Name: visualization of endogenous mitophagy complexes in situ in human pancreatic beta cells utilizing proximity ligation assay
Uploaded: 2019-05-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay at JoVE.com

Forfatterne anerkender støtte fra JDRF (CDA-2016-189 og SRA-2018-539), National Institute of diabetes og fordøjelses-og nyresygdomme, National Institutes of Health (R01-DK-108921), Brehm-familien og Anthony-familien. JDRF Karriereudviklings prisen til S.A.S. støttes delvist af det danske diabetes akademi, som støttes af Novo Nordisk Fonden.

Brug af de-identificerede donor menneskelige pancreas Holme er via en institutionel revision Board (IRB) fritagelse og i overensstemmelse med University of Michigan IRB-politik. Humane pancreas-Holme blev leveret af NIH/NIDDK-sponsoreret Integrated Islet distribution program (IIDP).
1. forberedelse af den menneskelige ø
<ol><li>
Dissociation af enkelt celle
	<ol>
<li>Kultur menneskelige ø prøver (4000 – 6000 ø ækvivalenter/10 mL medier) i mindst 1 dag ved 37 °C i bug...

<ol>
	<li>Pearson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clec16a,+Nrdp1,+and+USP8+Form+a+Ubiquitin-Dependent+Tripartite+Complex+That+Regulates+beta-Cell+Mitophagy.">Clec16a, Nrdp1, and USP8 Form a Ubiquitin-Dependent Tripartite Complex That Regulates beta-Cell Mitophagy.</a> Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).</li><li>Soleimanpour, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diabetes+susceptibility+gene+Clec16a+regulates+mitophagy.">The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy.</a> Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).</li><li>Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+regulation+of+&#946;-cell+function:+Maintaining+the+momentum+for+insulin+release.">Mitochondrial regulation of &#946;-cell function: Maintaining the momentum for insulin release.</a> Molecular Aspects of Medicine. , (2015).</li><li>Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+by+mitophagy.">Regulation by mitophagy.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 53, 147-150 (2014).</li><li>Soleimanpour, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+Susceptibility+Genes+Pdx1+and+Clec16a+Function+in+a+Pathway+Regulating+Mitophagy+in+beta-Cells.">Diabetes Susceptibility Genes Pdx1 and Clec16a Function in a Pathway Regulating Mitophagy in beta-Cells.</a> Diabetes. 64 (10), 3475-3484 (2015).</li><li>Zhong, L., Tan, Y., Zhou, A., Yu, Q., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RING+Finger+Ubiquitin-Protein+Isopeptide+Ligase+Nrdp1/FLRF+Regulates+Parkin+Stability+and+Activity.">RING Finger Ubiquitin-Protein Isopeptide Ligase Nrdp1/FLRF Regulates Parkin Stability and Activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9425-9430 (2005).</li><li>Durcan, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=USP8+regulates+mitophagy+by+removing+K6-linked+ubiquitin+conjugates+from+parkin.">USP8 regulates mitophagy by removing K6-linked ubiquitin conjugates from parkin.</a> The EMBO Journal. 33 (21), 2473-2491 (2014).</li><li>Gauthier, T., Claude-Taupin, A., Delage-Mourroux, R., Boyer-Guittaut, M., Hervouet, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+Ligation+In+situ+Assay+is+a+Powerful+Tool+to+Monitor+Specific+ATG+Protein+Interactions+following+Autophagy+Induction.">Proximity Ligation In situ Assay is a Powerful Tool to Monitor Specific ATG Protein Interactions following Autophagy Induction.</a> PLoS ONE. 10 (6), e0128701 (2015).</li><li>Silva Xavier, D. a., G, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cells+of+the+Islets+of+Langerhans.">The Cells of the Islets of Langerhans.</a> Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54 (2018).</li><li>Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+islet+plasticity:+Interspecies+comparison+of+islet+architecture+and+composition.">Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition.</a> Islets. 2 (3), 135-145 (2010).</li><li>Cabrera, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unique+cytoarchitecture+of+human+pancreatic+islets+has+implications+for+islet+cell+function.">The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (7), 2334 (2006).</li><li>Brissova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Human+Pancreatic+Islet+Architecture+and+Composition+by+Laser+Scanning+Confocal+Microscopy.">Assessment of Human Pancreatic Islet Architecture and Composition by Laser Scanning Confocal Microscopy.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).</li><li>Babu, D. A., Deering, T. G., Mirmira, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+feat+of+metabolic+proportions:+Pdx1+orchestrates+islet+development+and+function+in+the+maintenance+of+glucose+homeostasis.">A feat of metabolic proportions: Pdx1 orchestrates islet development and function in the maintenance of glucose homeostasis.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 92 (1), 43-55 (2007).</li><li>Poitout, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucolipotoxicity+of+the+pancreatic+beta+cell.">Glucolipotoxicity of the pancreatic beta cell.</a> Biochimica Biophysica Acta. 1801 (3), 289-298 (2010).</li><li>Pearson, G., Soleimanpour, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ubiquitin-dependent+mitophagy+complex+maintains+mitochondrial+function+and+insulin+secretion+in+beta+cells.">A ubiquitin-dependent mitophagy complex maintains mitochondrial function and insulin secretion in beta cells.</a> Autophagy. 14 (7), 1160-1161 (2018).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomes+reveal+characteristic+features+of+human+pancreatic+islet+cell+types.">Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types.</a> EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).</li><li>DiGruccio, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+alpha,+beta+and+delta+cell+transcriptomes+reveal+that+ghrelin+selectively+activates+delta+cells+and+promotes+somatostatin+release+from+pancreatic+islets.">Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets.</a> Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).</li><li>Lawlor, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomes+identify+human+islet+cell+signatures+and+reveal+cell-type&#8211;specific+expression+changes+in+type+2+diabetes.">Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type&#8211;specific expression changes in type 2 diabetes.</a> Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).</li><li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+islets+contain+four+distinct+subtypes+of+&#946;+cells.">Human islets contain four distinct subtypes of &#946; cells.</a> Nature Communications. 7, 11756 (2016).</li><li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+major+pancreatic+cell+types+and+long-term+culture-initiating+cells+using+novel+human+surface+markers.">Isolation of major pancreatic cell types and long-term culture-initiating cells using novel human surface markers.</a> Stem Cell Research. 1 (3), 183-194 (2008).</li><li>Jayaraman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+detection+of+viable+human+pancreatic+beta+cells+by+flow+cytometry+using+fluorophores+that+selectively+detect+labile+zinc,+mitochondrial+membrane+potential+and+protein+thiols.">A novel method for the detection of viable human pancreatic beta cells by flow cytometry using fluorophores that selectively detect labile zinc, mitochondrial membrane potential and protein thiols.</a> Cytometry Part A. 73 (7), 615-625 (2008).</li><li>Arda, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Dependent+Pancreatic+Gene+Regulation+Reveals+Mechanisms+Governing+Human+&#223;-Cell+Function.">Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human &#223;-Cell Function.</a> Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).</li><li>Allen, G. F. G., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+iron+triggers+PINK1/Parkin-independent+mitophagy.">Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy.</a> EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).</li><li>Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. -. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+Parkin+Zone:+Mitophagy+without+Parkin.">No Parkin Zone: Mitophagy without Parkin.</a> Trends in Cell Biology. , (2018).</li></ol>

Her beskriver vi en enkel og effektiv tilgang til brug af NRDP1: USP8 PLA i væv/celler af interesse for at kvantificere dannelse af opstrøms mitophagy komplekser. Vi har tidligere bekræftet dannelsen af CLEC16A-NRDP1-USP8 mitophagy kompleks i bugspytkirtlen beta celler af flere metoder, herunder Co-immunoprecipitation eksperimenter, celle-fri interaktion undersøgelser, og in vitro samt celle-baserede allestedsnærværende assays, og demonstrerede, hvordan dette komplekse drev regulerede mitophagic flux<sup class="xre...

Bugspytkirtel beta celler producere insulin kræves for at opretholde normal glukose homøostase, og deres fiasko resulterer i udviklingen af alle former for diabetes. Beta celler bevarer en robust mitokondriel kapacitet til at generere den energi, der kræves for at koble glukose metabolisme med insulin frigivelse. For nylig er det blevet klart, at opretholdelsen af funktionelle mitokondrie masse er af afgørende betydning for optimal beta celle funktion1,2,3. For at opretholde funktionelle mitokondrie masse, beta celler stole på kvalitetskontrolmekanismer til at fjerne dysfunktionelle, beskadiget, eller aldrende mitokondrier4. Vi og andre har tidligere påvist, at beta celler er afhængige af en specialiseret form for mitokondriel omsætning, kaldet mitokondrie autophagy (eller mitophagy), at opretholde mitokondrie kvalitetskontrol i både gnaver og menneskelige Holme1, 2,5. Desværre, der var dog ingen simpel metode til at detektere mitophagy, eller endogent udtrykte mitophagy komponenter, i humane bugspytkirtel beta celler.
Vi har for nylig vist, at upstream regulering af mitophagy i beta celler er afhængig af dannelsen af et protein kompleks bestående af E3 ligases CLEC16A og NRDP1 og deubiquitinase USP81. NRDP1 og USP8 er blevet vist selvstændigt at påvirke mitophagy gennem handling på den centrale mitophagy initiator Parkin6,7. NRDP1 mål PARKIN for allestedsnærværende og nedbrydning at slukke mitophagy6, og USP8 specifikt deubiquitinates K6-forbundet Parkin at fremme sin translokation til mitokondrier7. Nærhed ligering assay (PLA) teknologi har været en nylig fremgang inden for protein interaktion biologi8, tillader visualisering af endogene protein interaktioner in situ i enkeltceller, og er ikke begrænset af knappe prøvemateriale. Denne metode er særligt fristende for menneskelig ø/beta cellebiologi, på grund af den sparsomme prøve tilgængelighed, kombineret med behovet for at forstå fysiologisk relevante protein komplekser inden for heterogene celletyper.
Udnytte PLA tilgang, vi er i stand til at observere vigtige endogene mitophagy komplekser i primære menneskelige bugspytkirtel beta celler og neuronal cellelinjer, og demonstrere virkningerne af en diabetogenic miljø på mitophagy pathway1. Sammenfattende er det overordnede mål med denne protokol at analysere specifikke mitophagy-protein komplekser i væv, der mangler rigeligt materiale, eller hvor konventionelle protein interaktionsundersøgelser ikke er mulige.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA 1X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Block solution</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>Use 1X PBS, add 10 % donkey serum, and 0.3% Triton X-100 detergent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer A</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>To make 1L: Mix 8.8g NaCl, 1.2g Tris base, 500ul Tween-20, with 750mL ddH20. pH to 7.5 with HCl, and fill to 1L. Filter solution and store at 4C. Bring to RT before experimental use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer B</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>To make 1L: Mix 5.84g NaCl, 4.24g Tris base, 26g Tris-HCl with 500mL ddH20. pH to 7.5, and fill to 1L. Filter solution and store a 4C. Bring to RT before experimental use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5-conjugated AffiniPure donkey anti-goat</td>
			<td>Jackson Labs</td>
			<td>705-175-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detection Reagents Red</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>DU092008-100RXN</td>
			<td>Kit containing: ligation solution stock (5X), ligase, amplification solution stock (5X) and polymerase.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink PLA probe anti-mouse MINUS</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>DU092004-100RXN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink PLA probe anti-rabbit PLUS</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>DU092002-100RXN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polyclonal anti-PDX1 (clone A17)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-14664</td>
			<td>RRID: AB_2162373</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIN6 pancreatic cell line</td>
			<td>Gift from D. Stoffers</td>
			<td></td>
			<td>Mouse insulinoma cell line, utilized for cell-based assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-USP8 antibody (clone US872)</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>SAB200527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pap-pen</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>195505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use to seal antibody and probe solutions on your cells to prevent evaporation when using small solution volumes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBT (phosphate buffered saline with triton)</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>To make 50mL: 43.5mLddH2O, 5mL 10X PBS, 0.5mL 10X BSA(100mg/mL solution), 1mL 10% triton X-100 solution in ddH20)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 10X</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIM(ABS) Human AB serum</td>
			<td>Prodo Labs</td>
			<td>PIM-ABS001GMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIM(G) (glutamine)</td>
			<td>Prodo Labs</td>
			<td>PIM-G001GMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIM(S) media</td>
			<td>Prodo Labs</td>
			<td>PIM-S001GMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PR619</td>
			<td>Apex Bio</td>
			<td>A812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td>Life Technologies (Molecular Probes)</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal anti-FLRF/RNF41 (Nrdp1)</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>A300-049A</td>
			<td>RRID: AB_2181251</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y cells</td>
			<td>Gift from L. Satin</td>
			<td></td>
			<td>Human neuroblastoma cell line, utilized for cell-based assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water for RNA work (DEPC water)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP361-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of endogenous mitophagy complexes in situ in human pancreatic beta cells utilizing proximity ligation assay

Mitophagy er en vigtig mitokondriel kvalitetskontrol pathway, som er afgørende for bugspytkirtlen ø beta celle bioenergetik til brændstof glukose-stimuleret insulin frigivelse. Vurdering af mitophagy er udfordrende og kræver ofte genetiske journalister eller flere komplementære teknikker, der ikke let udnyttes i vævsprøver, såsom primære menneskelige bugspytkirtel Holme. Her demonstrerer vi en robust tilgang til at visualisere og kvantificere dannelse af vigtige endogene mitophagy komplekser i primære menneskelige pancreas-øer. Udnytte den følsomme nærhed ligering assay teknik til at detektere interaktion af mitophagy regulatorer NRDP1 og USP8, vi er i stand til specifikt kvantificere dannelse af essentielle mitophagy komplekser in situ. Ved at koble denne fremgangsmåde til kontra farvning for transkriptionsfaktoren PDX1, kan vi kvantificere mitophagy komplekser, og de faktorer, der kan forringe mitophagy, specifikt inden for beta celler. Den metode, vi beskriver, overvinder behovet for store mængder af cellulære ekstrakter, der kræves til andre protein-protein interaktionsstudier, såsom immunopræcipitation (IP) eller massespektrometri, og er ideel til dyrebare menneskelige ø prøver generelt ikke rådighed i tilstrækkelige mængder til disse tilgange. Denne metode overfløder endvidere behovet for flow sorterings teknikker til rensning af beta celler fra en heterogen ø-population til downstream-protein anvendelser. Således beskriver vi en værdifuld protokol til visualisering af mitophagy meget kompatibel til brug i heterogene og begrænsede cellepopulationer.

Vi gennemførte indledende eksperimenter i MIN6 bugspytkirtlen beta cellelinje og sh-SY5Y neuroblastom Cell line sh-SY5Y, at optimere og bekræfte både specificiteten af antistoffer og visualiseret protein interaktioner. MIN6 celler blev belagt på dæksedler ved 30.000 celler/mL og venstre for at overholde 48 h, SH-SY5Y celler blev belagt på dæksedler ved 15.000 celler/mL og venstre for at holde sig til 24 h. PLA-protokollen blev derefter fulgt som ovenfor, begyndende ved trin 1.2.3. ...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay at JoVE.com

Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

Visualisering af endogene Mitophagy komplekser in situ i humane bugspytkirtel beta celler udnytte nærhed ligation assay

Denne protokol skitserer en metode til kvantitativ analyse af mitophagy protein kompleksdannelse specifikt i beta celler fra primære menneskelige ø prøver. Denne teknik giver således mulighed for analyse af mitophagy fra begrænset biologisk materiale, som er afgørende i dyrebare menneskelige bugspytkirtel beta celleprøver.

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...

Denne protokol giver os mulighed for at overvåge endogene mitophagy komplekser i humane væv såsom betaceller, lette mitophagy forskning i pivotal translationelt relevante væv. En fordel ved denne teknik er dens evne til at visualisere vigtige mitophagy komplekser in vivo i væv med en sjælden tilgængelighed eller i små stikprøvetal. Efter isolation i henhold til standard protokoller, kultur fire til seks gange 10 til den tredje menneskelige ø ækvivalenter i 10 milliliter komplet pancreas ø medium i mindst en dag ved 37 grader Celsius.Den næste dag, bruge en dissektion lys mikroskop på en tre gange forstørrelse til at tælle de enkelte menneskelige øer i kulturen. Pick 40 holme pr behandling eller tilstand af interesse i 1,5 milliliter rør af ø-medium. Afsintetgør holmene ved centrifugering og resuspenderede pellet i en milliliter PBS suppleret med 50 mikromolar PR619.Inverter røret og opsaml holmene ved centrifugering til endnu en vask i frisk PBS plus deubiquitinase-hæmmer. Efter den anden centrifugering, dissociate holmene i enkelte celler med 125 mikroliter på 0,25% trypsin plus inhibitor i tre minutter ved 37 grader Celsius med periodisk blid pipettering. I slutningen af inkubationen, standse reaktionen med en milliliter på 37 grader Celsius opvarmet pancreas ø medium suppleret med PR619.Opsaml holmene ved centrifugering til to vaske i frisk PBS plus inhibitor pr. vask. Efter den anden vask, resuspend de dissocierede holme i 150 mikroliter af frisk PBS plus hæmmer. Ved overholdelse og fiksering af de enkelte holme, cytospin celleopløsningen på matteret ladede mikroskop dias og skitsere det cellulære område med en hydrofobe pen.Fastgør derefter de omkransede celler med 4% paraformaldehyd og PBS i 15 minutter ved stuetemperatur. Til immunhisemisk analyse af øprøverne vaskes cellerne med to fem minutters vask i PBS ved stuetemperatur efterfulgt af ikke-specifik bindingsblokering med 10% æselserum og PBS plus 0,3% vaskemiddel i en time ved stuetemperatur. Ved afslutningen af blokeringsinkubationen, coincubate cellerne med primær mus antistof mod ubiquitin-specifikke peptidase 8, primær kanin antistof mod neuregulin receptor nedbrydning protein-1, og en markør specifikt for beta celle identifikation, der ikke blev rejst i mus eller kanin for ikke at forstyrre nærhed ligyation assay signal natten over ved fire grader Celsius.Næste morgen vaskes prøverne med to fem minutters vaske i PBS på en rocker. Tilsæt anti-ged Cy5 sekundært antistof til en frisklavet nærhed ligation assay opløsning. Efter den anden vask, mærke hver ø prøve med 20 mikroliter af sonde opløsning og inddrive dias med plastfolie til en times inkubation ved 37 grader Celsius.Ved inkubationens afslutning vaskes cellerne med to fem minutters vask i buffer A på en rocker efterfulgt af inkubation med 20 mikroliter frisklavet ligationsopløsning suppleret med 0,25 enheder pr. mikroliter ligase pr. dias for en 30-minutters inkubation ved 37 grader Celsius. Ved slutningen af ligationen vaskes cellerne to gange med buffer A i to minutter pr. vask. Dæk hver prøve med 20 mikroliter forstærkningsopløsninger suppleret med polymerase for en 100-til 120-minutters inkubation ved 37 grader Celsius.For at forberede cellerne til billeddannelse vaskes prøverne to gange i frisk buffer A i 10 minutter pr. vask på en rocker efterfulgt af en vask i 0,1 x buffer B i to minutter på rockeren. Efter den sidste vask monteres objektglassene med en dråbe monteringsmedium, der indeholder DAPI, og der anbringes forsigtigt en coverslip over hver prøve ved hjælp af en skalpel for at presse eventuelle bobler ud. Derefter forsegle coverslips med klar neglelak omkring kanterne.Hvis du vil afbilde prøverne, skal du placere et dias på scenen af et mikroskop, der kan opfange flere fokale planer, og vælge 100 gange forstørrelsen. Indstil Z-stack-højden til ca. 0,45 mikrometer og de relevante pletten, kontrastain- og livecellesignalsimcitations- og emissionsparametrene. Få mindst ni forskellige fokalplanbilleder.For at sikre, at fluorescens billede baggrundssignaler og omstrejfende lys er minimeret, behandle billederne udnytte en to-dimensionel deconvolution nærmeste nabo algoritme ved hjælp af en standard billedbehandling software valg. For at kvantificere nærhed ligation assay interaktioner, åbne ImageJ og åbne nærhed ligation assay billede. Klik på Billede fra det første skarpt fokusbillede, og vælg Juster og Tærskel.Juster tærsklen for at fjerne alt det ikke-specifikke nærhedskurationsskurssignal, og noter tærskeljusteringen for at forsøge at holde signalet ensartet under hele analysen. Klik på Proces, og vælg Binær og Gør Binær. Bekræft, at størrelse er indstillet til nul til uendeligt, Circularity er indstillet til nul til én, Vis er indstillet til Konturer og kontrollere Display resultater og Ryd resultater felter.Bemærk antallet af partikler, der analyseres i et regneark, der angiver prøven og Z-stack position. Klik derefter på Analysér og analysér partikler for at måle partiklerne. Når alle in-focus Z-stacks for prøven er blevet analyseret, skal du sende det samlede antal partikler til prøven i regnearket for at kvantificere det samlede antal interaktioner.De antistoffer, der anvendes i nærhedsanalysen, er specifikke for liganerne og viser ingen overlapning. Som observeret er dispersionsprotokollen yderst effektiv til at opnå enkelte celler i mikroskopets synsfelt til downstream-analyse, og betacellefarvningen bevares efter nærhedssvinationsanalysefarvning i primære humane holme. Ved hjælp af de demonstrerede teknikker, det kunne bestemmes, at samspillet mellem neuregulin receptor nedbrydning protein-1 og ubiquitin-specifikke peptidase 8 er faldet efter en 48-timers eksponering for palmitat, fremhæver gennemførligheden af denne analyse til vurdering af centrale endogene vantifaktorer efter diabetogene stimuli.En effektiv og skånsom spredning af menneskelige holme er afgørende for at sikre kvantificering af de korrekte cellepopulationer nedstrøms. PLA giver mulighed for vurdering af vigtige mitophagy komplekser i humane ø-prøver gør det muligt at analysere mitophagy og biologisk vigtige menneskelige patientprøver flytte området for diabetes forskning fremad.

Research

JoVE Journal

Medicine

Staining Protocols for Human Pancreatic Islets

Farvning protokoller for Menneskerettigheder bugspytkirteløer

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and ...

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Forbedret Visualisering af lungemetastaser ved Single Cell Opløsning i mus ved kombinerede<em&gt; In-situ</em&gt; Perfusion af lungevæv og X-gal-farvning af<em&gt; LacZ</em&gt;-Mærkede tumorceller

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells

Cokultur Analyse af Ekstracellulære proteininteraktioner påvirker insulin fra bugspytkirtlens beta-celler

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within ...

A Protocol for Genetic Induction and Visualization of Benign and Invasive Tumors in Cephalic Complexes of Drosophila melanogaster

A Protocol for Genetic Induction and Visualization of Benign and Invasive Tumors in Cephalic Complexes of Drosophila melanogaster

En protokol for genetiske induktion og Visualisering af godartede og invasive tumorer, i Cephalic komplekser af<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila has illuminated our  understanding of the genetic basis of normal development and disease for the  past several decades and today it continues ...

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Simulering Pancreas Neuroplasticitet:<em&gt; In Vitro</em&gt; Dual-neuron Plasticitet Assay

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Multi-elektrodeformation Optagelser af menneskelige Epileptiske Postoperativ cortexvæv

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studere i bugspytkirtlen Kræft stamceller Karakteristik for udvikling af nye behandlingsstrategier

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Udtømning af Mouse Celler fra Humane tumorxenoplantater Markant Forbedrer Downstream Analyse af Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

In Vitro og In Vivo påvisning af Mitophagy i humane celler, C. Elegansog mus

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

Application of End-to-end Anastomosis in Robotic Central Pancreatectomy

Anvendelse af ende-til-ende anastomose i robot centrale Pancreatectomy

Central pancreatectomy is carried out for the treatment of benign or low-malignant potential tumors located in the pancreatic neck or proximal part of ...