Name: inducible, cell type-specific expression in arabidopsis thaliana through lhgr-mediated trans-activation
Uploaded: 2019-04-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation at JoVE.com

Laboratuarlarımızda çalışmalarında Almanca Araştırma Vakfı (DFG) tarafından desteklenen hibe WO 1660/6-1 (S.W.) ve GR 2104/4-1 (TG) ve SFB1101 (için TG ve J.U.L) ve Avrupa Araştırma Konseyi tarafından consolidator vermek (PLANTSTEMS 647148) TG için  S.W. DFG Grant WO 1660/2 aracılığıyla Emmy Noether Kardeşliği aracılığıyla desteklenir.

Vektörel çizimler ve modülleri kar amacı gütmeyen depodan, Addgene (https://www.addgene.org) elde edilebilir.
1. GreenGate kullanarak klonlama
<ol><li>Tablo 1' de listelenen çıkıntılar kullanarak tasarım astar, aşağıda listelenen 'NNNN' modülü türüne özgü adaptör dizileri ile değiştirme: İleri: 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) CA* + belirli sıra 3´, ters: 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) + ters tamamlayıcı belirli sıra 3´. Okuma çerçevesi b...

<ol>
	<li>Moore, I., Samalova, M., Kurup, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivated+and+chemically+inducible+gene+expression+in+plants.">Transactivated and chemically inducible gene expression in plants.</a> The Plant Journal. 45 (4), 651-683 (2006).</li><li>Lampropoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GreenGate---a+novel,+versatile,+and+efficient+cloning+system+for+plant+transgenesis.">GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis.</a> PLoS One. 8 (12), e83043 (2013).</li><li>Baroux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictable+activation+of+tissue-specific+expression+from+a+single+gene+locus+using+the+pOp/LhG4+transactivation+system+in+Arabidopsis.">Predictable activation of tissue-specific expression from a single gene locus using the pOp/LhG4 transactivation system in Arabidopsis.</a> Plant Biotechnology Journal. 3 (1), 91-101 (2005).</li><li>Craft, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+pOp/LhG4+vectors+for+stringent+glucocorticoid-dependent+transgene+expression+in+Arabidopsis.">New pOp/LhG4 vectors for stringent glucocorticoid-dependent transgene expression in Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 41 (6), 899-918 (2005).</li><li>Moore, I., Galweiler, L., Grosskopf, D., Schell, J., Palme, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcription+activation+system+for+regulated+gene+expression+in+transgenic+plants.">A transcription activation system for regulated gene expression in transgenic plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (1), 376-381 (1998).</li><li>Samalova, M., Brzobohaty, B., Moore, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pOp6/LhGR:+a+stringently+regulated+and+highly+responsive+dexamethasone-inducible+gene+expression+system+for+tobacco.">pOp6/LhGR: a stringently regulated and highly responsive dexamethasone-inducible gene expression system for tobacco.</a> The Plant Journal. 41 (6), 919-935 (2005).</li><li>Picard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steroid-binding+domains+for+regulating+the+functions+of+heterologous+proteins+in+cis.">Steroid-binding domains for regulating the functions of heterologous proteins in cis.</a> Trends in Cell Biology. 3 (8), 278-280 (1993).</li><li>Schurholz, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comprehensive+Toolkit+for+Inducible,+Cell+Type-Specific+Gene+Expression+in+Arabidopsis.">A Comprehensive Toolkit for Inducible, Cell Type-Specific Gene Expression in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 178 (1), 40-53 (2018).</li><li>Kubo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+switches+for+protoxylem+and+metaxylem+vessel+formation.">Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation.</a> Genes and Development. 19 (16), 1855-1860 (2005).</li><li>Di Laurenzio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SCARECROW+gene+regulates+an+asymmetric+cell+division+that+is+essential+for+generating+the+radial+organization+of+the+Arabidopsis+root.">The SCARECROW gene regulates an asymmetric cell division that is essential for generating the radial organization of the Arabidopsis root.</a> Cell. 86 (3), 423-433 (1996).</li><li>Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+SCARECROW+function+reveals+a+radial+patterning+mechanism+common+to+root+and+shoot.">Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot.</a> Development. 127 (3), 595-603 (2000).</li><li>Hellens, R. P., Edwards, E. A., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pGreen:+a+versatile+and+flexible+binary+Ti+vector+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation.">pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Plant Molecular Biology. 42 (6), 819-832 (2000).</li><li>Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana+using+the+floral+dip+method.">Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method.</a> Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).</li><li>Kleinboelting, N., Huep, G., Kloetgen, A., Viehoever, P., Weisshaar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABI-Kat+SimpleSearch:+new+features+of+the+Arabidopsis+thaliana+T-DNA+mutant+database.">GABI-Kat SimpleSearch: new features of the Arabidopsis thaliana T-DNA mutant database.</a> Nucleic Acids Research. 40 (Database issue), D1211-D1215 (2012).</li><li>. Selection scheme used at GABI-Kat for resistance to sulfadiazine Available from: <a target="_blank" href="https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html">https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html</a> (2018)</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+addition+quantitative+real-time+PCR+(SAQPCR):+a+novel+approach+for+determination+of+transgene+copy+number+avoiding+PCR+efficiency+estimation.">Standard addition quantitative real-time PCR (SAQPCR): a novel approach for determination of transgene copy number avoiding PCR efficiency estimation.</a> PLoS One. 8 (1), e53489 (2013).</li><li>Wallner, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strigolactone-+and+Karrikin-Independent+SMXL+Proteins+Are+Central+Regulators+of+Phloem+Formation.">Strigolactone- and Karrikin-Independent SMXL Proteins Are Central Regulators of Phloem Formation.</a> Current Biology. 27 (8), 1241-1247 (2017).</li><li>Fletcher, J. C., Brand, U., Running, M. P., Simon, R., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+of+cell+fate+decisions+by+CLAVATA3+in+Arabidopsis+shoot+meristems.">Signaling of cell fate decisions by CLAVATA3 in Arabidopsis shoot meristems.</a> Science. 283 (5409), 1911-1914 (1999).</li><li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cellulose+synthases+in+Arabidopsis+secondary+cell+walls.">Visualization of cellulose synthases in Arabidopsis secondary cell walls.</a> Science. 350 (6257), 198-203 (2015).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VASCULAR-RELATED+NAC-DOMAIN6+and+VASCULAR-RELATED+NAC-DOMAIN7+effectively+induce+transdifferentiation+into+xylem+vessel+elements+under+control+of+an+induction+system.">VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN6 and VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN7 effectively induce transdifferentiation into xylem vessel elements under control of an induction system.</a> Plant Physiology. 153 (3), 906-914 (2010).</li><li>Engineer, C. B., Fitzsimmons, K. C., Schmuke, J. J., Dotson, S. B., Kranz, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+a+Gal4-mediated+LUC/GFP/GUS+enhancer+trap+system+in+Arabidopsis.">Development and evaluation of a Gal4-mediated LUC/GFP/GUS enhancer trap system in Arabidopsis.</a> BMC Plant Biology. 5, 9 (2005).</li><li>Aoyama, T., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glucocorticoid-mediated+transcriptional+induction+system+in+transgenic+plants.">A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants.</a> The Plant Journal. 11 (3), 605-612 (1997).</li><li>Decaestecker, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-TSKO+facilitates+efficient+cell+type-,+tissue-,+or+organ-specific+mutagenesis+in+Arabidopsis.">CRISPR-TSKO facilitates efficient cell type-, tissue-, or organ-specific mutagenesis in Arabidopsis.</a> bioRxiv. , (2018).</li></ol>

Burada, çok yönlü ve kapsamlı araç seti indüklenebilir, hücre türü belirli transiçin görüntüsünü oluşturmak ve gerekli adımları açıklamak-harekete geçirmek. Efektör kaset sürücü satırları ile pOp düzenleyicinin kontrolü altında taşıma hatları geçiş yanlış ifade etkileri geniş bir hücre tiplerinin genetik pertürbasyon hızlı değerlendirilmesi etkinleştirme F1 nesil eğitim sağlar. Alternatif olarak, efektör yapıları sürücü satırları dönüştürmek içi...

Biyolojide önemli bir sınırlama postgenomic dönemde verilen faktörü veya genetik pertürbasyon bağlam belirli rolü deşifre etmektir. Kurucu genetik tedirginlikler işlev kaybı ve işlev kazanç yaklaşımlar gibi genellikle sadece ömür boyu uyum süreçleri, birincil ve ikincil etkileri arasında ayrım obfuscating son nokta analizi sağlar. Buna ek olarak, bağlam belirli işlevleri maskeli veya büyük ölçekli etkileri uzak dokularda veya diğer geliştirme aşamaları ile seyreltilmiş. Ayrıca, aşırı durumlarda, herhangi bir mekanik kavrama ölümcül engel. İdeal olarak, bu sorunları aşmak için bir akut genetik pertürbasyon belirli hücre türü gibi belirli bir bağlam içinde etkisini zaman çözülmüş bir şekilde analiz edebilirsiniz. Bunu başarmak için genetik indüklenebilir, hücre türüne özgü ifade için gerekli1araçlardır. Bir yanıt-e doğru belirli bir efektör kronolojik zamanmekansal dinamikleri hızlı değerlendirilmesi için bir kaynak sağlamak için biz-si olmak kombine tarafından GreenGate sistem2 GR-LhG4 sistemi3, kanıtlanmış etkinliği ile sağlanan klonlama kolaylığı 4,5,6. Biz-si olmak oluşturmak LhG4 ligand bağlayıcı etki iyi karakterize hücre türü belirli rehberleri8kontrol altında fare Kortikoid reseptör (GR)7 erimiş chimeric transkripsiyon faktörü ifade satırlar. GR etki alanı sitozolik HSP90 tarafından bağlı olarak koşulları dinlenme, transkripsiyon faktörü çekirdeği dışında kalır. Sentetik ligand deksametazon (Dex) eklenmesiyle, nükleer translocation indüklenen ve LhG4 transkripsiyon ifadesi kaset bir mTurquoise2 muhabir gibi bir soydaş sentetik pOp-türü düzenleyici denetimi altında arabuluculuk indüksiyon sonra ifade etki alanı görselleştirmek için sürücü satırları dahil.  Böylece, sürücü satırları teknik olarak da bir efektör kaset içerir. Sürücü satırları böylece bir efektör kaset ile örneğin, aynı pOp-türü düzenleyici denetimi altında ilgi bir gen taşıyan bir satırı ile bir dizi geçiş efektör ifade akut veya uzun vadeli sonuçları hızlı bir değerlendirme sağlar içinde çok çeşitli hücre tiplerinin.
Burada, sürücü ve efektör satırları oluşturmak ve nasıl hücre türü belirli ifade indüklenen olabilir ve sürgün apikal meristem, kök apikal meristem ve cambium, takip göstermek için gerekli prosedürleri açıklayan bir protokol sağlar Arabidopsis. Cesaret ve özgüllüğü bu yaklaşım göstermek için biz yararlanmak iyi bilinen transkripsiyon faktörü xylem gibi ikincil hücre duvar thickenings ectopically sürüş yeteneğine sahip olan VND79. PSCR10,11 sürücü çizgi ile pOp6:VND7 efektör çizgi arasında çapraz gelen F1 tedavi Ektopik xylem benzeri hücrelere kök hücre Arabidopsis nişasta kılıf oluşumunu yol açar.
Sürücü ve efektör ifade plazmidleri oluşturmak için gerekli büyük DNA derlemeleri nesil kolaylaştırmak için kullandığımız yöntem2klonlama hızlı ve verimli GreenGate. GreenGate klonlama dayalı tip II S enzimleri Eko31I veya onun isoschizomer Bsagibi ben2. Bu enzimler asimetrik tanıma sitelerinin temel kompozisyon değişen çıkıntılar üreten aşağı akım kesme. Eko31I birleşmeyle tarafından /Bsaben kısıtlama siteleri içinde oligonucleotides ve DNA öğeleri belirli çıkıntı serileri tahsis etme, modüler klonlama, büyük grupları oluşturmayı kolaylaştırmak elde edilir. GreenGate framework, DNA modülleri bağdaştırıcıları olarak hizmet ve bu sıraya göre monte edilir A-F çıkıntı sıralamasına dayanan kategori içine düşmek. Bu nedenle, istenen ürününüzü yükseltmek için tasarlanmış astar seçilen modül2 uygun olarak (şekil 1A) olmalıdır. Bir iç Eko31I / ı siteBsave sırası GreenGate giriş ve hedef modüller ile uyumlu değildir, mutagenizing olmadan, ama daha düşük verimlilik ile devam edebilirsiniz. Alternatif olarak, Eko31I kaldırmak için site yönettiği mutagenesis kullanın /Bsaben kısıtlama siteleri amino asitler gen ürünlerde değiştirmemeniz için dikkat çekici.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>K029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Column purification</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit (250)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture chamber for imaging</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG</td>
			<td>1-well tissue culture chamber, on cover glass II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>D139-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eco31I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FD0294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>injection cannula (0.30 x 12 mm, 30 G x 1/2)</td>
			<td>Sterican, Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>T832.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO lambda blue 63x water immersion objectiv</td>
			<td>Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS medium</td>
			<td>Duchefa, Haarlem, Netherlands</td>
			<td>M0221.0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x&#160; 1.1 NA water immersion objective</td>
			<td>Nikon, Minato, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35/10 mm</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Germany</td>
			<td>627102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60/150 mm</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Germany</td>
			<td>628102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 120/120/17</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Germany</td>
			<td>688102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant agar</td>
			<td>Duchefa, Haarlem, Netherlands</td>
			<td>P1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid extraction</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide (PI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razorblade</td>
			<td>Classic, Wilkinson Sword GmbH</td>
			<td>7005115E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tubes</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silwet L-77</td>
			<td>Kurt Obermeier GmbH &#38; Co. KG, Bad Berleburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>3834.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NanoDrop 2000c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfadiazine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>2228.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Ligase 5 U/&#181;l</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Ligase 30 U/&#181;l</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EL0013</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducible, cell type-specific expression in arabidopsis thaliana through lhgr-mediated trans-activation

İndüklenebilir, doku özel ifade genetik pertürbasyon spatio-zamansal dinamiği eğitim için önemli ve güçlü bir araçtır. (Burada GR-LhG4 denir) kanıtlanmış ve eşdeğerlik LhGR sistem indüklenebilir mesaj sistemiyle klonlama esnek ve verimli GreenGate bir araya getiren bir efektör ifade sürebilirim transgenik Arabidopsis satırlar üretilip üç ana bitki sürgen türlerinde belirli hücre aralığındaki kaset. Bu amaçla, biz chimeric transkripsiyon faktörü ve geniş bir ifade düzeyleri üzerinde sıkı kontrol sağlanması bir soydaş pOp-türü organizatörü göre daha önce gelişmiş GR-LhG4 sistemi seçti. Ayrıca, sentetik transkripsiyon faktörü etkin olduğu ifade etki alanı görmek için pOp4 veya pOp6 düzenleyicinin kontrolü altında bir ER lokalize mTurquoise2 floresan muhabir sürücü satırları içinde kodlanır. Burada, bir sürücü veya efektör satırı oluşturmak ve nasıl hücre türü belirli ifade indüklenen olabilir ve sürgün apikal meristem, kök apikal meristem ve Arabidopsiscambium göstermek için gereken adımları açıklar. Kullanarak birkaç veya tüm sürücü satırları, bir ifade bağlam belirli etkisi veya Multipl faktörler (effectors) sentetik pOp düzenleyicinin kontrolü altında hızla, örneğin bir efektör ve çoklu arasında bir haç F1 tesislerinde tespit edilebilir sürücü satırları. Bu yaklaşım ile VND7, NAC transkripsiyon faktörü bir hücre özerk şekilde Ektopik ikincil hücre duvar ifade ikna yeteneğine sahip Ektopik ifade örneklenir.

GreenGate klonlama yoluyla sürücü ve efektör hatları nesil
Sistem klonlama GreenGate GoldenGate klonlama ve kullanım türü IIS kısıtlama endonükleaz Bsadayanmaktadır ben ya da onun isoschizomer Eko31I. Enzim üreten çıkıntılar uzak asimetrik tanıma sitesinden, çıkıntılar temel kompozisyon serbestçe olabilir gibi temel seçilen sistemin modüler oluştururlar. Her PCR tarafından oluşturulan öğe, örneğin, bir organizatörü sıra, CD ...

Watch this Scientific Journal Video about Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation at JoVE.com

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

İndüklenebilir, hücre türüne özgü ifade Arabidopsis thaliana aracılığıyla LhGR-aracılı Trans-harekete geçirmek

Burada, biz üretimi tarif ve transgenik Arabidopsis thaliana bir dizi uygulama etkinleştirme indüklenebilir, doku özel ifade üç ana sürgen, sürgün apikal meristem, kök apikal meristem ve cambium satırları.

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

Gelişim biyolojisinde temel amaç, bir genin içeriğe özgü rolünü anlamaktır. Ve bu geleneksel nakavt mutantlar veya kurucu aşırı ifade hatları ile elde etmek zor olabilir. Biz model bitki Arabidopsis thaliana üç ana meristems indükleyici sito özgü ifade için bir kaynak oluşturmak için modüler yeşil kapı klonlama sistemi kullanılır.Aynı modüler klonlama stratejisi kullanılarak, bu yöntem dönüşüme değişmez diğer bitki türlerine uygulanabilir. Bu prosedürün görsel gösterimi değerlidir, çünkü kök meristemlerinde trans aktivasyonun etkisini analiz etmek ve kısa apeks görüntülemeden önce diseksiyon gerektirir, ki bu oldukça zor olabilir. Başlamak için, metin protokolünde belirtildiği gibi tohumları sterilize edin.Sonra, pH 5.8 de yarı mukavemetli Murashige ve Skoog orta hazırlamak ve yüzde bir sakaroz ve% 0.9 agar ekleyin. Otoklavlamadan sonra, DMSO'da çözünmüş Dex'i 10 ila 30 mikromolar arasında son konsantrasyonda indüksiyon plakalarına ekleyin. Kontrol plakalarına eşit miktarda DMSO ekleyin.Kök görüntüleme için tohumları tabaklara koyun ve 48 saat karanlıkta ve 4 derece santigrat derecede tabakalayın. Plakaları bir bitki kuvözde dikey bir konuma getirin ve beş gün boyunca yetiştirin. Çimlenmeden beş gün sonra, fideleri görmek için konfokal lazer tarama mikroskobu kullanın.Başlamak için, metin protokolünde belirtildiği gibi tohumları hazırlamak ve büyümek. Çimlenmeden 6-7 gün sonra, her fideyi ayrı bir tencerede toprağa aktarın. Bitkileri sulama yaparak indükliyorsanız, suda etanolde çözünmüş 25 milimolar DEX stoğundan hazırlanan 25 mikromolar DEX çözeltisi kullanın.İstenilen indüksiyon zamanına kadar her 2-3 günde bir su. Daldırma ile indükleme, 25 mikromolar son konsantrasyonveya DEX ve sahte tedavi için DMSO eşdeğer miktarda 0,02% Silwet L77 ve DEX içeren su 750 mililitre ile bir litrelik bir beaker hazırlayın. Tek bir bitkiyi 30 saniye boyunca indüksiyon veya sahte çözeltiye batırın.Görüntüleme istenilen zamana kadar, her iki veya üç günde bir tekrarlayın. Başlamak için, metin protokolünde belirtildiği gibi tohumları hazırlamak ve büyümek. Çimlenmeden 6-7 gün sonra, her fideyi ayrı bir tencerede toprağa aktarın.Gövde yaklaşık bir santimetre uzunluğunda olduğunda, suda 10 ila 50 mikromolar DEX çözeltisi ile floresan SAM sprey. Gelişimin daha sonraki aşamalarında indüksiyon ve görüntüleme için, daha uzun sapları veya yan sürgünler SAM'lar neden. İndüksiyondan 24 ila 48 saat sonra, SAM'ları inceleyin ve görüntülemeye geçin.İlk olarak, propidium iyodür milileter çözeltisi başına 10 mikrogram plaka dan fide aktarın ve beş dakika boyunca onları karşı leke. Kökleri bir mikroskop görüntüleme odasına yerleştirin ve 63x su daldırma amacı ile confocal lazer tarama mikroskobu kullanarak görüntüleyin. Propidium iyodür floresansını görselleştirmek için 488 nanometre lik bir uyarma dalga boyu kullanın ve 590 ile 660 nanometre arasında emisyon toplayın.mTurquoise2 floresans için, 458 nanometre uyarma kullanın ve sıralı tarama kullanarak 460 ve 615 nanometre arasında emisyon toplamak. İlk olarak, istenilen bölümün karşı tarafında bir parmak ile bir kök düzeltmek. Bir jilet kullanarak, yaklaşık üç santimetre lik bir segment kesti ve birkaç ince kesim gerçekleştirin.Jileti musluk suyu içeren bir Petri kabında durulayın ve kök kısımlarını toplayın. Ya bölümleri leke veya doğrudan mikroskop slaytlar üzerine monte. Boyama için, bir reaksiyon tüpünde propidium iyodür mililitre çözeltisi başına 250 mikrogram bir mililitre hazırlayın.Petri kabındaki musluk suyunu bir pipetle çıkarın ve propidium iyodür çözeltisi ve beş dakika boyunca leke ile değiştirin. Daha sonra propidium iyot çözeltisini çıkarın ve suyla durulayın. İnce pratisyen veya ince bir fırça kullanarak, lekeli bölümleri mikroskop slaytlarına aktarın.Örnekleri görüntülemek için 25x daldırma su daldırma lens ile bir confocal lazer tarama mikroskobu kullanın. Propidium iyodür floresansını heyecanlandırmak ve 570 ila 620 nanometre arasında emisyon toplamak için 561 nanometre lazer ışığı kullanın. Sürücü hattı yapıları tarafından kodlanmış mTurquoise2 florofor efektörheyecan için 405 nanometre lazer ışığı kullanın ve 425 ila 475 nanometre emisyon toplamak.İlk olarak, çekim ucunun iki santimetre altında kök kesmek için forceps kullanın. Bir elinde kök tutun ve çiçek tomurcukları ve büyük primordia kaldırmak için ince forseps kullanın. Genç primordia kaldırmak için, yüzde üç agarose içeren bir Petri kabında dik bir pozisyonda SAM düzeltmek.Daha sonra, SAM yakın herhangi bir genç primordia kaldırmak için bir dürbün ve forceps kullanın. Diseksiyonlu SAM'i propidium iyodürün mililitre çözeltisi başına 250 mikrogram içeren bir tüpe aktarın. Boyama işlemi sırasında numunenin tamamen batık kalmasını sağlarken numunenin 5 ila 10 dakika lekesini bırakın.Lekeli SAM'i yüzde üç agarose orta içeren küçük bir Petri kabına yerleştirin. SAM'i çift distile suyla kapatın. İncelenen SAM'ları görüntülemek için 25 x daldırma su daldırma lensi ile donatılmış bir confocal lazer tarama mikroskobu kullanın.Propidium iyodür floresansını heyecanlandırmak ve 570 ila 620 nanometre arasında emisyon toplamak için 561 nanometre lazer ışığı kullanın. MTurquoise2 florofor heyecanlandırmak ve 425 ila 475 nanometre emisyon toplamak için 405 nanometre lazer ışığı kullanın. Z yönünde 50 mikrometreye yayılan ve adım boyutu 0,5 mikrometre olan görüntü yığınlarını kaydedin.DEX ile indüksiyon kök endodermis phloem öncüleri ve cambium hücre tipi spesifik mTurquoise2 ifade yol açar, ve ateş apikal meristem kök hücreleri. Transaktivasyon için bir test çalışması olarak, V16 aktivasyon etki alanına kaynaşmış ikincil hücre duvarı ana transkripsiyon faktörü VND7'yi kodlayan bir efektör çizgi oluşturulur. Dex veya DMSO'nun 15 mikrolitresi ile beş günlük tek tedaviden sonra, başlangıç kılıfındaki ektopik lignifikasyonun görselleştirilmesi için kök kesitler hazırlanır.İndüklenen örneklerde başlangıç kılıfı hücreleri propidium iyodür kanalı için güçlü bir sinyal gösterirken, bazı hücreler ksilem hücrelerinde hücre duvarının tipik retikülat kalınlaşmasını gösterir. Bu videoyu izledikten sonra, farklı dokularda gen ekspresyonunu nasıl tetiklayacağınızı ve numunelerinizi görüntülemeye nasıl hazırlayacağınızı net bir şekilde anlamanız gerekir. Bu yordamı takiben, kurulan sürücü hatları, araştırma ilgi alanlarına göre diğer kullanıcılar tarafından oluşturulan çok çeşitli efektör yapıları ile kullanılabilir.Bu kısayol, bitki araştırmacılarının hücre tipi spesifik ekspresyonun veya ayrılmış bir zamanda ilgi çeken bir genin nakavtının etkisini hızla değerlendirmelerine yardımcı olmalıdır. Bu hücre tipi spesifik indüksiyon sistemi kortikosteroid deksametazon kullanımını gerektirir. Doğrudan temastan kaçınılmalıdır, bu nedenle tedavi sırasında eldiven ve yüz maskesi takmak önemlidir.

Research

JoVE Journal

Genetics

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

The Terroir Concept Interpreted through Grape Berry Metabolomics and Transcriptomics

Üzüm Berry metabolomik ve transkriptomik aracılığıyla yorumlanır Terroir Kavramı

Terroir refers to the combination of environmental factors that affect the characteristics of crops such as grapevine (Vitis vinifera) according to ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

İnsan Primer Hücre Kültürleri içinde Sirkadyen Saat Gen İfade ve Hormon salgısını Paralel Ölçümü

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

Multiplex RT-qPCR kullanarak tek hücreli Gen İfadesi Nadir Lenfoid Populasyonlarının Farklılıkları karakterize etmek

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Yetiştirme ve Gizle böcek RNA aracılı gen demonte çift sarmallı,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

İndüklenebilir T7 RNA Polimeraz aracılı Çok Boylu İfade Sistemi, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

İç Standartları FACS ve qPCR kullanma Tek hücreli Gen İfadesi Profil

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

İndüklenebilir geçici transfeksiyon yoluyla kontrol edilebilir iyon kanal İfade

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

Hücre Çevrimiyle Düzenlenen Gen İfadesini İki Tamamlayıcı Hücre Senkronizasyon Protokolü İle Çalışmak

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Hidrodinamik kuyruk ven enjeksiyon kullanarak fare tetkikine genetik Vivo içinde değişiklik kurucu ve indüklenebilir sistemleri

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Bir Optogenetic kontrol etmek ve hücre-hücre etkileşimleri gen ifade desenleri analiz yöntemi

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...