Name: visualization of endogenous mitophagy complexes in situ in human pancreatic beta cells utilizing proximity ligation assay
Uploaded: 2019-05-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay at JoVE.com

يقر المؤلفون بالدعم التمويلي المقدم من JDRF (CDA-2016-189 وSRA-2018-539)، والمعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى، والمعاهد الوطنية للصحة (R01-DK-108921)، وأسرة Brehm، وعائلة أنتوني. وتحظى جائزة التطوير الوظيفي لـ JdRF إلى S.A.S. بدعم جزئي من الأكاديمية الدانمركية للسكري، التي تدعمها مؤسسة نوفو نورديسك.

يتم استخدام الجزر البنكرياسالبشرية المانحة غير المحددة من خلال إعفاء مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) وامتثالاً لسياسة IRB لجامعة ميشيغان. تم توفير الجزر البنكرياسية البشرية من قبل برنامج توزيع الجزر المتكاملة (IIDP) الذي ترعاه المعاهد القومية للصحة/المعهد الوطني للتنمية البشرية.
1....

<ol>
	<li>Pearson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clec16a,+Nrdp1,+and+USP8+Form+a+Ubiquitin-Dependent+Tripartite+Complex+That+Regulates+beta-Cell+Mitophagy.">Clec16a, Nrdp1, and USP8 Form a Ubiquitin-Dependent Tripartite Complex That Regulates beta-Cell Mitophagy.</a> Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).</li><li>Soleimanpour, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diabetes+susceptibility+gene+Clec16a+regulates+mitophagy.">The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy.</a> Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).</li><li>Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+regulation+of+&#946;-cell+function:+Maintaining+the+momentum+for+insulin+release.">Mitochondrial regulation of &#946;-cell function: Maintaining the momentum for insulin release.</a> Molecular Aspects of Medicine. , (2015).</li><li>Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+by+mitophagy.">Regulation by mitophagy.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 53, 147-150 (2014).</li><li>Soleimanpour, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+Susceptibility+Genes+Pdx1+and+Clec16a+Function+in+a+Pathway+Regulating+Mitophagy+in+beta-Cells.">Diabetes Susceptibility Genes Pdx1 and Clec16a Function in a Pathway Regulating Mitophagy in beta-Cells.</a> Diabetes. 64 (10), 3475-3484 (2015).</li><li>Zhong, L., Tan, Y., Zhou, A., Yu, Q., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RING+Finger+Ubiquitin-Protein+Isopeptide+Ligase+Nrdp1/FLRF+Regulates+Parkin+Stability+and+Activity.">RING Finger Ubiquitin-Protein Isopeptide Ligase Nrdp1/FLRF Regulates Parkin Stability and Activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9425-9430 (2005).</li><li>Durcan, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=USP8+regulates+mitophagy+by+removing+K6-linked+ubiquitin+conjugates+from+parkin.">USP8 regulates mitophagy by removing K6-linked ubiquitin conjugates from parkin.</a> The EMBO Journal. 33 (21), 2473-2491 (2014).</li><li>Gauthier, T., Claude-Taupin, A., Delage-Mourroux, R., Boyer-Guittaut, M., Hervouet, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+Ligation+In+situ+Assay+is+a+Powerful+Tool+to+Monitor+Specific+ATG+Protein+Interactions+following+Autophagy+Induction.">Proximity Ligation In situ Assay is a Powerful Tool to Monitor Specific ATG Protein Interactions following Autophagy Induction.</a> PLoS ONE. 10 (6), e0128701 (2015).</li><li>Silva Xavier, D. a., G, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cells+of+the+Islets+of+Langerhans.">The Cells of the Islets of Langerhans.</a> Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54 (2018).</li><li>Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+islet+plasticity:+Interspecies+comparison+of+islet+architecture+and+composition.">Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition.</a> Islets. 2 (3), 135-145 (2010).</li><li>Cabrera, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unique+cytoarchitecture+of+human+pancreatic+islets+has+implications+for+islet+cell+function.">The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (7), 2334 (2006).</li><li>Brissova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Human+Pancreatic+Islet+Architecture+and+Composition+by+Laser+Scanning+Confocal+Microscopy.">Assessment of Human Pancreatic Islet Architecture and Composition by Laser Scanning Confocal Microscopy.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).</li><li>Babu, D. A., Deering, T. G., Mirmira, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+feat+of+metabolic+proportions:+Pdx1+orchestrates+islet+development+and+function+in+the+maintenance+of+glucose+homeostasis.">A feat of metabolic proportions: Pdx1 orchestrates islet development and function in the maintenance of glucose homeostasis.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 92 (1), 43-55 (2007).</li><li>Poitout, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucolipotoxicity+of+the+pancreatic+beta+cell.">Glucolipotoxicity of the pancreatic beta cell.</a> Biochimica Biophysica Acta. 1801 (3), 289-298 (2010).</li><li>Pearson, G., Soleimanpour, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ubiquitin-dependent+mitophagy+complex+maintains+mitochondrial+function+and+insulin+secretion+in+beta+cells.">A ubiquitin-dependent mitophagy complex maintains mitochondrial function and insulin secretion in beta cells.</a> Autophagy. 14 (7), 1160-1161 (2018).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomes+reveal+characteristic+features+of+human+pancreatic+islet+cell+types.">Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types.</a> EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).</li><li>DiGruccio, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+alpha,+beta+and+delta+cell+transcriptomes+reveal+that+ghrelin+selectively+activates+delta+cells+and+promotes+somatostatin+release+from+pancreatic+islets.">Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets.</a> Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).</li><li>Lawlor, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomes+identify+human+islet+cell+signatures+and+reveal+cell-type&#8211;specific+expression+changes+in+type+2+diabetes.">Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type&#8211;specific expression changes in type 2 diabetes.</a> Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).</li><li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+islets+contain+four+distinct+subtypes+of+&#946;+cells.">Human islets contain four distinct subtypes of &#946; cells.</a> Nature Communications. 7, 11756 (2016).</li><li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+major+pancreatic+cell+types+and+long-term+culture-initiating+cells+using+novel+human+surface+markers.">Isolation of major pancreatic cell types and long-term culture-initiating cells using novel human surface markers.</a> Stem Cell Research. 1 (3), 183-194 (2008).</li><li>Jayaraman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+detection+of+viable+human+pancreatic+beta+cells+by+flow+cytometry+using+fluorophores+that+selectively+detect+labile+zinc,+mitochondrial+membrane+potential+and+protein+thiols.">A novel method for the detection of viable human pancreatic beta cells by flow cytometry using fluorophores that selectively detect labile zinc, mitochondrial membrane potential and protein thiols.</a> Cytometry Part A. 73 (7), 615-625 (2008).</li><li>Arda, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Dependent+Pancreatic+Gene+Regulation+Reveals+Mechanisms+Governing+Human+&#223;-Cell+Function.">Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human &#223;-Cell Function.</a> Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).</li><li>Allen, G. F. G., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+iron+triggers+PINK1/Parkin-independent+mitophagy.">Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy.</a> EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).</li><li>Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. -. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+Parkin+Zone:+Mitophagy+without+Parkin.">No Parkin Zone: Mitophagy without Parkin.</a> Trends in Cell Biology. , (2018).</li></ol>

هنا نقوم بوصف نهج بسيط وفعال لاستخدام NRDP1:USP8 PLA في الأنسجة / الخلايا ذات الأهمية لتحديد تشكيل المجمعات mitophagy المنبع. أكدنا في وقت سابق تشكيل مجمع CLEC16A-NRDP1-USP8 mitophagy في خلايا بيتا البنكرياس ية من خلال عدة منهجيات، بما في ذلك تجارب الترسيب المناعي المشترك، ودراسات التفاعل الخالي من الخلايا، وفي ?...

تنتج خلايا بيتا البنكرياس الأنسولين المطلوب للحفاظ على التوازن الجلوكوز الطبيعي، ويؤدي فشلها في تطوير جميع أشكال مرض السكري. تحتفظ خلايا بيتا بقدرة الميتوكوندريا القوية لتوليد الطاقة اللازمة لاقتران استقلاب الجلوكوز بالإفراج عن الأنسولين. في الآونة الأخيرة، أصبح من الواضح أن الحفاظ على كتلةالميتوكوندريا الوظيفية هو من الأهمية المحورية لوظيفة خلية بيتا الأمثل 1،2،3. من أجل الحفاظ على كتلة الميتوكوندريا الوظيفية، تعتمد خلايا بيتا على آليات مراقبة الجودة لإزالة الميتوكوندريا المختلة أو التالفة أو الشيخوخة4. لقد أثبتنا نحن وآخرون في السابق أن خلايا بيتا تعتمد على شكل متخصص من دوران الميتوكوندريا، يسمى الميتوكوندريا أوتوفاجي (أو الميتوثاجي)، للحفاظ على مراقبة جودة الميتوكوندريا في كل من القوارض والجزر الصغيرة البشرية1، 2،5. لسوء الحظ، ومع ذلك، لم يكن هناك طريقة بسيطة للكشف عن mitophagy، أو المكونات mitophagy أعرب عنها داخليا، في خلايا بيتا البنكرياس البشرية.
لقد أظهرنا مؤخرا أن تنظيم المنبع من mitophagy في خلايا بيتا يعتمد على تشكيل مجمع البروتين الذي يتألف من الأربطة E3 CLEC16A وNRDP1 وdeubiquitinase USP81. وقد أظهرت NRDP1 و USP8 بشكل مستقل أن تؤثر على mitophagy من خلال العمل على مفتاح mitophagy البادئ باركين6,7. NRDP1 يستهدف PARKIN لفي كل مكان وتدهور لإيقاف mitophagy6, وUSP8 deubiquitinates K6 المرتبطة باركين لتعزيز نقلها إلى الميتوكوندريا7. وقد تم إجراء تقييم الربط القرب (PLA) التكنولوجيا مؤخرا في مجال تفاعل البروتين البيولوجيا8، مما يسمح التصور من تفاعلات البروتين الذاتية في الموقع في خلايا واحدة ، ولا يحد من المواد عينة نادرة. هذه المنهجية هي تحريضية بشكل خاص لبيولوجيا الخلايا في الislet/beta البشرية، وذلك بسبب التناسل في توافر العينات، إلى جانب الحاجة إلى فهم مجمعات البروتين ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية داخل أنواع الخلايا غير المتجانسة.
الاستفادة من نهج جيش التحرير الشعبى الصينى، ونحن قادرون على مراقبة المجمعات الرئيسية الذاتية mitophagy في خلايا بيتا البنكرياس البشرية الأولية وخطوط الخلايا العصبية، وتبين آثار بيئة شيطانية على مسار mitophagy1. وباختصار، فإن الهدف الشامل لهذا البروتوكول هو تحليل مجمعات بروتين ميتوثاجي محددة في الأنسجة التي تفتقر إلى مواد وفيرة، أو حيث لا يمكن إجراء دراسات تقليدية للتفاعل بين البروتين.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA 1X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Block solution</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>Use 1X PBS, add 10 % donkey serum, and 0.3% Triton X-100 detergent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer A</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>To make 1L: Mix 8.8g NaCl, 1.2g Tris base, 500ul Tween-20, with 750mL ddH20. pH to 7.5 with HCl, and fill to 1L. Filter solution and store at 4C. Bring to RT before experimental use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer B</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>To make 1L: Mix 5.84g NaCl, 4.24g Tris base, 26g Tris-HCl with 500mL ddH20. pH to 7.5, and fill to 1L. Filter solution and store a 4C. Bring to RT before experimental use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5-conjugated AffiniPure donkey anti-goat</td>
			<td>Jackson Labs</td>
			<td>705-175-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detection Reagents Red</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>DU092008-100RXN</td>
			<td>Kit containing: ligation solution stock (5X), ligase, amplification solution stock (5X) and polymerase.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink PLA probe anti-mouse MINUS</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>DU092004-100RXN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink PLA probe anti-rabbit PLUS</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>DU092002-100RXN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polyclonal anti-PDX1 (clone A17)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-14664</td>
			<td>RRID: AB_2162373</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIN6 pancreatic cell line</td>
			<td>Gift from D. Stoffers</td>
			<td></td>
			<td>Mouse insulinoma cell line, utilized for cell-based assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-USP8 antibody (clone US872)</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>SAB200527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pap-pen</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>195505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use to seal antibody and probe solutions on your cells to prevent evaporation when using small solution volumes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBT (phosphate buffered saline with triton)</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>To make 50mL: 43.5mLddH2O, 5mL 10X PBS, 0.5mL 10X BSA(100mg/mL solution), 1mL 10% triton X-100 solution in ddH20)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 10X</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIM(ABS) Human AB serum</td>
			<td>Prodo Labs</td>
			<td>PIM-ABS001GMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIM(G) (glutamine)</td>
			<td>Prodo Labs</td>
			<td>PIM-G001GMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIM(S) media</td>
			<td>Prodo Labs</td>
			<td>PIM-S001GMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PR619</td>
			<td>Apex Bio</td>
			<td>A812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td>Life Technologies (Molecular Probes)</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal anti-FLRF/RNF41 (Nrdp1)</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>A300-049A</td>
			<td>RRID: AB_2181251</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y cells</td>
			<td>Gift from L. Satin</td>
			<td></td>
			<td>Human neuroblastoma cell line, utilized for cell-based assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water for RNA work (DEPC water)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP361-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of endogenous mitophagy complexes in situ in human pancreatic beta cells utilizing proximity ligation assay

Mitophagy هو مسار أساسي لمراقبة جودة الميتوكوندريا، وهو أمر بالغ الأهمية للطاقة الحيوية لخلايا بيتا في زيت البنكرياس لتغذية الأنسولين المحفز للجلوكوز. تقييم mitophagy هو التحدي وغالبا ما يتطلب الصحفيين الوراثية أو تقنيات تكميلية متعددة لا تستخدم بسهولة في عينات الأنسجة، مثل الجزر البنكرياس البشرية الأولية. هنا نبرهن على نهج قوي لتصور وتحديد تشكيل المجمعات الانقسامية الذاتية الرئيسية في جزر البنكرياس البشرية الأولية. باستخدام تقنية اختبار الربط القرب الحساسة للكشف عن التفاعل بين المنظمين mitophagy NRDP1 و USP8، ونحن قادرون على تحديد كمية تشكيل المجمعات mitophagy الأساسية في الموقع. من خلال اقتران هذا النهج لمكافحة البقع لعامل النسخ PDX1، يمكننا قياس المجمعات mitophagy، والعوامل التي يمكن أن تضعف mitophagy، وعلى وجه التحديد داخل خلايا بيتا. المنهجية التي نصفها تتغلب على الحاجة إلى كميات كبيرة من المستخلصات الخلوية اللازمة لدراسات التفاعل البروتينالبروتيني الأخرى، مثل الترسيب المناعي (IP) أو قياس الطيف الكتلي، وهي مثالية لعينات جزر الإنسان الثمينة عموما لا المتاحة بكميات كافية لهذه النهج. وعلاوة على ذلك، فإن هذه المنهجية تبطل الحاجة إلى تقنيات فرز التدفق لتنقية خلايا بيتا من مجموعة من الislet غير المتجانسة لتطبيقات البروتين في المصب. وهكذا، فإننا نصف بروتوكول قيمة لتصور mitophagy متوافقة للغاية للاستخدام في مجموعات الخلايا غير متجانسة ومحدودة.

أجرينا تجارب أولية في خط خلية بيتا البنكرياس MIN6 وخط الخلايا العصبية SH-SY5Y SH-SY5Y، لتحسين وتأكيد كل من خصوصية الأجسام المضادة وتفاعلات البروتين المرئي. تم طلاء خلايا MIN6 على الأغطية في 30،000 خلية / مل وتركت للتقيد لمدة 48 ساعة، وخلايا SH-SY5Y كانت مطلية على الأغطية في 15،000 خلية / مل وت...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay at JoVE.com

Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

التصور من المجمعات Mitophagy الذاتية في الموقع في خلايا بيتا البنكرياس البشرية باستخدام القرب الربط اختبار

يحدد هذا البروتوكول طريقة للتحليل الكمي لتكوين مجمع البروتين الميتوباجي على وجه التحديد في خلايا بيتا من عينات الشُعيل البشرية الأولية. وبالتالي تسمح هذه التقنية بتحليل mitophagy من المواد البيولوجية المحدودة، والتي هي حاسمة في عينات خلايا بيتا البنكرياس البشرية الثمينة.

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...

يسمح لنا هذا البروتوكول بمراقبة مجمعات الميتوفاجي الذاتية في الأنسجة البشرية مثل خلايا بيتا ، مما يسهل أبحاث الميتوفاجي في الأنسجة المحورية ذات الصلة بالترجمة. إحدى مزايا هذه التقنية هي قدرتها على تصور مجمعات الميتوباغ المهمة في الجسم الحي في الأنسجة ذات التوافر النادر أو بأعداد عينة صغيرة. بعد عزل وفقا للبروتوكولات القياسية, ثقافة أربع إلى ست مرات 10 إلى ثالث مكافئات الجزر البشرية في 10 ملليلتر من كامل البنكرياس متوسطة ليوم واحد على الأقل في 37 درجة مئوية.في اليوم التالي، استخدم مجهر ضوء تشريح في التكبير ثلاث مرات لحساب الجزر البشرية الفردية داخل الثقافة. اختيار 40 الجزر لكل علاج أو شرط من الفائدة في 1.5 ملليلتر أنابيب من متوسطة جزيرة. رواسب الجزر عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني تكملها 50 مجهرية PR619.عكس الأنبوب وجمع الجزر عن طريق الطرد المركزي لغسل الثانية في برنامج تلفزيوني جديد بالإضافة إلى مثبطات deubiquitinase. بعد الطرد المركزي الثاني، افصل الجزر في خلايا واحدة مع 125 ميكرولترات من 0.25٪ تريبسين زائد مثبط لمدة ثلاث دقائق في 37 درجة مئوية مع الأنابيب لطيف الدورية. في النهاية من الحاضنة, إعتزل ال [ردر] مع واحدة ملليلتر من 37 درجة مئويّة يدفأ بنكرياس [هست] [هست] وسط مع PR619.جمع الجزر عن طريق الطرد المركزي لاثنين من يغسل في برنامج تلفزيوني جديد بالإضافة إلى مثبط لكل غسل. بعد الغسيل الثاني ، resuspend الجزر المنفصلة في 150 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني جديد بالإضافة إلى مثبطات. للتمسك و تثبيت الجزر الفردية، cytospin حل الخلية على شرائح المجهر المشحونة المتجمدة ومخطط المنطقة الخلوية مع قلم محمّد.ثم إصلاح الخلايا المحاصرة مع 4٪ شبهformaldehyde وBBS لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. للتحليل الكيميائي المناعي لعينات الجزر، قم بغسل الخلايا مع غسلين لمدة خمس دقائق في PBS في درجة حرارة الغرفة، تليها حجب ملزم غير محدد مع مصل 10٪حمار وبرنامج تلفزيوني بالإضافة إلى 0.3٪ من المنظفات لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة منع، coincubate الخلايا مع الأجسام المضادة الماوس الأولية ضد الببتيداس ubiquitin محددة 8، الأجسام المضادة الأرنب الأولية ضد بروتين تدهور مستقبلات neuregulin-1، وعلامة محددة لتحديد الخلية بيتا التي لم يتم رفعها في الماوس أو الأرنب حتى لا تتداخل مع القرب ربط إشارة الاختبار بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية.في صباح اليوم التالي، غسل العينات مع اثنين من غسل خمس دقائق في برنامج تلفزيوني على الروك. إضافة المضادة المضادة Cy5 المضادة الماعز الثانوية إلى حل فحص ربط القرب أعدت حديثا. بعد الغسيل الثاني، تسمية كل عينة جزيرة مع 20 ميكرولترات من محلول التحقيق واستعادة الشرائح مع فيلم بلاستيكي لاحتضان لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية.في نهاية الحضانة، وغسل الخلايا مع اثنين من خمس دقائق يغسل في عازلة A على الروك تليها الحضانة مع 20 microlits من حل الربط الطازجة التي تكملها 0.25 وحدة لكل ميكرولتر من ligase لكل شريحة لاحتضان لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية. في نهاية عملية الربط، اغسل الخلايا مرتين بالمخزن المؤقت A لمدة دقيقتين لكل غسل. غطي كل عينة بـ 20 ميكروليترات من حلول التضخيم المكملة بالبوليميراز لاحتضان لمدة 100 إلى 120 دقيقة عند 37 درجة مئوية.لتحضير الخلايا للتصوير، قم بغسل العينات مرتين في المخزن المؤقت الطازج A لمدة 10 دقائق لكل غسيل على الروك متبوعاً بغسل واحد في المخزن المؤقت 0.1x B لمدة دقيقتين على الروك. بعد الغسيل الأخير، قم بتركيب الشرائح مع قطرة من الوسيلة المتصاعدة التي تحتوي على DAPI ووضع غطاء بعناية على كل عينة باستخدام مشرط للضغط على أي فقاعات. ثم ختم الأغطية مع طلاء الأظافر واضحة حول حواف.لصورة العينات، ضع شريحة على خشبة المجهر قادرة على التقاط عدة طائرات بؤرية وحدد التكبير 100 مرة. تعيين ارتفاع Z-المكدس إلى ما يقرب من 0.45 ميكرومتر وصمة عار المناسبة، counterstain، وإشارة الخلية الحية المعلمات الإثارة والانبعاثات. الحصول على ما لا يقل عن تسع صور مختلفة من الطائرات المحورية.لضمان أن الإشارات الخلفية صورة fluorescence والضوء الضال يتم تقليلها ، معالجة الصور باستخدام خوارزمية فك الوضوح الأقرب الجيران ثنائية الأبعاد باستخدام برنامج معالجة الصور القياسية المفضلة. لقياس التفاعلات المقايسة ربط القرب، افتح ImageJ وفتح صورة قياس القرب. بدءًا من الصورة الأولى في التركيز البؤري، انقر فوق صورة وحدد الضبط والعتبة.ضبط عتبة لإزالة كل من غير محددة إشارة تحليل الربط القرب وتقديم مذكرة من التكيف عتبة في محاولة للحفاظ على إشارة متسقة طوال التحليل. انقر فوق عملية وحدد ثنائي وجعل ثنائي. تأكد من تعيين الحجم إلى صفر إلى ما لا نهاية، يتم تعيين دائري إلى صفر إلى واحد، يتم تعيين إظهار إلى حدود و تحقق من عرض النتائج ومربعات نتائج مسح.لاحظ عدد الجسيمات التي تم تحليلها في جدول بيانات يشير إلى العينة ووضع المكدس Z. ثم انقر فوق تحليل وتحليل الجسيمات لقياس الجسيمات. عندما تم تحليل جميع المكدسات Z في التركيز للعينة، إرسال العدد الإجمالي للجسيمات للعينة في جدول البيانات لتحديد العدد الإجمالي للتفاعلات.الأجسام المضادة المستخدمة في فحص القرب محددة لليغاندس ولا تثبت أي تداخل. كما لوحظ، بروتوكول التشتت هو كفاءة عالية في الحصول على خلايا واحدة في مجال المجهر من الرؤية لتحليل المصب وتلطيخ خلية بيتا يتم الاحتفاظ بعد قياس قرب الربط في الجزر البشرية الأولية. باستخدام التقنيات التي أثبتت, يمكن تحديد أن التفاعل من بروتين بروتين تدهور مستقبلات neuregulin-1 وubiquitin-محددة الببتيداز 8 انخفض بعد التعرض لمدة 48 ساعة إلى بالميتات, تسليط الضوء على جدوى هذا الفحص لتقييم العوامل الرئيسية الميتومائية الذاتية التالية المحفزات diabetogenic.إن التشتت الفعال واللطيف للرقيات البشرية أمر ضروري لضمان القياس الكمي لفئات الخلايا الصحيحة في المصب. جيش التحرير الشعبي يسمح لتقييم مجمعات الميتوفاي الهامة في عينات الجزر البشرية مما يسمح لتحليل عينات المرضى البشرية الميتوفاتية والبيولوجية الهامة نقل مجال أبحاث السكري إلى الأمام.

Research

JoVE Journal

Medicine

Staining Protocols for Human Pancreatic Islets

تلطيخ بروتوكولات لجزر البنكرياس الإنسان

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and ...

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

تحسين التصور الانبثاث الرئة في قرار خلية واحدة في الفئران عن طريق الجمع بين<em&gt; في الوضع الطبيعي</em&gt; الإرواء من أنسجة الرئة وX-غال تلوين لل<em&gt; lacZ</em&gt; الكلمات الدلالية الخلايا السرطانية،

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells

تحليل Coculture من تفاعلات البروتين خارج الخلية التي تمس افراز الانسولين من قبل خلايا بيتا في البنكرياس

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within ...

A Protocol for Genetic Induction and Visualization of Benign and Invasive Tumors in Cephalic Complexes of Drosophila melanogaster

A Protocol for Genetic Induction and Visualization of Benign and Invasive Tumors in Cephalic Complexes of Drosophila melanogaster

بروتوكول لالتعريفي الجيني والتخيل من أورام حميدة والغازية في رأسي مجامع<em&gt; ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em

Drosophila has illuminated our  understanding of the genetic basis of normal development and disease for the  past several decades and today it continues ...

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

محاكاة البنكرياس المرونة العصبية:<em&gt; في المختبر</em&gt; ثنائي الخلايا العصبية اللدونة الفحص

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

متعدد القطب تسجيلات صفيف من داء الصرع بعد الجراحة القشرية الأنسجة البشرية

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

دراسة سرطان البنكرياس الجذعية خصائص الخلايا لتطوير استراتيجيات علاجية جديدة

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

نضوب خلايا الفأر من Xenografts ورم الإنسان يحسن بشكل ملحوظ تحليل المصب من الخلايا المستهدفة

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

في المختبر و في فيفو كشف ميتوفاجي في الخلايا البشرية، ايليجانس جيموالفئران

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

Application of End-to-end Anastomosis in Robotic Central Pancreatectomy

تطبيق ملامسة نهاية إلى نهاية في بانكريتيكتومي الوسطى إليه (روبوت)

Central pancreatectomy is carried out for the treatment of benign or low-malignant potential tumors located in the pancreatic neck or proximal part of ...