Name: inducible, cell type-specific expression in arabidopsis thaliana through lhgr-mediated trans-activation
Uploaded: 2019-04-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation at JoVE.com

Trabajo en nuestros laboratorios es apoyado por la Fundación de investigación alemana (DFG) subvenciones WO 1660/6-1 (S.W.) y GR 2104/4-1 (T.G.) y SFB1101 (a T.G. y J.U.L) y por un Consejo de investigación europeo consolidator grant (PLANTSTEMS 647148) a T.G.  S.W. es apoyado a través de la beca de Noether del Premio Emmy del DFG a través de subvención WO 1660/2.

Vectores y módulos pueden obtenerse desde el repositorio sin fines de lucro, Addgene (https://www.addgene.org).
1. clonación usando GreenGate
<ol><li>Cartillas de diseño utilizando los voladizos enumerados en la tabla 1, reemplazando 'NNNN' con secuencias específicas del tipo adaptador de módulo listados abajo: adelante: 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) CA* + 3´ de secuencia específica, invertir: 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) + reversa complemento de secuencia ...

<ol>
	<li>Moore, I., Samalova, M., Kurup, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivated+and+chemically+inducible+gene+expression+in+plants.">Transactivated and chemically inducible gene expression in plants.</a> The Plant Journal. 45 (4), 651-683 (2006).</li><li>Lampropoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GreenGate---a+novel,+versatile,+and+efficient+cloning+system+for+plant+transgenesis.">GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis.</a> PLoS One. 8 (12), e83043 (2013).</li><li>Baroux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictable+activation+of+tissue-specific+expression+from+a+single+gene+locus+using+the+pOp/LhG4+transactivation+system+in+Arabidopsis.">Predictable activation of tissue-specific expression from a single gene locus using the pOp/LhG4 transactivation system in Arabidopsis.</a> Plant Biotechnology Journal. 3 (1), 91-101 (2005).</li><li>Craft, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+pOp/LhG4+vectors+for+stringent+glucocorticoid-dependent+transgene+expression+in+Arabidopsis.">New pOp/LhG4 vectors for stringent glucocorticoid-dependent transgene expression in Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 41 (6), 899-918 (2005).</li><li>Moore, I., Galweiler, L., Grosskopf, D., Schell, J., Palme, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcription+activation+system+for+regulated+gene+expression+in+transgenic+plants.">A transcription activation system for regulated gene expression in transgenic plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (1), 376-381 (1998).</li><li>Samalova, M., Brzobohaty, B., Moore, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pOp6/LhGR:+a+stringently+regulated+and+highly+responsive+dexamethasone-inducible+gene+expression+system+for+tobacco.">pOp6/LhGR: a stringently regulated and highly responsive dexamethasone-inducible gene expression system for tobacco.</a> The Plant Journal. 41 (6), 919-935 (2005).</li><li>Picard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steroid-binding+domains+for+regulating+the+functions+of+heterologous+proteins+in+cis.">Steroid-binding domains for regulating the functions of heterologous proteins in cis.</a> Trends in Cell Biology. 3 (8), 278-280 (1993).</li><li>Schurholz, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comprehensive+Toolkit+for+Inducible,+Cell+Type-Specific+Gene+Expression+in+Arabidopsis.">A Comprehensive Toolkit for Inducible, Cell Type-Specific Gene Expression in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 178 (1), 40-53 (2018).</li><li>Kubo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+switches+for+protoxylem+and+metaxylem+vessel+formation.">Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation.</a> Genes and Development. 19 (16), 1855-1860 (2005).</li><li>Di Laurenzio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SCARECROW+gene+regulates+an+asymmetric+cell+division+that+is+essential+for+generating+the+radial+organization+of+the+Arabidopsis+root.">The SCARECROW gene regulates an asymmetric cell division that is essential for generating the radial organization of the Arabidopsis root.</a> Cell. 86 (3), 423-433 (1996).</li><li>Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+SCARECROW+function+reveals+a+radial+patterning+mechanism+common+to+root+and+shoot.">Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot.</a> Development. 127 (3), 595-603 (2000).</li><li>Hellens, R. P., Edwards, E. A., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pGreen:+a+versatile+and+flexible+binary+Ti+vector+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation.">pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Plant Molecular Biology. 42 (6), 819-832 (2000).</li><li>Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana+using+the+floral+dip+method.">Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method.</a> Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).</li><li>Kleinboelting, N., Huep, G., Kloetgen, A., Viehoever, P., Weisshaar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABI-Kat+SimpleSearch:+new+features+of+the+Arabidopsis+thaliana+T-DNA+mutant+database.">GABI-Kat SimpleSearch: new features of the Arabidopsis thaliana T-DNA mutant database.</a> Nucleic Acids Research. 40 (Database issue), D1211-D1215 (2012).</li><li>. Selection scheme used at GABI-Kat for resistance to sulfadiazine Available from: <a target="_blank" href="https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html">https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html</a> (2018)</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+addition+quantitative+real-time+PCR+(SAQPCR):+a+novel+approach+for+determination+of+transgene+copy+number+avoiding+PCR+efficiency+estimation.">Standard addition quantitative real-time PCR (SAQPCR): a novel approach for determination of transgene copy number avoiding PCR efficiency estimation.</a> PLoS One. 8 (1), e53489 (2013).</li><li>Wallner, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strigolactone-+and+Karrikin-Independent+SMXL+Proteins+Are+Central+Regulators+of+Phloem+Formation.">Strigolactone- and Karrikin-Independent SMXL Proteins Are Central Regulators of Phloem Formation.</a> Current Biology. 27 (8), 1241-1247 (2017).</li><li>Fletcher, J. C., Brand, U., Running, M. P., Simon, R., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+of+cell+fate+decisions+by+CLAVATA3+in+Arabidopsis+shoot+meristems.">Signaling of cell fate decisions by CLAVATA3 in Arabidopsis shoot meristems.</a> Science. 283 (5409), 1911-1914 (1999).</li><li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cellulose+synthases+in+Arabidopsis+secondary+cell+walls.">Visualization of cellulose synthases in Arabidopsis secondary cell walls.</a> Science. 350 (6257), 198-203 (2015).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VASCULAR-RELATED+NAC-DOMAIN6+and+VASCULAR-RELATED+NAC-DOMAIN7+effectively+induce+transdifferentiation+into+xylem+vessel+elements+under+control+of+an+induction+system.">VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN6 and VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN7 effectively induce transdifferentiation into xylem vessel elements under control of an induction system.</a> Plant Physiology. 153 (3), 906-914 (2010).</li><li>Engineer, C. B., Fitzsimmons, K. C., Schmuke, J. J., Dotson, S. B., Kranz, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+a+Gal4-mediated+LUC/GFP/GUS+enhancer+trap+system+in+Arabidopsis.">Development and evaluation of a Gal4-mediated LUC/GFP/GUS enhancer trap system in Arabidopsis.</a> BMC Plant Biology. 5, 9 (2005).</li><li>Aoyama, T., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glucocorticoid-mediated+transcriptional+induction+system+in+transgenic+plants.">A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants.</a> The Plant Journal. 11 (3), 605-612 (1997).</li><li>Decaestecker, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-TSKO+facilitates+efficient+cell+type-,+tissue-,+or+organ-specific+mutagenesis+in+Arabidopsis.">CRISPR-TSKO facilitates efficient cell type-, tissue-, or organ-specific mutagenesis in Arabidopsis.</a> bioRxiv. , (2018).</li></ol>

Aquí, describimos los pasos necesarios para generar y aplicar una herramienta versátil y completa de células inducibles, tipo específico trans-activación. Cruzando líneas llevar casetes efector bajo control del promotor pOp con líneas controlador permite estudiar los efectos de la expresión errónea en la generación F1, lo que permite la evaluación rápida de perturbación genética en una amplia gama de tipos celulares. Alternativamente, construcciones efector pueden utilizarse para transform...

Una limitación importante en biología en la era postgenómica es descifrar el papel específico del contexto de un determinado factor o perturbación genética. Perturbaciones genéticas constitutivas como los enfoques de la función de pérdida y ganancia de función a menudo sólo permiten el análisis de punto final de los procesos de adaptación permanente, ofuscación de la distinción entre efectos primarios y secundarios. Además, funciones específicas de contexto pueden ser enmascaradas o diluidas por efectos de gran escala en los tejidos distantes o durante otras fases del desarrollo. Por otra parte, en casos extremos, la mortalidad puede impedir cualquier idea mecanicista. Idealmente, para evitar estos problemas, uno podría analizar el efecto de perturbación genética aguda dentro de un contexto específico como un tipo de células específicas de una manera tiempo-resolved. Para lograr esto, herramientas genéticas de expresión inducible, de tipo específico de célula son necesarios1. Para proporcionar un recurso para la evaluación rápida de la dinámica espacio-temporal de una respuesta a un determinado efector, hemos combinado la facilidad de clonación proporcionados por el sistema de GreenGate2 con la eficacia probada de la GR-LhG4 sistema3, 4,5,6. Hemos generado un conjunto de líneas que expresan el factor de transcripción quimérica LhG4 fusionados con el dominio de unión de ligando de la rata por corticoides tópicos del receptor (GR)7 bajo el control de la célula bien caracterizado tipo promotores específicos8. En condiciones de reposo, el factor de transcripción permanece fuera del núcleo, como el dominio GR está limitado por la HSP90 citosólica. Con la adición de dexametasona (Dex) de ligando sintético, se induce translocación nuclear y LhG4 se median la transcripción de las cassettes de expresión bajo control de un promotor de cognado sintético tipo pOp , como un reportero de mTurquoise2 dentro de las líneas piloto para visualizar el dominio de la expresión después de la inducción.  Así, las líneas de conductor técnico también contienen un casete del efector. El cruce de un conjunto de líneas de conductor con una línea con un casete de efectores con, por ejemplo, un gen de interés bajo el control del mismo tipo de pOp promotor así permite la evaluación rápida de las consecuencias agudas o a largo plazo de la expresión de efector en una amplia gama de tipos celulares.
Presentamos un protocolo que describe los procedimientos necesarios para generar las líneas de controlador y generador de efectos y demostrar cómo expresión específica de tipo celular puede ser inducida y seguida en el meristemo apical de brote, el meristemo apical de raíz y el cambium de Arabidopsis. Para ilustrar la destreza y la especificidad de este enfoque, utilizamos el factor de transcripción conocido VND7 que es capaz de conducir ectopically engrosamientos de pared de célula secundaria de xilema como9. Tratamiento de la F1 de un cruce entre la línea de conductor11 pSCR10,y la línea de efectos de pOp6:VND7 conduce a la formación ectópica xilema-como las células de la vaina de almidón células de Arabidopsis del tallo.
Para facilitar la generación de grandes conjuntos de ADN necesaria para la construcción de plásmidos de expresión controlador y generador de efectos, utilizamos la rápida y eficiente GreenGate clonación método2. Clonación de GreenGate es basado en enzimas de restricción tipo II S como Eco31I o su isoschizomer Bsay2. Estas enzimas cortan río abajo de sus sitios de reconocimiento asimétrica produciendo proyecciones con diferentes composición de base. Mediante la incorporación de Eco31I /Bsasitios de restricción en oligonucleótidos y asignar secuencias de proyección específica para elementos de ADN, clonación modular se obtiene, facilitando la generación de grandes ensamblajes. En el marco de GreenGate, módulos de ADN se dividen en categorías A-F basado en proyección de la secuencia que sirven como adaptadores y se montan en ese orden. Por lo tanto, los cebadores diseñados para amplificar el producto deseado deben ser según el módulo seleccionado2 (figura 1A). Si hay una interna Eco31IBsadel sitio y la secuencia no es compatible con los módulos de entrada y destino de GreenGate, puede continuar sin mutagenizing, pero con menor eficiencia. Como alternativa, utilice mutagénesis sitio-dirigida para quitar Eco31I /Bsasitios de restricción teniendo cuidado de no para cambiar los aminoácidos en los productos del gene.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>K029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Column purification</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit (250)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture chamber for imaging</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG</td>
			<td>1-well tissue culture chamber, on cover glass II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>D139-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eco31I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FD0294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>injection cannula (0.30 x 12 mm, 30 G x 1/2)</td>
			<td>Sterican, Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>T832.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO lambda blue 63x water immersion objectiv</td>
			<td>Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS medium</td>
			<td>Duchefa, Haarlem, Netherlands</td>
			<td>M0221.0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x&#160; 1.1 NA water immersion objective</td>
			<td>Nikon, Minato, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35/10 mm</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Germany</td>
			<td>627102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60/150 mm</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Germany</td>
			<td>628102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 120/120/17</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Germany</td>
			<td>688102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant agar</td>
			<td>Duchefa, Haarlem, Netherlands</td>
			<td>P1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid extraction</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide (PI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razorblade</td>
			<td>Classic, Wilkinson Sword GmbH</td>
			<td>7005115E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tubes</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silwet L-77</td>
			<td>Kurt Obermeier GmbH &#38; Co. KG, Bad Berleburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>3834.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NanoDrop 2000c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfadiazine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>2228.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Ligase 5 U/&#181;l</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Ligase 30 U/&#181;l</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EL0013</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducible, cell type-specific expression in arabidopsis thaliana through lhgr-mediated trans-activation

Expresión inducible, tejidos específicos es una herramienta importante y poderosa para el estudio de la dinámica espacio-temporal de la perturbación genética. Combinando el GreenGate flexible y eficiente con el probada y éxitosos LhGR sistema (aquí denominado GR-LhG4) para la expresión inducible de clonación, hemos generado un conjunto de líneas transgénicas de Arabidopsis que puede conducir a la expresión de una unidad de efectos cassette en una gama de tipos específicos de la célula en los meristems planta principal tres. Para ello, elegimos el sistema GR-LhG4 previamente desarrollado basado en un factor de transcripción quimérica y un promotor de cognado pOp tipo garantizando un control estricto sobre una amplia gama de niveles de expresión. Además, para visualizar el dominio de expresión donde está activo el factor de transcripción sintética, un reportero fluorescente mTurquoise2 ER localizada bajo el control del promotor pOp4 o pOp6 está codificado en líneas de controlador. Aquí, describimos los pasos necesarios para generar una línea de conductor o efectoras y demostrar cómo expresión específica de tipo celular puede ser inducida y seguida en el meristemo apical de brote, el meristemo apical de raíz y el cambium de Arabidopsis. Mediante conductor varias o todas las líneas, el efecto específico del contexto de expresar uno o varios factores (efectores) bajo control del promotor sintético pOp puede evaluarse rápidamente, por ejemplo en las plantas de la F1 de un cruce entre un generador de efectos y múltiples líneas de controlador. Este enfoque se ejemplifica por la expresión ectópica de VND7, un factor de transcripción NAC capaces de inducir la deposición de pared de célula secundaria ectópico de manera autónoma de la célula.

Generación de líneas de controlador y efectoras a través de clonación de GreenGate
GreenGate sistema de clonación se basa en GoldenGate la clonación y el uso del endonuclease de la restricción de tipo IIS BsaI o su isoschizomer Eco31I. Como los enzima produce voladizos distante desde su sitio de reconocimiento asimétrico, la composición base de los voladizos pueden ser libremente elegido, que es la base forma la modularidad del sistema. Cada elemento...

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Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducibles, expresión de específicas del tipo celular en Arabidopsis thaliana mediada a través de LhGR Trans-activación

Aquí, describimos la generación y aplicación de un conjunto de transgénicas de Arabidopsis thaliana líneas de expresión inducible, tejidos específicos que en los tres principales meristemos, el meristemo apical de brote, el meristemo apical de raíz y el cambium.

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

El objetivo clave en la biología del desarrollo es comprender el papel específico del contexto de un gen. Y esto puede ser difícil de lograr por mutantes nocaut convencionales o por líneas de sobreexpresión constitutivas. Utilizamos el sistema modular de clonación de puertas verdes para generar un recurso para la expresión citoespecífiada inducible en los tres meristemas principales de la planta modelo Arabidopsis thaliana.Utilizando la misma estrategia de clonación modular, este método se puede aplicar a otras especies vegetales que son inmutables a la transformación. La demostración visual de este procedimiento es valiosa porque analizar el efecto de la trans-activación en los meristems del tallo y el ápice corto requiere disección antes de la toma de imágenes, lo que puede ser bastante difícil. Para empezar, esterilizar las semillas como se describe en el protocolo de texto.A continuación, prepara el medio Murashige y Skoog de media fuerza a pH 5.8 y añade una sacarosa del uno por ciento y un 0,9%. Después del autoclave, añadir Dex disuelto en DMSO a las placas de inducción a una concentración final entre 10 y 30 micromolares. Agregue una cantidad igual de DMSO a las placas de control.Ponga las semillas para imágenes de raíz en las placas y estratifique durante 48 horas en la oscuridad y a cuatro grados centígrados. Coloque las placas en posición vertical en una incubadora de plantas y córtelas durante cinco días. Cinco días después de la germinación, utilice la microscopía de escaneo láser confocal para tomar imágenes de las plántulas.Para comenzar, preparar y cultivar las semillas como se describe en el protocolo de texto. De seis a siete días después de la germinación, transfiera cada plántula al suelo en una olla separada. Si induce las plantas por riego, utilice una solución de 25 micromolares DEX en agua, preparada a partir de un stock de 25 dex mililitrorios disuelto en etanol.Agua cada dos o tres días hasta el momento deseado de inducción. Si se induce sumergiendo, prepare un vaso de precipitados de un litro con 750 mililitros de agua que contengan 0,02%Silwet L77 y DEX a 25 micromolares de concentración final o una cantidad equivalente de DMSO para el DEX y el tratamiento simulado. Sumerja una sola planta en la solución de inducción o simulacro durante 30 segundos.Repita cada dos o tres días, hasta el momento deseado de la toma de imágenes. Para comenzar, preparar y cultivar las semillas como se describe en el protocolo de texto. De seis a siete días después de la germinación, transfiera cada plántula al suelo en una olla separada.Cuando el tallo mida alrededor de un centímetro de largo, rocíe el SAM influorescente con entre 10 y 50 micromolares de solución DEX en agua. Para la inducción y la toma de imágenes en etapas posteriores del desarrollo, induzca a los SAM de tallos más largos o brotes laterales. 24 a 48 horas después de la inducción, disecciona los SAM y proceder a la toma de imágenes.En primer lugar, transfiera las plántulas de la placa a una solución de 10 microgramos por mililitro de yoduro propidium y contraténlas durante cinco minutos. Coloque las raíces en una cámara de imágenes del microscopio e újelas con un microscopio de escaneo láser confocal con un objetivo de inmersión en agua de 63x. Para visualizar la fluorescencia de yoduro de propídico, utilice una longitud de onda de excitación de 488 nanómetros y recopile emisiones entre 590 y 660 nanómetros.Para la fluorescencia mTurquoise2, utilice la excitación de 458 nanómetros y recopile la emisión entre 460 y 615 nanómetros mediante escaneo secuencial. Primero, fija un tallo con un dedo en el lado opuesto de la sección deseada. Con una cuchilla de afeitar, corte un segmento de aproximadamente tres centímetros y realice varios cortes finos.Enjuague la cuchilla de afeitar en un plato de Petri que contenga agua del grifo y recoja las secciones del tallo. Puede manchar las secciones o montarlas directamente en las diapositivas del microscopio. Para la tinción, prepare un mililitro de una solución de 250 microgramos por mililitro de yoduro propidium en un tubo de reacción.Retire el agua del grifo del plato Petri con una pipeta y reemplácela con la solución de yoduro propidium y manche durante cinco minutos. A continuación, retire la solución de yoduro propidium y enjuague con agua. Con fórceps finos o un pincel fino, transfiera las secciones teñidas a las diapositivas del microscopio.Utilice un microscopio de escaneo láser confocal con una lente de inmersión de agua de inmersión de 25x para tomar imágenes de las muestras. Utilice una luz láser de 561 nanómetros para excitar la fluorescencia de yoduro propidium y recoger la emisión de 570 a 620 nanómetros. Utilice una luz láser de 405 nanómetros para excitar el efector de fluoróforo mTurquoise2 codificado por las construcciones de la línea del controlador y recoger las emisiones de 425 a 475 nanómetros.Primero, usa fórceps para cortar el tallo dos centímetros por debajo de la punta del brote. Sostenga el tallo en una mano y use fórceps finos para eliminar los brotes de flores y la primordia grande. Para eliminar la primordia joven, fije el SAM en posición vertical en un plato de Petri que contenga un tres por ciento de agarosa.A continuación, utilice un binocular y fórceps para eliminar cualquier primordia joven cerca del SAM. Transfiera el SAM diseccionado a un tubo que contenga una solución de 250 microgramos por mililitro de yoduro propidium. Deje que la muestra se manche durante cinco a 10 minutos mientras se asegura de que la muestra permanezca completamente sumergida durante el procedimiento de tinción.Coloque el SAM manchado en un plato pequeño de Petri que contenga un medio de agarosa del tres por ciento. Cubra el SAM con agua destilada doble. Utilice un microscopio de escaneo láser confocal equipado con una lente de inmersión de agua de inmersión de 25x para crear imágenes de los SAM diseccionados.Utilice una luz láser de 561 nanómetros para excitar la fluorescencia de yoduro propidium y recoger emisiones de 570 a 620 nanómetros. Utilice una luz láser de 405 nanómetros para excitar el fluoróforo mTurquoise2 y recoger la emisión de 425 a 475 nanómetros. Grabe pilas de imágenes que abarcan 50 micrómetros en la dirección Z con un tamaño de paso de 0,5 micrómetros.La inducción con DEX conduce a la expresión mTurquoise2 específica de tipo celular en la raíz endodermis los precursores de phloem y cambium, y las células madre en el meristem apical de brote. Como caso de prueba para la transactivación, se genera una línea de efector que codifica el factor de transcripción maestra de muro de celda secundario VND7 fusionado con el dominio de activación V16. Después de cinco días de tratamiento único con 15 microlitros de DEX o DMSO, las secciones del tallo se preparan para la visualización de la lignificación ectópica en la vaina inicial.Las células de vaina inicial en muestras inducidas muestran una señal fuerte para el canal de yoduro de propidio y algunas células muestran el típico engrosamiento reticulado de la pared celular en las células del xilem. Después de ver este video, usted debe tener una comprensión clara de cómo inducir la expresión génica en diferentes tejidos y cómo preparar sus muestras para la toma de imágenes. Siguiendo este procedimiento, las líneas de conductor establecidas se pueden utilizar con una amplia variedad de construcciones de efectores generadas por otros usuarios de acuerdo con sus intereses de investigación.Este atajo debe ayudar a los investigadores de plantas a evaluar rápidamente el efecto de la expresión específica de tipo celular o la eliminación de un gen de interés de una manera reservada en el tiempo. Este sistema de inducción específico de tipo celular requiere el uso de la dexametasona corticosteroide. Se debe evitar el contacto directo, por lo que es importante usar guantes y una mascarilla facial durante el tratamiento.

Research

JoVE Journal

Genetics

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

The Terroir Concept Interpreted through Grape Berry Metabolomics and Transcriptomics

El concepto Terroir interpretada a través de baya de la uva metabolómica y transcriptómica

Terroir refers to the combination of environmental factors that affect the characteristics of crops such as grapevine (Vitis vinifera) according to ...

Investigación

Genética

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

La medición paralela de la expresión de genes circadianos del reloj y Hormona en cultivos celulares primarios humanos

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

Una sola célula de la expresión génica utilizando multiplex RT-qPCR para caracterizar heterogeneidad de las poblaciones linfoides Raras

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

La cría y el doble-stranded RNA mediada gen desmontables en el Hide Escarabajo,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Inducible T7 RNA polimerasa mediada Multigene Expression System, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Una sola célula de perfiles de expresión génica El uso de FACS y qPCR con las Normas Internas

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Expresión Ion Channel controlable a través de la transfección transitoria inducible

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

Estudio de la expresión genética regulada por el ciclo celular mediante dos protocolos complementarios de sincronización celular

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Sistemas inducibles y constitutivos para la modificación genética In Vivo de hepatocitos de ratón mediante la inyección en la vena hidrodinámica cola

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Un método de Optogenetic para controlar y analizar patrones de expresión génica en las interacciones célula a célula

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...