, содержащей трехпроцентную агарозу.Далее, используйте бинокль и типсы, чтобы удалить любые молодые primordia близко к SAM. Перенесите вскрытый SAM в трубку, содержащую 250 микрограмм на миллилитр раствора йодида пропидия. Пусть образец пятно в течение пяти до 10 минут, убедившись, что образец остается полностью погружен во время процедуры окрашивания.Поместите окрашенные SAM в небольшой чашки Петри, содержащие три процента агарозы среды. Обложка SAM с двойной дистиллированной водой. Используйте конфокальный лазерный сканирующий микроскоп, оснащенный 25-м объективом погружения в воду для изображения вскрытых SAMs.Используйте 561 нанометровый лазерный свет для возбуждения флуоресценции йодида пропидия и сбора выбросов от 570 до 620 нанометров. Используйте 405 нанометровый лазерный свет, чтобы возбудить флюорофор mTurquoise2 и собрать выбросы от 425 до 475 нанометров. Рекордные стеки изображений, охватывающие 50 микрометров в направлении q с размером шага 0,5 микрометра.Индукция с DEX приводит к клеточного типа конкретных mTurquoise2 выражение в корневой эндодермии флоэм прекурсоров и камбия, и стволовые клетки в стрелять апический меристем. В качестве тестового случая для трансактивации генерируется линия эффектора, кодирующей вторичный фактор транскрипции стенок ячейки VND7, слитый с доменом активации V16. После пяти дней разового лечения либо с 15 микролитров DEX или DMSO, стволовые секции готовятся для визуализации эктопической иньификации в начале оболочки.Стартовые клетки оболочки в индуцированных образцах показывают сильный сигнал для канала йодида пропидия, и некоторые клетки показывают типичное утолщение стенки клетки в клетках ксилема. После просмотра этого видео, вы должны иметь четкое понимание того, как вызвать экспрессию генов в различных тканях и как подготовить образцы для визуализации. После этой процедуры установленные линии драйверов могут использоваться с широким спектром конструкций эффекторов, генерируемых другими пользователями в соответствии с их исследовательскими интересами.Этот ярлык должен помочь исследователям завода быстро оценить влияние клеточного типа специфического выражения или нокдауна гена интереса в зарезервированном временем образе. Эта специфическая индукционная система клеточного типа требует использования кортикостероидного дексаметазона. Прямого контакта следует избегать, поэтому важно носить перчатки и маску для лица во время лечения.

Research

JoVE Journal

Genetics

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

The Terroir Concept Interpreted through Grape Berry Metabolomics and Transcriptomics

Терруар Концепция толкуется через виноградной ягоды метаболомики и транскриптомика

Terroir refers to the combination of environmental factors that affect the characteristics of crops such as grapevine (Vitis vinifera) according to ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Параллельное измерение циркадных часов экспрессии генов и гормональную секрецией человека первичных клеточных культур

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

Одноклеточный экспрессии генов с помощью Multiplex RT-КПЦР к характеризации гетерогенности редких популяций лимфоидных

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Разведению и двухцепочечную РНК-опосредованный нокдаун гена в Скрыть Beetle,<em&gt; Кожеед пятнистый</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Индуцируемая T7-РНК-полимераза-опосредованная мультигенная экспрессия, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Одноклеточный экспрессии генов профилирование с помощью FACS и КПЦР с внутренними стандартами

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Управляемая Expression ионного канала через Индуцибельные временная трансфекция

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

Изучение экспрессии генов, регулируемых клеточным циклом, двумя протоколами синхронизации комплементарных ячеек

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Учредительные и индуцибельной систем для генетических в естественных условиях изменения мыши гепатоцитов, используя инъекции Вену гидродинамических хвост

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Метод Optogenetic для контроля и анализа картин выражения гена в ячейке для взаимодействия

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...