Name: inducible, cell type-specific expression in arabidopsis thaliana through lhgr-mediated trans-activation
Uploaded: 2019-04-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation at JoVE.com

Arbete i våra laboratorier stöds av tyska Research Foundation (DFG) bidrag WO 1660/6-1 (till S.V.) och GR 2104/4-1 (till T.G.) och SFB1101 (till T.G. och J.U.L) och av ett europeiskt forskningsråd consolidator bevilja (PLANTSTEMS 647148) till T.G.  S.V. stöds genom Emmy Noether gemenskap av DFGEN genom Grant WO 1660/2.

Vektorer och moduler kan erhållas från ideella databasen, Addgene (https://www.addgene.org).
1. kloning använder GreenGate
<ol><li>Design grundfärger med överhäng anges i tabell 1, ersätta 'NNNN' med modul typspecifika adapter sekvenser som anges nedan: fram: 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) CA* + sekvensk 3´, omvänd: 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) + omvänd komplement till specifik sekvens 3´. Lägg till de understrukna baserna för att säkerställa underh?...

<ol>
	<li>Moore, I., Samalova, M., Kurup, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivated+and+chemically+inducible+gene+expression+in+plants.">Transactivated and chemically inducible gene expression in plants.</a> The Plant Journal. 45 (4), 651-683 (2006).</li><li>Lampropoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GreenGate---a+novel,+versatile,+and+efficient+cloning+system+for+plant+transgenesis.">GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis.</a> PLoS One. 8 (12), e83043 (2013).</li><li>Baroux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictable+activation+of+tissue-specific+expression+from+a+single+gene+locus+using+the+pOp/LhG4+transactivation+system+in+Arabidopsis.">Predictable activation of tissue-specific expression from a single gene locus using the pOp/LhG4 transactivation system in Arabidopsis.</a> Plant Biotechnology Journal. 3 (1), 91-101 (2005).</li><li>Craft, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+pOp/LhG4+vectors+for+stringent+glucocorticoid-dependent+transgene+expression+in+Arabidopsis.">New pOp/LhG4 vectors for stringent glucocorticoid-dependent transgene expression in Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 41 (6), 899-918 (2005).</li><li>Moore, I., Galweiler, L., Grosskopf, D., Schell, J., Palme, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcription+activation+system+for+regulated+gene+expression+in+transgenic+plants.">A transcription activation system for regulated gene expression in transgenic plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (1), 376-381 (1998).</li><li>Samalova, M., Brzobohaty, B., Moore, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pOp6/LhGR:+a+stringently+regulated+and+highly+responsive+dexamethasone-inducible+gene+expression+system+for+tobacco.">pOp6/LhGR: a stringently regulated and highly responsive dexamethasone-inducible gene expression system for tobacco.</a> The Plant Journal. 41 (6), 919-935 (2005).</li><li>Picard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steroid-binding+domains+for+regulating+the+functions+of+heterologous+proteins+in+cis.">Steroid-binding domains for regulating the functions of heterologous proteins in cis.</a> Trends in Cell Biology. 3 (8), 278-280 (1993).</li><li>Schurholz, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comprehensive+Toolkit+for+Inducible,+Cell+Type-Specific+Gene+Expression+in+Arabidopsis.">A Comprehensive Toolkit for Inducible, Cell Type-Specific Gene Expression in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 178 (1), 40-53 (2018).</li><li>Kubo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+switches+for+protoxylem+and+metaxylem+vessel+formation.">Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation.</a> Genes and Development. 19 (16), 1855-1860 (2005).</li><li>Di Laurenzio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SCARECROW+gene+regulates+an+asymmetric+cell+division+that+is+essential+for+generating+the+radial+organization+of+the+Arabidopsis+root.">The SCARECROW gene regulates an asymmetric cell division that is essential for generating the radial organization of the Arabidopsis root.</a> Cell. 86 (3), 423-433 (1996).</li><li>Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+SCARECROW+function+reveals+a+radial+patterning+mechanism+common+to+root+and+shoot.">Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot.</a> Development. 127 (3), 595-603 (2000).</li><li>Hellens, R. P., Edwards, E. A., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pGreen:+a+versatile+and+flexible+binary+Ti+vector+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation.">pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Plant Molecular Biology. 42 (6), 819-832 (2000).</li><li>Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana+using+the+floral+dip+method.">Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method.</a> Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).</li><li>Kleinboelting, N., Huep, G., Kloetgen, A., Viehoever, P., Weisshaar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABI-Kat+SimpleSearch:+new+features+of+the+Arabidopsis+thaliana+T-DNA+mutant+database.">GABI-Kat SimpleSearch: new features of the Arabidopsis thaliana T-DNA mutant database.</a> Nucleic Acids Research. 40 (Database issue), D1211-D1215 (2012).</li><li>. Selection scheme used at GABI-Kat for resistance to sulfadiazine Available from: <a target="_blank" href="https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html">https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html</a> (2018)</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+addition+quantitative+real-time+PCR+(SAQPCR):+a+novel+approach+for+determination+of+transgene+copy+number+avoiding+PCR+efficiency+estimation.">Standard addition quantitative real-time PCR (SAQPCR): a novel approach for determination of transgene copy number avoiding PCR efficiency estimation.</a> PLoS One. 8 (1), e53489 (2013).</li><li>Wallner, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strigolactone-+and+Karrikin-Independent+SMXL+Proteins+Are+Central+Regulators+of+Phloem+Formation.">Strigolactone- and Karrikin-Independent SMXL Proteins Are Central Regulators of Phloem Formation.</a> Current Biology. 27 (8), 1241-1247 (2017).</li><li>Fletcher, J. C., Brand, U., Running, M. P., Simon, R., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+of+cell+fate+decisions+by+CLAVATA3+in+Arabidopsis+shoot+meristems.">Signaling of cell fate decisions by CLAVATA3 in Arabidopsis shoot meristems.</a> Science. 283 (5409), 1911-1914 (1999).</li><li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cellulose+synthases+in+Arabidopsis+secondary+cell+walls.">Visualization of cellulose synthases in Arabidopsis secondary cell walls.</a> Science. 350 (6257), 198-203 (2015).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VASCULAR-RELATED+NAC-DOMAIN6+and+VASCULAR-RELATED+NAC-DOMAIN7+effectively+induce+transdifferentiation+into+xylem+vessel+elements+under+control+of+an+induction+system.">VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN6 and VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN7 effectively induce transdifferentiation into xylem vessel elements under control of an induction system.</a> Plant Physiology. 153 (3), 906-914 (2010).</li><li>Engineer, C. B., Fitzsimmons, K. C., Schmuke, J. J., Dotson, S. B., Kranz, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+a+Gal4-mediated+LUC/GFP/GUS+enhancer+trap+system+in+Arabidopsis.">Development and evaluation of a Gal4-mediated LUC/GFP/GUS enhancer trap system in Arabidopsis.</a> BMC Plant Biology. 5, 9 (2005).</li><li>Aoyama, T., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glucocorticoid-mediated+transcriptional+induction+system+in+transgenic+plants.">A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants.</a> The Plant Journal. 11 (3), 605-612 (1997).</li><li>Decaestecker, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-TSKO+facilitates+efficient+cell+type-,+tissue-,+or+organ-specific+mutagenesis+in+Arabidopsis.">CRISPR-TSKO facilitates efficient cell type-, tissue-, or organ-specific mutagenesis in Arabidopsis.</a> bioRxiv. , (2018).</li></ol>

Här, vi beskriver stegen för att skapa och tillämpa en mångsidig och omfattande verktygslåda för inducerbara, cell typ specifika trans-aktivering. Passerar linjer som transporterar effektor kassetter under kontroll av promotorn pOp med drivrutinen linjer kan studera mis uttryck effekter i F1-generationen, möjliggör en snabb bedömning av genetisk störning i en rad olika celltyper. Alternativt, effektor konstruktioner kan användas för att omvandla driver linjer eller genom att anpassa kloning ...

En stor begränsning i biologi i den postgenomic eran är att dechiffrera sammanhang specifika roll en given faktor eller genetisk störning. Konstituerande genetiska störningar såsom förlust-av-funktion och gain-of-function strategier ofta endast tillåta slutpunkten analys av livslångt anpassning processer, fördunklar distinktionen mellan primära och sekundära effekter. Dessutom kan sammanhang specifika funktioner maskeras eller utspädd av storskaliga effekter i avlägsna vävnader eller under övriga faser av utveckling. Dessutom i extrema fall, kan dödlighet hindra någon mekanistisk insikt. Idealiskt, för att kringgå dessa frågor, kan man analysera effekten av akut genetisk störning inom ett visst sammanhang såsom en viss celltyp i en tid-löst sätt. För att uppnå detta, är genetiska verktyg för inducerbara, cell typspecifika uttryck krävs1. För att ge en resurs för snabb bedömning av spatiotemporal dynamiken i ett svar på en viss effektor, har vi kombinerat lättheten av kloning som tillhandahålls av GreenGate system2 med beprövade effekten av GR-LhG4 system3, 4,5,6. Vi har skapat en uppsättning rader som uttrycker den chimära Transkriptionfaktorn LhG4 smält till ligand bindande domänen av råtta kortikoid receptor (GR)7 under kontroll av välkarakteriserad cell typ specifika initiativtagare8. I vilande tillstånd, förblir transkriptionsfaktor utanför cellkärnan, som GR domänen är bunden av den cytosoliska HSP90. Med tillägg av syntetiska ligand dexametason (Dex), translokationen i cellkärnan induceras och LhG4 kommer att medla transkription av uttrycket kassetter under kontroll av ett cognate syntetiska pOp-typ Promotorn, såsom en mTurquoise2 reporter ingår i raderna föraren att visualisera domänen uttryck efter induktion.  Således driver raderna tekniskt innehåller också en effektor-kassett. Passage av en uppsättning driver linjerna med en linje som bära en effektor kassett med, till exempel en gen av intresse under samma pOp-typ Promotorns kontroll således tillåter snabb bedömning av de akuta eller långsiktiga konsekvenserna av effektor uttryck i en mängd olika celltyper.
Här, tillhandahåller vi ett protokoll som beskriver förfarandena som är nödvändiga att generera raderna drivrutin och effektor och demonstrera hur cellen typ uttryck kan inducerad och följt av skjuta apical meristem, av roten apical meristem och cambium av Arabidopsis. För att illustrera den skicklighet och specificitet av denna strategi, vi använder den välkända transkriptionsfaktor VND7 som kan köra xylem-liknande sekundär cell wall thickenings ectopically9. Behandling av F1 från en korsning mellan pSCR10,11 driver linjen och pOp6:VND7 effektor linjen leder till bildandet av ektopisk xylem-liknande celler i stärkelse skidan celler av de Arabidopsis stam.
Om du vill underlätta genereringen av stora DNA-sammansättningar som krävs för att konstruera drivrutin och effektor uttryck plasmider, använde vi den snabbt och effektivt GreenGate kloning metod2. GreenGate kloning är baserat på typ II S restriktionsenzym såsom Eco31I eller dess isoschizomer BsaI2. Dessa enzymer skära downstream av deras asymmetriska erkännande webbplatser producerar överhäng med varierande bas sammansättning. Genom att införliva Eco31I /Bsajag begränsning platser i oligonukleotider och att tilldela specifika överhäng sekvenser till DNA-element, modulära kloning uppnås, att underlätta genereringen av stora sammanställningar. Inom ramen för GreenGate faller DNA moduler kategorier A-F baserat på överhäng sekvens som fungera som adaptrar och är monterade i den ordningen. Primers för att förstärka din önskade produkt bör därför enligt vald modul i2 (figur 1A). Om det finns en inre Eco31I /Bsajag webbplats och sekvensen är inte kompatibel med modulerna GreenGate inträde och destination, kan du gå vidare utan mutagenizing, men med lägre effektivitet. Alternativt använda webbplats riktad mutagenes ta bort Eco31I /Bsajag begränsning platser utan för att ändra aminosyror i genprodukter.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>K029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Column purification</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit (250)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture chamber for imaging</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG</td>
			<td>1-well tissue culture chamber, on cover glass II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>D139-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eco31I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FD0294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>injection cannula (0.30 x 12 mm, 30 G x 1/2)</td>
			<td>Sterican, Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>T832.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO lambda blue 63x water immersion objectiv</td>
			<td>Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS medium</td>
			<td>Duchefa, Haarlem, Netherlands</td>
			<td>M0221.0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x&#160; 1.1 NA water immersion objective</td>
			<td>Nikon, Minato, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35/10 mm</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Germany</td>
			<td>627102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60/150 mm</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Germany</td>
			<td>628102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 120/120/17</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Germany</td>
			<td>688102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant agar</td>
			<td>Duchefa, Haarlem, Netherlands</td>
			<td>P1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid extraction</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide (PI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razorblade</td>
			<td>Classic, Wilkinson Sword GmbH</td>
			<td>7005115E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tubes</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silwet L-77</td>
			<td>Kurt Obermeier GmbH &#38; Co. KG, Bad Berleburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>3834.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NanoDrop 2000c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfadiazine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>2228.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Ligase 5 U/&#181;l</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Ligase 30 U/&#181;l</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EL0013</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducible, cell type-specific expression in arabidopsis thaliana through lhgr-mediated trans-activation

Inducerbara, vävnadsspecifika uttryck är ett viktigt och kraftfullt verktyg för att undersöka genetisk störning plats och tid dynamik. Kombinera den flexibla och effektiva GreenGate kloning system med beprövade och benchmarking LhGR systemet (här kallas GR-LhG4) för inducerbara uttrycket, har vi genererat en uppsättning transgena Arabidopsis linjer som kan köra uttrycket av en effektor kassett i en rad specifika celltyper i de tre viktigaste växt meristems. Därför valde vi i tidigare utvecklade GR-LhG4 system baserat på en chimär transkriptionsfaktor och cognate pOp-typ förespråkare att säkerställa tight kontroll över ett brett spektrum av uttryck nivåer. Dessutom för att visualisera uttryck domänen där den syntetiska transkriptionsfaktor är aktiv, är en ER-lokaliserad mTurquoise2 fluorescerande reporter under kontroll av promotorn pOp4 eller pOp6 kodad i drivrutinen linjer. Här, beskriver vi stegen som krävs för att generera en drivrutin eller effektor linje och demonstrera hur cellen typ uttryck kan inducerad och följt av skjuta apical meristem, av roten apical meristem och cambium av Arabidopsis. Med hjälp av flera eller alla förare linjer, sammanhang effekten att uttrycka en eller flera faktorer (effektorer) under kontroll av syntetiska pOp arrangören kan bedömas snabbt, till exempel i F1 växter av en korsning mellan en effektor och flera drivrutinen linjer. Detta tillvägagångssätt exemplifieras av ektopisk uttryck för VND7, en NAC transkriptionsfaktor kan framkalla ektopisk sekundär cell wall nedfall i en cell självständigt sätt.

Generation av föraren och effektor linjer genom GreenGate kloning
Den GreenGate kloning systemet bygger på GoldenGate kloning och använda den typ IIS begränsning Amiiiiin Bsajag eller dess isoschizomer Eco31I. Eftersom enzymet producerar överhäng avlägsen från dess asymmetriska erkännande, bas sammansättningen av överhäng kan vara fritt bildar valda, vilket är grunden Modulariteten av systemet. Varje PCR-genererade element, till exempel en arrang...

Watch this Scientific Journal Video about Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation at JoVE.com

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducerade, Cell typspecifika uttryck i Arabidopsis thaliana genom LhGR-medierad Trans-aktivering

Här beskriver vi generationen och tillämpning av en uppsättning transgena Arabidopsis thaliana linjer möjliggörande inducerbara, vävnadsspecifika uttryck i de tre huvudsakliga meristems, av skjuta apical meristem, av roten apical meristem och Kambium.

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

Det centrala målet inom utvecklingsbiologin är att förstå en gens kontextspecifika roll. Och detta kan vara svårt att uppnå genom konventionella knockout mutanter eller genom att utgöras av överuttryck linjer. Vi använde den modulära gröna grinden kloning systemet för att generera en resurs för inducible cyto-specifika uttryck i de tre viktigaste meristems av modellen anläggningen Arabidopsis thaliana.Med samma modulära kloningsstrategi kan denna metod tillämpas på andra växtarter som är oföränderliga till omvandling. Visuell demonstration av detta förfarande är värdefullt eftersom analysera effekten av transaktivering i meristems av stammen och den korta apex kräver dissekering innan imaging, vilket kan vara ganska utmanande. Till att börja med sterilisera fröna som beskrivs i textprotokollet.Därefter förbereda halv-styrka Murashige och Skoog medium vid pH 5,8 och tillsätt en procent sackaros och 0,9%agar. Tillsätt Dex upplöst i DMSO till induktionsplattorna vid en slutkoncentration mellan 10 och 30 mikromolar efter autoklavering. Lägg till en lika stor mängd DMSO till kontrollplattorna.Sätt fröna för rotavbildning på tallrikar och stratifiera dem i 48 timmar i mörker och vid fyra grader Celsius. Sätt plattorna i vertikalt läge i en växtinkubator och odla dem i fem dagar. Fem dagar efter grobarhet, använd confocal laserscanning mikroskopi för att bilden plantorna.Till att börja med förbereda och odla fröna som beskrivs i textprotokollet. Sex till sju dagar efter grobarhet, överföra varje planta till jord i en separat kruka. Om förmå växterna genom vattning, använd en 25 mikromolar DEX lösning i vatten, beredd från ett lager av 25 millimolar DEX upplöst i etanol.Vatten varannan till var tredje dag tills önskad tidpunkt för induktion. Om inducera genom doppning, förbereda en en-liters bägare med 750 milliliter vatten som innehåller 0,02%Silwet L77 och DEX vid 25 mikromolar slutlig koncentration eller en motsvarande mängd DMSO för DEX och mock behandling. Doppa en enda anläggning i induktions- eller mocklösningen i 30 sekunder.Upprepa varannan till var tredje dag, tills önskad tidpunkt för bildbehandling. Till att börja med förbereda och odla fröna som beskrivs i textprotokollet. Sex till sju dagar efter grobarhet, överföra varje planta till jord i en separat kruka.När stammen är runt en centimeter lång, spraya influorescerande SAM med mellan 10 och 50 mikromolar DEX lösning i vatten. För induktion och bildbehandling i senare utvecklingsstadier, inducera SAMs av längre stjälkar eller sidoskott. 24 till 48 timmar efter induktion, dissekera SAMs och gå vidare till bildbehandling.Först överför plantorna från plattan till en 10 mikrogram per millileterlösning av propidiumdodid och räknar dem i fem minuter. Placera rötterna i ett mikroskop bildbehandling kammare och bild dem med hjälp av en confocal laserscanning mikroskop med en 63x vatten nedsänkning mål. För att visualisera propidium iodidfluorescens, använd en excitation våglängd på 488 nanometer och samla utsläpp mellan 590 och 660 nanometer.För mTurquoise2 fluorescens, använd 458 nanometerupplysning och samla in utsläpp mellan 460 och 615 nanometer med hjälp av sekventiell skanning. Först, fixa en stam med ett finger på motsatt sida av den önskade sektionen. Med hjälp av ett rakblad, skär ett segment på cirka tre centimeter och utföra flera fina nedskärningar.Skölj rakbladet i en petriskål som innehåller kranvatten och samla upp stamsektionerna. Antingen fläcka sektionerna eller direkt montera dem på mikroskop diabilder. För färgning, preparera en milliliter av en 250 mikrogram per milliliter lösning av propidium iodid i ett reaktionsrör.Ta bort kranvattnet från petriskålen med en pipett och ersätt det med propidium-iodidlösningen och fläcken i fem minuter. Ta sedan bort propidiummidlösningen och skölj med vatten. Använda antingen fina tärningar eller en fin pensel, överföra färgade sektioner till mikroskop diabilder.Använd en confocal laserscanning mikroskop med en 25x doppning vatten nedsänkning lins för att bilden proverna. Använd en 561 nanometer laserljus för att excitera propidium iodide fluorescens och samla utsläpp från 570 till 620 nanometer. Använd en 405 nanometer laserljus för att excitera mTurquoise2 fluorofore effektor kodas av föraren linje konstruktioner och samla in utsläpp från 425 till 475 nanometer.Använd först tensen för att skära stammen två centimeter under skottspetsen. Håll stammen i ena handen och använd fina tents för att ta bort blomknopparna och stora primordia. För att ta bort unga primordia, fixera SAM i upprätt läge i en Petri-rätt som innehåller tre procent agaros.Därefter använder en kikare och tivor för att ta bort alla unga primordia nära SAM. Överför den dissekerade SAM till ett rör som innehåller en 250 mikrogram per milliliter lösning av propidium-iodid. Låt provet fläcken i fem till 10 minuter samtidigt se till att provet stannar helt nedsänkt under infärgning förfarandet.Placera den färgade SAM i en liten Petriskål som innehåller tre procent agaros medium. Täck SAM med dubbelt destillerat vatten. Använd en confocal laserscanning mikroskop utrustad med en 25x doppning vatten nedsänkning lins för att bilden de dissekerade SAMs.Använd en 561 nanometer laserljus för att excitera propidium iodide fluorescens och samla in utsläpp från 570 till 620 nanometer. Använd ett 405 nanometerlaserljus för att excitera mTurquoise2-fluorofosoorn och samla in utsläpp från 425 till 475 nanometer. Spela in bildstaplar som spänner över 50 mikrometer i Z-riktningen med stegstorleken 0,5 mikrometer.Induktion med DEX leder till cell-typ specifika mTurquoise2 uttryck i roten endodermis de phloem prekursorer och cambium, och stamcellerna i skott apikala meristem. Som ett testfall för transaktivering genereras en effektorlinje kodning av sekundär cellväggens master transkriptionsfaktor VND7 smält till V16-aktiveringsdomänen. Efter fem dagars enkelbehandling med antingen 15 mikroliter av DEX eller DMSO förbereds stamsektioner för visualisering av den ektopiska lignifieringen i startslänten.Startsläntcellerna i inducerade prover visar en stark signal för propidiumodidkanalen och vissa celler visar den typiska retikulerade förtjockningen av cellväggen i xylem-celler. Efter att ha sett den här videon bör du ha en klar förståelse för hur man inducerar genuttryck i olika vävnader och hur du förbereder dina prover för avbildning. Efter detta förfarande kan de etablerade förarlinjerna användas med en stor mängd olika effektorkonstruktioner som genereras av andra användare enligt deras forskningsintressen.Denna genväg bör hjälpa växtforskare att snabbt bedöma effekten av cell-typ specifika uttryck eller knockdown av en gen av intresse i en tid reserverade sätt. Detta specifika induktionssystem av celltyp kräver användning av kortikosteroiden dexametason. Direktkontakt bör undvikas, så det är viktigt att använda handskar och en ansiktsmask under behandlingen.

Research

JoVE Journal

Genetics

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

The Terroir Concept Interpreted through Grape Berry Metabolomics and Transcriptomics

Den Terroir Concept Tolkad genom Grape Berry Metabolomics och transkriptomik

Terroir refers to the combination of environmental factors that affect the characteristics of crops such as grapevine (Vitis vinifera) according to ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Parallell Mätning av dygnsrytm klocka genuttryck och hormon i mänskliga primära cellkulturer

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

Encelliga genuttryck Använda Multiplex RT-qPCR att karaktärisera Heterogena Sällsynta Lymfoida populationer

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Uppfödning och dubbelsträngade RNA-medierad Gene Knockdown i Hide Beetle,<em&gt; Rävänger</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Inducerbart T7-RNA-polymeras-medierat multigenexpressionssystem, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Encelliga profilering av genuttryck med FACS och qPCR med interna standarder

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Kontrollerbar jonkanalen uttryck genom inducerbara Transient transfektion

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

Studierande cellcykelreglerade genuttryck av två komplementära cellsynkroniseringsprotokoll

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Konstituerande och inducerbara system för genetiska In Vivo modifiering av mus hepatocyter använder hydrodynamiska svans ven injektion

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

En Optogenetic metod för att kontrollera och analysera gen uttrycksmönster i Cell-till-cell interaktioner

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...