Name: visualization of endogenous mitophagy complexes in situ in human pancreatic beta cells utilizing proximity ligation assay
Uploaded: 2019-05-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay at JoVE.com

המחברים מכירים בתמיכת JDRF (CDA-2016-189 וסרה-2018-539), המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות, המכונים הלאומיים לבריאות (R01-DK-108921), משפחת Brehm, ומשפחת אנטוני. פרס לפיתוח קריירה JDRF ל-S.A.S. נתמך בחלקו על ידי האקדמיה לסוכרת דנית, אשר נתמכת על ידי קרן נובו Nordisk.

השימוש של האדם תורם דה מזוהה הלבלב האנושי הוא באמצעות הלוח סקירה מוסדית (IRB) פטור ובהתאם למדיניות האוניברסיטה של מישיגן IRB. איונים הלבלב האנושי סופקו על ידי התוכנית הפצה משולבת של איון/NIDDK של משולב הפצת האיים (IIDP).
1. הכנה לדוגמא של האדם איון
<ol><li>
דיסוציאציה של תא בודד...

<ol>
	<li>Pearson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clec16a,+Nrdp1,+and+USP8+Form+a+Ubiquitin-Dependent+Tripartite+Complex+That+Regulates+beta-Cell+Mitophagy.">Clec16a, Nrdp1, and USP8 Form a Ubiquitin-Dependent Tripartite Complex That Regulates beta-Cell Mitophagy.</a> Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).</li><li>Soleimanpour, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diabetes+susceptibility+gene+Clec16a+regulates+mitophagy.">The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy.</a> Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).</li><li>Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+regulation+of+&#946;-cell+function:+Maintaining+the+momentum+for+insulin+release.">Mitochondrial regulation of &#946;-cell function: Maintaining the momentum for insulin release.</a> Molecular Aspects of Medicine. , (2015).</li><li>Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+by+mitophagy.">Regulation by mitophagy.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 53, 147-150 (2014).</li><li>Soleimanpour, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+Susceptibility+Genes+Pdx1+and+Clec16a+Function+in+a+Pathway+Regulating+Mitophagy+in+beta-Cells.">Diabetes Susceptibility Genes Pdx1 and Clec16a Function in a Pathway Regulating Mitophagy in beta-Cells.</a> Diabetes. 64 (10), 3475-3484 (2015).</li><li>Zhong, L., Tan, Y., Zhou, A., Yu, Q., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RING+Finger+Ubiquitin-Protein+Isopeptide+Ligase+Nrdp1/FLRF+Regulates+Parkin+Stability+and+Activity.">RING Finger Ubiquitin-Protein Isopeptide Ligase Nrdp1/FLRF Regulates Parkin Stability and Activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9425-9430 (2005).</li><li>Durcan, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=USP8+regulates+mitophagy+by+removing+K6-linked+ubiquitin+conjugates+from+parkin.">USP8 regulates mitophagy by removing K6-linked ubiquitin conjugates from parkin.</a> The EMBO Journal. 33 (21), 2473-2491 (2014).</li><li>Gauthier, T., Claude-Taupin, A., Delage-Mourroux, R., Boyer-Guittaut, M., Hervouet, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+Ligation+In+situ+Assay+is+a+Powerful+Tool+to+Monitor+Specific+ATG+Protein+Interactions+following+Autophagy+Induction.">Proximity Ligation In situ Assay is a Powerful Tool to Monitor Specific ATG Protein Interactions following Autophagy Induction.</a> PLoS ONE. 10 (6), e0128701 (2015).</li><li>Silva Xavier, D. a., G, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cells+of+the+Islets+of+Langerhans.">The Cells of the Islets of Langerhans.</a> Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54 (2018).</li><li>Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+islet+plasticity:+Interspecies+comparison+of+islet+architecture+and+composition.">Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition.</a> Islets. 2 (3), 135-145 (2010).</li><li>Cabrera, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unique+cytoarchitecture+of+human+pancreatic+islets+has+implications+for+islet+cell+function.">The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (7), 2334 (2006).</li><li>Brissova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Human+Pancreatic+Islet+Architecture+and+Composition+by+Laser+Scanning+Confocal+Microscopy.">Assessment of Human Pancreatic Islet Architecture and Composition by Laser Scanning Confocal Microscopy.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).</li><li>Babu, D. A., Deering, T. G., Mirmira, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+feat+of+metabolic+proportions:+Pdx1+orchestrates+islet+development+and+function+in+the+maintenance+of+glucose+homeostasis.">A feat of metabolic proportions: Pdx1 orchestrates islet development and function in the maintenance of glucose homeostasis.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 92 (1), 43-55 (2007).</li><li>Poitout, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucolipotoxicity+of+the+pancreatic+beta+cell.">Glucolipotoxicity of the pancreatic beta cell.</a> Biochimica Biophysica Acta. 1801 (3), 289-298 (2010).</li><li>Pearson, G., Soleimanpour, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ubiquitin-dependent+mitophagy+complex+maintains+mitochondrial+function+and+insulin+secretion+in+beta+cells.">A ubiquitin-dependent mitophagy complex maintains mitochondrial function and insulin secretion in beta cells.</a> Autophagy. 14 (7), 1160-1161 (2018).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomes+reveal+characteristic+features+of+human+pancreatic+islet+cell+types.">Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types.</a> EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).</li><li>DiGruccio, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+alpha,+beta+and+delta+cell+transcriptomes+reveal+that+ghrelin+selectively+activates+delta+cells+and+promotes+somatostatin+release+from+pancreatic+islets.">Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets.</a> Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).</li><li>Lawlor, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomes+identify+human+islet+cell+signatures+and+reveal+cell-type&#8211;specific+expression+changes+in+type+2+diabetes.">Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type&#8211;specific expression changes in type 2 diabetes.</a> Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).</li><li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+islets+contain+four+distinct+subtypes+of+&#946;+cells.">Human islets contain four distinct subtypes of &#946; cells.</a> Nature Communications. 7, 11756 (2016).</li><li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+major+pancreatic+cell+types+and+long-term+culture-initiating+cells+using+novel+human+surface+markers.">Isolation of major pancreatic cell types and long-term culture-initiating cells using novel human surface markers.</a> Stem Cell Research. 1 (3), 183-194 (2008).</li><li>Jayaraman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+detection+of+viable+human+pancreatic+beta+cells+by+flow+cytometry+using+fluorophores+that+selectively+detect+labile+zinc,+mitochondrial+membrane+potential+and+protein+thiols.">A novel method for the detection of viable human pancreatic beta cells by flow cytometry using fluorophores that selectively detect labile zinc, mitochondrial membrane potential and protein thiols.</a> Cytometry Part A. 73 (7), 615-625 (2008).</li><li>Arda, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Dependent+Pancreatic+Gene+Regulation+Reveals+Mechanisms+Governing+Human+&#223;-Cell+Function.">Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human &#223;-Cell Function.</a> Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).</li><li>Allen, G. F. G., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+iron+triggers+PINK1/Parkin-independent+mitophagy.">Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy.</a> EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).</li><li>Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. -. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+Parkin+Zone:+Mitophagy+without+Parkin.">No Parkin Zone: Mitophagy without Parkin.</a> Trends in Cell Biology. , (2018).</li></ol>

כאן אנו מתארים גישה פשוטה ויעילה לשימוש NRDP1: USP8 PLA ברקמות/תאים של עניין היווצרות מכמת של מכלולי mitophagy במעלה. בעבר אישרו את היווצרות של מורכבות CLEC16A-NRDP1-USP8 mitophagy בתאי ביתא הלבלב על ידי כמה מתודולוגיות, כולל שיתוף immunoprecipitation ניסויים, תא ללא אינטראקציה לימודי, וחוץ גופית, כמו גם תא מבוסס והפגינו כ?...

תאים ביתא הלבלב לייצר את האינסולין הנדרש כדי לשמור על הומאוסטזיס הגלוקוז נורמלי, וכישלון שלהם תוצאות בפיתוח של כל צורות הסוכרת. תאי בטא שומרים על קיבולת מיטוכונדריאלי חזקה כדי ליצור את האנרגיה הדרושה לחילוף החומרים של גלוקוז עם שחרור אינסולין. לאחרונה, זה התברר כי התחזוקה של מסה מיטוכונדריאלי פונקציונלי היא בעלת חשיבות מרכזית עבור הפונקציה האופטימלית של תא ביתא1,2,3. על מנת לקיים מסה מיטוכונדריאלי פונקציונלי, תאי בטא להסתמך על מנגנוני בקרת איכות כדי להסיר תפקוד, פגום, או הזדקנות המיטוa4. אנחנו ואחרים הוכיחו בעבר כי תאים ביתא להסתמך על צורה מיוחדת של מחזור מיטוכונדריאלי, הנקרא הוראות מיטוכונדריאלי (או mitophagy), כדי לשמור על איכות מיטוכונדריאלי בקרת מכרסמים והאדם האנושי1, 2,5. למרבה הצער, עם זאת, לא היתה שיטה פשוטה כדי לזהות mitophagy, או באופן מידי הביע רכיבים mitophagy, בתאי בטא הלבלב האנושי.
לאחרונה הראינו כי במעלה הזרם של mitophagy בתאי ביתא מסתמך על היווצרות של מתחם חלבון הכולל את E3 ליגסים CLEC16A ו NRDP1 והוא USP81. NRDP1 ו USP8 הוכחו באופן עצמאי להשפיע mitophagy באמצעות פעולה על מפתח מיאופלגיה מיזם parkin6,7. NRDP1 מטרות PARKIN עבור אוביקווינציה והשפלה כדי לכבות את mitophagy6, ו USP8 במיוחד באופן בלתי מקושר K6-parkin לקדם את הטרנסלוקציה שלה כדי המיטומטר7. שיטת החיבור הצמוד (PLA) הטכנולוגיה היתה מקדמה לאחרונה בתחום של אינטראקציה חלבון ביולוגיה8, המאפשר ויזואליזציה של אינטראקציות חלבונים אנדוגניים באתרו תאים בודדים, והוא אינו מוגבל על ידי חומר לדוגמה נדירים. מתודולוגיה זו מפתה במיוחד לביולוגיה של האדם/תא ביתא, בשל הספניות של זמינות המדגם, ביחד לצורך הבנת מתחמי חלבון רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית בתוך סוגי תאים הטרוגנית.
ניצול הגישה PLA, אנחנו מסוגלים להתבונן מרכזי מפתח אנדוגניים מתחמי בתאי בטא הלבלב האנושי העיקרי וקווי התאים עצביים, ולהדגים את ההשפעות של סביבה diabetogenic על מסלול מיטואופג'י1. לסיכום, מטרת היסוד של פרוטוקול זה היא לנתח מתחמי חלבון mitophagy ספציפיים ברקמות חסר חומר שופע, או כאשר מחקרים קונבנציונאלי-חלבון האינטראקציה אינם אפשריים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA 1X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Block solution</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>Use 1X PBS, add 10 % donkey serum, and 0.3% Triton X-100 detergent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer A</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>To make 1L: Mix 8.8g NaCl, 1.2g Tris base, 500ul Tween-20, with 750mL ddH20. pH to 7.5 with HCl, and fill to 1L. Filter solution and store at 4C. Bring to RT before experimental use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer B</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>To make 1L: Mix 5.84g NaCl, 4.24g Tris base, 26g Tris-HCl with 500mL ddH20. pH to 7.5, and fill to 1L. Filter solution and store a 4C. Bring to RT before experimental use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5-conjugated AffiniPure donkey anti-goat</td>
			<td>Jackson Labs</td>
			<td>705-175-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detection Reagents Red</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>DU092008-100RXN</td>
			<td>Kit containing: ligation solution stock (5X), ligase, amplification solution stock (5X) and polymerase.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink PLA probe anti-mouse MINUS</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>DU092004-100RXN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink PLA probe anti-rabbit PLUS</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>DU092002-100RXN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polyclonal anti-PDX1 (clone A17)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-14664</td>
			<td>RRID: AB_2162373</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIN6 pancreatic cell line</td>
			<td>Gift from D. Stoffers</td>
			<td></td>
			<td>Mouse insulinoma cell line, utilized for cell-based assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-USP8 antibody (clone US872)</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>SAB200527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pap-pen</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>195505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use to seal antibody and probe solutions on your cells to prevent evaporation when using small solution volumes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBT (phosphate buffered saline with triton)</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>To make 50mL: 43.5mLddH2O, 5mL 10X PBS, 0.5mL 10X BSA(100mg/mL solution), 1mL 10% triton X-100 solution in ddH20)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 10X</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIM(ABS) Human AB serum</td>
			<td>Prodo Labs</td>
			<td>PIM-ABS001GMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIM(G) (glutamine)</td>
			<td>Prodo Labs</td>
			<td>PIM-G001GMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIM(S) media</td>
			<td>Prodo Labs</td>
			<td>PIM-S001GMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PR619</td>
			<td>Apex Bio</td>
			<td>A812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td>Life Technologies (Molecular Probes)</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal anti-FLRF/RNF41 (Nrdp1)</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>A300-049A</td>
			<td>RRID: AB_2181251</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y cells</td>
			<td>Gift from L. Satin</td>
			<td></td>
			<td>Human neuroblastoma cell line, utilized for cell-based assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water for RNA work (DEPC water)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP361-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of endogenous mitophagy complexes in situ in human pancreatic beta cells utilizing proximity ligation assay

Mitophagy הוא מסלול חיוני בקרת איכות מיטוכונדריאלי, אשר חיוני עבור התא ביתא איון הלבלב ביואנרגיה כדי דלק מגורה ממריצים אינסולין שחרור. הערכה של mitophagy הוא מאתגר ולעתים קרובות דורש כתבים גנטיים או טכניקות משלימים מרובים לא מנוצל בקלות בדגימות רקמות, כגון איואי הלבלב האנושי העיקרי. כאן אנו להפגין גישה חזקה כדי להמחיש ומכמת היווצרות של מתחמי מפתח אנדוגניים מרכזיים באיים הלבלב האנושי העיקרי. ניצול הקירבה רגישות לסדר שיטת החיבור כדי לזהות אינטראקציה של הרגולטורים mitophagy NRDP1 ו USP8, אנחנו מסוגלים במיוחד לכמת היווצרות מתחמי mitophagy חיוניים באתרו. על-ידי צימוד גישה זו כדי להכתים את גורם התמלול PDX1, אנחנו יכולים לכמת את מתחמי mitophagy, ואת הגורמים שיכולים לפגוע mitophagy, במיוחד בתוך תאי בטא. המתודולוגיה שאנו מתארים מתגבר על הצורך בכמויות גדולות של תמציות הסלולר הנדרשות למחקרים של חלבון-חלבון אחרים, כגון immunoprecipitation (IP) או ספקטרומטר מסה, והוא אידיאלי לדגימות של איון אנושי יקרות בדרך כלל לא זמינים בכמויות מספיקות עבור גישות אלה. יתרה מזאת, מתודולוגיה זו בדקה את הצורך בטכניקות מיון זרימה כדי לטהר את תאי הבטא מאוכלוסיית איון הטרוגנית עבור יישומי החלבון במורד הזרם. לפיכך, אנו מתארים פרוטוקול רב ערך עבור ויזואליזציה של mitophagy תואם מאוד לשימוש באוכלוסיות תאים הטרוגנית ומוגבלת.

ערכנו ניסויים הראשונית קו הלבלב MIN6 ביתא תא ואת SH-SY5Y ונוירובלסטומה חוט התא SH-SY5Y, כדי למטב ולאשר הן ספציפיות של הנוגדנים ואת אינטראקציות החלבון דמיינו. MIN6 תאים היו מצופים שמיכות ב 30,000 תאים/mL ושמאלה כדי לדבוק 48 h, SH-SY5Y תאים היו מצופים שמיכות ב 15,000 תאים/mL ושמאלה כדי לדבוק 24 h. לאח?...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay at JoVE.com

Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

ויזואליזציה של מתחמי מיטוגניים אנדוגני באתרו בתאי בטא הלבלב האנושי ניצול שיטת סמיכות הקירבה

פרוטוקול זה מתאר שיטה לניתוח כמותי של היווצרות חלבון mitophagy במיוחד בתאי ביתא מדגימות איון האנושי העיקרי. טכניקה זו ובכך מאפשרת ניתוח של mitophagy מתוך חומר ביולוגי מוגבל, אשר חיוניים בדגימות יקרות של תא הלבלב האנושי.

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...

פרוטוקול זה מאפשר לנו לפקח על קומפלקסים מיטופליים אנדוגניים ברקמות אנושיות כגון תאי בטא, להקל על מחקר מיטופלי ברקמות מרכזיות הרלוונטיות לתרגום. אחד היתרונות של טכניקה זו היא היכולת שלה לדמיין קומפלקסים מיטופליים חשובים ב vivo ברקמות עם זמינות נדירה או במספרים מדגם קטן. לאחר בידוד על פי פרוטוקולים סטנדרטיים, תרבות ארבע עד שש פעמים 10 כדי שווה ערך האי האנושי השלישי ב 10 מיליליטר של איון הלבלב מלא בינוני לפחות יום אחד ב 37 מעלות צלזיוס.למחרת, השתמש במיקרוסקופ אור ניתוח בהגדלה של פי שלושה כדי לספור איונים אנושיים בודדים בתרבות. בחר 40 איונים לכל טיפול או מצב של עניין לתוך 1.5 צינורות מיליליטר של מדיום איון. מסיסים את איי הצנטריפוגה ומבזבזים מחדש את גלולת הכדור במיליליטר אחד של PBS בתוספת 50 PR619 מיקרומולרי.להפוך את הצינור ולאסוף את איונים על ידי צנטריפוגה עבור שטיפה שנייה PBS טרי בתוספת מעכב deubiquitinase. לאחר הצנטריפוגה השנייה, לנתק את האיים לתאים בודדים עם 125 microliters של 0.25% טריפסין בתוספת מעכב במשך שלוש דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם צינורות עדינים תקופתיים. בסוף הדגירה, לעצור את התגובה עם מיליליטר אחד של 37 מעלות צלזיוס חימם איון הלבלב בינוני בתוספת PR619.לאסוף את איונים על ידי צנטריפוגה עבור שתי שטיפות PBS טרי בתוספת מעכב לכל לשטוף. לאחר הכביסה השנייה, יש להתריע מחדש על האיים המנותקים ב-150 מיקרוליטרים של PBS טרי בתוספת מעכב. עבור דבקות וקבוע של איונים בודדים, cytospin פתרון התא על שקופיות מיקרוסקופ טעון חלבי מתאר את האזור התאי עם עט הידרופובי.לאחר מכן תקן את התאים המוקומים עם 4% paraformaldehyde ו- PBS למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לניתוח אימונוהיסטוכימי של דגימות האיון, שטפו את התאים בשתי שטיפות של חמש דקות ב-PBS בטמפרטורת החדר, ואחריהן חסימת כריכה לא ספציפית עם סרום חמור 10% ו-PBS ועוד 0.3% חומר ניקוי למשך שעה בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה חסימה, coincubate התאים עם נוגדן העכבר העיקרי נגד פפטידאז ספציפי ubiquitin 8, נוגדן ארנב ראשי נגד פגיעה קולטן neuregulin חלבון-1, וסמן ספציפי לזיהוי תא בטא שלא הועלה בעכבר או ארנב כדי לא להפריע את אות אסאי קשירה הקרבה לילה בארבע מעלות צלזיוס.למחרת בבוקר, לשטוף את הדגימות עם שתי שטיפות חמש דקות ב PBS על נדנדה. הוסיפו נוגדן משני נגד עיזים Cy5 לתסכות רצועות קירבה טריות. לאחר הכביסה השנייה, סמן כל דגימת איון עם 20 מיקרוליטרים של פתרון בדיקה ושחזר את השקופיות עם סרט פלסטיק עבור דגירה של שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס.בסוף הדגירה, לשטוף את התאים עם שתי שטיפות חמש דקות חיץ A על נדנדה ואחריו דגירה עם 20 microliters של פתרון קשירה מוכן טרי בתוספת 0.25 יחידות למיקרוליטר של רצועות לכל שקופית עבור דגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. בסוף הרצועה, לשטוף את התאים פעמיים עם חיץ A במשך שתי דקות לכל לשטוף. מכסים כל דגימה עם 20 מיקרוליטר של פתרונות הגברה בתוספת פולימראז עבור דגירה של 100 עד 120 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.כדי להכין את התאים להדמיה, לשטוף את הדגימות פעמיים במאגר טרי A במשך 10 דקות לשטוף על נדנדה ואחריו לשטוף אחד ב 0.1x חיץ B במשך שתי דקות על הנדנדה. לאחר הכביסה האחרונה, הר את השקופיות עם טיפה של מדיום הרכבה המכיל DAPI ובזהירות למקם כיסוי על כל מדגם באמצעות אזמל כדי ללחוץ על כל בועות. ואז לאטום את כיסויים עם לק ברור סביב הקצוות.כדי לדמיין את הדגימות, מקם שקופית על הבמה של מיקרוסקופ המסוגל ללכוד מישורי מוקד מרובים ובחר את ההגדלה פי 100. הגדר את גובה מחסנית Z לפרמטרים של כ- 0.45 מיקרומטר ואת הפרמטרים המתאימים של אותות כתם, ניתוב נגדי ותאים חיים. השג לפחות תשע תמונות שונות של מישור מוקד.כדי להבטיח שאותות הרקע של תמונת הפלואורסצנטיות והאור התועה ימוזערו, עבד את התמונות תוך שימוש באלגוריתם השכן הדו-ממדי הקרוב ביותר באמצעות תוכנת עיבוד תמונה סטנדרטית לבחירה. כדי לכמת את אינטראקציות ההסטה של רצועות הקירבה, פתח את ImageJ ופתח את תמונת ההסטה של הקשירה הקרבה. החל מהתמונה הראשונה במוקד, לחצו על 'תמונה' ובחרו 'התאם' ו'סף'.התאם את הסף כדי להסיר את כל אות ההקשה על רצועות קירבה שאינן ספציפיות וציין את התאמת הסף כדי לנסות לשמור על האות עקבי לאורך כל הניתוח. לחץ על תהליך ובחר בינארי והפוך לערך בינארי. ודא שהגודל מוגדר כאפס עד אינסוף, המעגליות מוגדרת כאפס לאפס, הצג מוגדר כקווי מתאר וסמן את התיבות הצג תוצאות ונקה תוצאות.שים לב למספר החלקיקים שנותחו בגיליון אלקטרוני המציין את מיקום המדגם ואת מיקום מחסנית Z. לאחר מכן לחץ על נתח וניתוח חלקיקים כדי למדוד את החלקיקים. כאשר כל ערימות Z בפוקוס עבור המדגם נותחו, שלח את המספר הכולל של חלקיקים עבור המדגם בגיליון האלקטרוני כדי לכמת את המספר הכולל של אינטראקציות.הנוגדנים המשמשים בבדיקת הקרבה הם ספציפיים לליגנדים ולא מדגימים חפיפה כלשהי. כפי שנצפה, פרוטוקול הפיזור יעיל מאוד בהשגת תאים בודדים בשדה המיקרוסקופ של התצוגה לניתוח במורד הזרם וכתמים של תאי בטא נשמרים לאחר פגיעה ברצועה הקרבה באזורים האנושיים העיקריים. באמצעות טכניקות הוכח, ניתן לקבוע כי האינטראקציה של חלבון השפלה קולטן neuregulin-1 ו peptidase ספציפי בכל מקום 8 הוא ירד בעקבות חשיפה של 48 שעות פלמיטט, הדגשת ההיתכנות של היתכנות זו להערכת גורמי מיטופי אנדוגני מפתח בעקבות גירויים דיאבטוגניים.הפיזור היעיל והעדין של איונים אנושיים חיוני להבטחת כימות אוכלוסיות התאים הנכונות במורד הזרם. PLA מאפשרת הערכה של מתחמי מיטופלגיה חשובים בדגימות איון אנושיות המאפשרות ניתוח של דגימות מיטופליות ודגימות של מטופלים אנושיים חשובים ביולוגית שמניע את תחום מחקר הסוכרת קדימה.

Research

JoVE Journal

Medicine

Staining Protocols for Human Pancreatic Islets

הפרוטוקולים מכתים עבור איי הלבלב אדם

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and ...

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

ויזואליזציה המשופרת של גרורות בריאות ברזולוצית תא בודדה בעכברים על ידי משולב<em&gt; באתרו</em&gt; זלוף של רקמת ריאה וכתמי X-גל של<em&gt; LacZ</emגידול תאים&gt; תייג-

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells

ניתוח Coculture של אינטראקציות חלבון תאיות המשפיעות על הפרשת אינסולין על ידי תאים בטא בלבלב

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within ...

A Protocol for Genetic Induction and Visualization of Benign and Invasive Tumors in Cephalic Complexes of Drosophila melanogaster

A Protocol for Genetic Induction and Visualization of Benign and Invasive Tumors in Cephalic Complexes of Drosophila melanogaster

פרוטוקול גנטי אינדוקציה ויזואליזציה של גידולים שפירים ופולשני בסוג cephalic מכלולי<em&gt; Melanogaster דרוזופילה</em

Drosophila has illuminated our  understanding of the genetic basis of normal development and disease for the  past several decades and today it continues ...

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

הדמיית הלבלב Neuroplasticity:<em&gt; במבחנה</em&gt; Dual-נוירון פלסטיות Assay

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

הקלטות מערך רב-אלקטרודה של רקמה האנושית אפילפטיים לאחר הניתוח בקליפת המוח

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

לומד סרטן לבלב גזע מאפייני תא לפיתוח טיפול חדש אסטרטגיות

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

חסך בתאי עכבר מן xenografts גידול האנושי משפר משמעותי ניתוח במורד זרם של תאי יעד

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

במבחנה and In Vivo זיהוי של Mitophagy ב תאים אנושיים, C. Elegansועכברים

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

Application of End-to-end Anastomosis in Robotic Central Pancreatectomy

יישום של End-to-end השקה ב Pancreatectomy המרכזית רובוטית

Central pancreatectomy is carried out for the treatment of benign or low-malignant potential tumors located in the pancreatic neck or proximal part of ...