Name: visualization of endogenous mitophagy complexes in situ in human pancreatic beta cells utilizing proximity ligation assay
Uploaded: 2019-05-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay at JoVE.com

Gli autori riconoscono il sostegno al finanziamento da JDRF (CDA-2016-189 e SRA-2018-539), il National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, National Institutes of Health (R01-DK-108921), la famiglia Brehm e la famiglia Anthony. Il JDRF Career Development Award a S.A.S. è in parte sostenuto dalla Danish Diabetes Academy, sostenuta dalla Novo Nordisk Foundation.

L'uso di isole pancreatiche umane de-identificate del donatore avviene tramite un'esenzione dell'IRB (Institutional Review Board) e in conformità con la politica IRB dell'Università del Michigan. Le isole pancreatiche umane sono state fornite dal programma integrato di distribuzione dell'isola (IIDP) sponsorizzato da NIH/NIDDK.
1. Preparazione del campione di isleta umana
<ol><li>
Dissociazione a cella singola
	<ol>
<li>Campioni di isolotto umano di coltura (4000-6000 equi...

<ol>
	<li>Pearson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clec16a,+Nrdp1,+and+USP8+Form+a+Ubiquitin-Dependent+Tripartite+Complex+That+Regulates+beta-Cell+Mitophagy.">Clec16a, Nrdp1, and USP8 Form a Ubiquitin-Dependent Tripartite Complex That Regulates beta-Cell Mitophagy.</a> Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).</li><li>Soleimanpour, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diabetes+susceptibility+gene+Clec16a+regulates+mitophagy.">The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy.</a> Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).</li><li>Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+regulation+of+&#946;-cell+function:+Maintaining+the+momentum+for+insulin+release.">Mitochondrial regulation of &#946;-cell function: Maintaining the momentum for insulin release.</a> Molecular Aspects of Medicine. , (2015).</li><li>Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+by+mitophagy.">Regulation by mitophagy.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 53, 147-150 (2014).</li><li>Soleimanpour, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+Susceptibility+Genes+Pdx1+and+Clec16a+Function+in+a+Pathway+Regulating+Mitophagy+in+beta-Cells.">Diabetes Susceptibility Genes Pdx1 and Clec16a Function in a Pathway Regulating Mitophagy in beta-Cells.</a> Diabetes. 64 (10), 3475-3484 (2015).</li><li>Zhong, L., Tan, Y., Zhou, A., Yu, Q., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RING+Finger+Ubiquitin-Protein+Isopeptide+Ligase+Nrdp1/FLRF+Regulates+Parkin+Stability+and+Activity.">RING Finger Ubiquitin-Protein Isopeptide Ligase Nrdp1/FLRF Regulates Parkin Stability and Activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9425-9430 (2005).</li><li>Durcan, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=USP8+regulates+mitophagy+by+removing+K6-linked+ubiquitin+conjugates+from+parkin.">USP8 regulates mitophagy by removing K6-linked ubiquitin conjugates from parkin.</a> The EMBO Journal. 33 (21), 2473-2491 (2014).</li><li>Gauthier, T., Claude-Taupin, A., Delage-Mourroux, R., Boyer-Guittaut, M., Hervouet, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+Ligation+In+situ+Assay+is+a+Powerful+Tool+to+Monitor+Specific+ATG+Protein+Interactions+following+Autophagy+Induction.">Proximity Ligation In situ Assay is a Powerful Tool to Monitor Specific ATG Protein Interactions following Autophagy Induction.</a> PLoS ONE. 10 (6), e0128701 (2015).</li><li>Silva Xavier, D. a., G, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cells+of+the+Islets+of+Langerhans.">The Cells of the Islets of Langerhans.</a> Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54 (2018).</li><li>Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+islet+plasticity:+Interspecies+comparison+of+islet+architecture+and+composition.">Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition.</a> Islets. 2 (3), 135-145 (2010).</li><li>Cabrera, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unique+cytoarchitecture+of+human+pancreatic+islets+has+implications+for+islet+cell+function.">The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (7), 2334 (2006).</li><li>Brissova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Human+Pancreatic+Islet+Architecture+and+Composition+by+Laser+Scanning+Confocal+Microscopy.">Assessment of Human Pancreatic Islet Architecture and Composition by Laser Scanning Confocal Microscopy.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).</li><li>Babu, D. A., Deering, T. G., Mirmira, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+feat+of+metabolic+proportions:+Pdx1+orchestrates+islet+development+and+function+in+the+maintenance+of+glucose+homeostasis.">A feat of metabolic proportions: Pdx1 orchestrates islet development and function in the maintenance of glucose homeostasis.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 92 (1), 43-55 (2007).</li><li>Poitout, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucolipotoxicity+of+the+pancreatic+beta+cell.">Glucolipotoxicity of the pancreatic beta cell.</a> Biochimica Biophysica Acta. 1801 (3), 289-298 (2010).</li><li>Pearson, G., Soleimanpour, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ubiquitin-dependent+mitophagy+complex+maintains+mitochondrial+function+and+insulin+secretion+in+beta+cells.">A ubiquitin-dependent mitophagy complex maintains mitochondrial function and insulin secretion in beta cells.</a> Autophagy. 14 (7), 1160-1161 (2018).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomes+reveal+characteristic+features+of+human+pancreatic+islet+cell+types.">Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types.</a> EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).</li><li>DiGruccio, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+alpha,+beta+and+delta+cell+transcriptomes+reveal+that+ghrelin+selectively+activates+delta+cells+and+promotes+somatostatin+release+from+pancreatic+islets.">Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets.</a> Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).</li><li>Lawlor, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomes+identify+human+islet+cell+signatures+and+reveal+cell-type&#8211;specific+expression+changes+in+type+2+diabetes.">Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type&#8211;specific expression changes in type 2 diabetes.</a> Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).</li><li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+islets+contain+four+distinct+subtypes+of+&#946;+cells.">Human islets contain four distinct subtypes of &#946; cells.</a> Nature Communications. 7, 11756 (2016).</li><li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+major+pancreatic+cell+types+and+long-term+culture-initiating+cells+using+novel+human+surface+markers.">Isolation of major pancreatic cell types and long-term culture-initiating cells using novel human surface markers.</a> Stem Cell Research. 1 (3), 183-194 (2008).</li><li>Jayaraman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+detection+of+viable+human+pancreatic+beta+cells+by+flow+cytometry+using+fluorophores+that+selectively+detect+labile+zinc,+mitochondrial+membrane+potential+and+protein+thiols.">A novel method for the detection of viable human pancreatic beta cells by flow cytometry using fluorophores that selectively detect labile zinc, mitochondrial membrane potential and protein thiols.</a> Cytometry Part A. 73 (7), 615-625 (2008).</li><li>Arda, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Dependent+Pancreatic+Gene+Regulation+Reveals+Mechanisms+Governing+Human+&#223;-Cell+Function.">Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human &#223;-Cell Function.</a> Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).</li><li>Allen, G. F. G., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+iron+triggers+PINK1/Parkin-independent+mitophagy.">Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy.</a> EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).</li><li>Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. -. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+Parkin+Zone:+Mitophagy+without+Parkin.">No Parkin Zone: Mitophagy without Parkin.</a> Trends in Cell Biology. , (2018).</li></ol>

Qui descriviamo un approccio semplice ed efficiente per utilizzare NRDP1:USP8 PLA in tessuti/cellule di interesse per quantificare la formazione di complessi mitopagia a monte. In precedenza abbiamo confermato la formazione del complesso mitopagy CLEC16A-NRDP1-USP8 nelle cellule beta pancreatiche da diverse metodologie, tra cui esperimenti di co-immunoprecipitazioni, studi di interazione senza cellule e in vitro e analisi dell'ubiquitinazione, e ha dimostrato come questo complesso aziona regolato flusso mitofagico<sup cl...

Le cellule beta pancreatiche producono l'insulina necessaria per mantenere l'omeostasi normale del glucosio e il loro fallimento si traduce nello sviluppo di tutte le forme di diabete. Le cellule beta mantengono una robusta capacità mitocondriale per generare l'energia necessaria per accoppiare il metabolismo del glucosio con rilascio di insulina. Recentemente, è diventato evidente che il mantenimento della massa mitocondriale funzionale è di fondamentale importanza per la funzione ottimale della cella beta1,2,3. Al fine di sostenere la massa mitocondriale funzionale, le cellule beta si basano su meccanismi di controllo di qualità per rimuovere i mitocondri disfunzionali, danneggiati o i mitocondri di invecchiamento4 . Noi e altri abbiamo precedentemente dimostrato che le cellule beta si basano su una forma specializzata di turnover mitocondriale, chiamata autofagia mitocondriale (o mitopagia), per mantenere il controllo della qualità mitocondriale sia nei roditori che nelle isole umane1, 2,5. Purtroppo, tuttavia, non esisteva un metodo semplice per rilevare la mitofagia, o componenti mitoplasmasi endogenamente espressi, nelle cellule beta pancreatiche umane.
Recentemente abbiamo dimostrato che la regolazione a monte della mitofagia nelle cellule beta si basa sulla formazione di un complesso proteico che comprende i legamenti E3 CLEC16A e NRDP1 e la deubiquitinasi USP81. NRDP1 e USP8 hanno dimostrato indipendentemente di influenzare la mitopfagia attraverso l'azione sull'initiatore di mitopfagia chiave PARKIN6,7. NRDP1 si rivolge a PARKIN per l'ubiquitinazione e la degradazione per spegnere la mitofagia6e USP8 deubiquitinates specificamente PARKIN K6-linked per promuovere la sua traslocazione a mitocondri7. La tecnologia di analisi della legatura di prossimità (PLA) èstata un recente progresso nel campo della biologia dell'interazione delle proteine 8, consentendo la visualizzazione di interazioni endogene di proteine in situ in singole cellule e non è limitata da scarsi materiali campione. Questa metodologia è particolarmente allettante per la biologia delle cellule umane-beta, a causa della disponibilità del campione, unita alla necessità di comprendere i complessi proteici fisiologicamente rilevanti all'interno di tipi di cellule eterogenee.
Utilizzando l'approccio PLA, siamo in grado di osservare i principali complessi mitogeni endogeni nelle cellule beta pancreatiche umane primarie e nelle linee cellulari neuronali, e dimostrare gli effetti di un ambiente diabegenico sul percorso mitopfagia1. In sintesi, l'obiettivo generale di questo protocollo è quello di analizzare specifici complessi proteici mitopagia in tessuti privi di materiale abbondante, o dove non sono possibili studi convenzionali di interazione proteica.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA 1X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Block solution</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>Use 1X PBS, add 10 % donkey serum, and 0.3% Triton X-100 detergent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer A</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>To make 1L: Mix 8.8g NaCl, 1.2g Tris base, 500ul Tween-20, with 750mL ddH20. pH to 7.5 with HCl, and fill to 1L. Filter solution and store at 4C. Bring to RT before experimental use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer B</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>To make 1L: Mix 5.84g NaCl, 4.24g Tris base, 26g Tris-HCl with 500mL ddH20. pH to 7.5, and fill to 1L. Filter solution and store a 4C. Bring to RT before experimental use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5-conjugated AffiniPure donkey anti-goat</td>
			<td>Jackson Labs</td>
			<td>705-175-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detection Reagents Red</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>DU092008-100RXN</td>
			<td>Kit containing: ligation solution stock (5X), ligase, amplification solution stock (5X) and polymerase.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink PLA probe anti-mouse MINUS</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>DU092004-100RXN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink PLA probe anti-rabbit PLUS</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>DU092002-100RXN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polyclonal anti-PDX1 (clone A17)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-14664</td>
			<td>RRID: AB_2162373</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIN6 pancreatic cell line</td>
			<td>Gift from D. Stoffers</td>
			<td></td>
			<td>Mouse insulinoma cell line, utilized for cell-based assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-USP8 antibody (clone US872)</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>SAB200527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pap-pen</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>195505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use to seal antibody and probe solutions on your cells to prevent evaporation when using small solution volumes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBT (phosphate buffered saline with triton)</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>To make 50mL: 43.5mLddH2O, 5mL 10X PBS, 0.5mL 10X BSA(100mg/mL solution), 1mL 10% triton X-100 solution in ddH20)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 10X</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIM(ABS) Human AB serum</td>
			<td>Prodo Labs</td>
			<td>PIM-ABS001GMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIM(G) (glutamine)</td>
			<td>Prodo Labs</td>
			<td>PIM-G001GMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIM(S) media</td>
			<td>Prodo Labs</td>
			<td>PIM-S001GMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PR619</td>
			<td>Apex Bio</td>
			<td>A812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td>Life Technologies (Molecular Probes)</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal anti-FLRF/RNF41 (Nrdp1)</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>A300-049A</td>
			<td>RRID: AB_2181251</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y cells</td>
			<td>Gift from L. Satin</td>
			<td></td>
			<td>Human neuroblastoma cell line, utilized for cell-based assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water for RNA work (DEPC water)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP361-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of endogenous mitophagy complexes in situ in human pancreatic beta cells utilizing proximity ligation assay

La mitofagia è un percorso di controllo della qualità mitocondriale essenziale, che è fondamentale per la bioenergetica delle cellule beta delle isoloti pancreatiche per alimentare il rilascio di insulina stimolato dal glucosio. La valutazione della mitofagia è impegnativa e spesso richiede giornalisti genetici o molteplici tecniche complementari non facilmente utilizzate in campioni di tessuto, come le isole pancreatiche primarie umane. Qui dimostriamo un approccio robusto per visualizzare e quantificare la formazione di complessi chiave di mitofagia endogena nelle isole pancreatiche primarie. Utilizzando la tecnica di analisi della legatura di prossimità sensibile per rilevare l'interazione dei regolatori di mitopagia NRDP1 e USP8, siamo in grado di quantificare specificamente la formazione di complessi mitopagia essenziali in situ. Accresciuto questo approccio per contrastare la controtendenza per il fattore di trascrizione PDX1, possiamo quantificare i complessi di mitofagia e i fattori che possono compromettere la mitofagia, in particolare all'interno delle cellule beta. La metodologia che descriviamo supera la necessità di grandi quantità di estratti cellulari necessari per altri studi di interazione proteina-proteina, come l'immunoprecipitazioni (IP) o la spettrometria di massa, ed è ideale per preziosi campioni di isole umane generalmente non disponibili in quantità sufficienti per questi approcci. Inoltre, questa metodologia evita la necessità di tecniche di selezione del flusso per purificare le cellule beta da una popolazione di isolotto eterogeneo per applicazioni di proteine a valle. Perquesto, descriviamo un protocollo prezioso per la visualizzazione della mitofagia altamente compatibile per l'uso in popolazioni cellulari eterogenee e limitate.

Abbiamo condotto esperimenti iniziali nella linea di cellule beta pancreatiche MIN6 e nella linea di cellule del neuroblastoma SH-YY5Y SH-YY5Y, per ottimizzare e confermare sia la specificità degli anticorpi che le interazioni proteiche visualizzate. Le cellule MIN6 sono state placcate su coverlips a 30.000 celle / mL e lasciate aderire per 48 h, le cellule SH-SY5Y sono state placcate su coverlips a 15.000 celle / mL e lasciate aderire per 24 h. Il protocollo PLA è stato poi seguito com...

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Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

Visualizzazione di complessi mitogeni endogeni in Situ in cellule beta pancreatiche umane utilizzando la generazione di testdi di ligazione di prossimità

Questo protocollo delinea un metodo per l'analisi quantitativa della formazione complessa di proteine mitopagia specificamente nelle cellule beta da campioni di isolotto umano primario. Questa tecnica consente quindi l'analisi della mitofagia da materiale biologico limitato, che sono cruciali nei preziosi campioni di cellule beta pancreatiche umane.

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...

Questo protocollo ci consente di monitorare i complessi endogeni di micofagia nei tessuti umani come le cellule beta, facilitando la ricerca sulla micofagia nei tessuti fondamentali traslazionemente rilevanti. Un vantaggio di questa tecnica è la sua capacità di visualizzare importanti complessi di micofagia in vivo in tessuti con una disponibilità rara o in piccoli numeri di campione. Dopo l'isolamento secondo i protocolli standard, la coltura da quattro a sei volte 10 al terzo isolotto umano equivalenti in 10 millilitri di mezzo isolotto pancreatico completo per almeno un giorno a 37 gradi Celsius.Il giorno dopo, usa un microscopio luminoso a dissezione con un ingrandimento tre volte superiore per contare i singoli isolotti umani all'interno della cultura. Raccogliere 40 isolotti per trattamento o condizione di interesse in tubi da 1,5 millilitri di mezzo isolotto. Sedimentare gli isolotti mediante centrifugazione e rimospendare il pellet in un millilitro di PBS integrato con 50 micromolare PR619.Invertire il tubo e raccogliere gli isolotti per centrifugazione per un secondo lavaggio in inibitore fresco della PBS più deubiquitinasi. Dopo la seconda centrifugazione, dissociare gli isolotti in singole cellule con 125 microlitri dello 0,25% di tripside più inibitore per tre minuti a 37 gradi Celsius con pipettazione delicata periodica. Alla fine dell'incubazione, arrestare la reazione con un millilitro di 37 gradi Celsius mezzo isolotto pancreatico riscaldato integrato con PR619.Raccogliere gli isolotti per centrifugazione per due lavaggi in PBS fresco più inibitore per lavaggio. Dopo il secondo lavaggio, rimescolare gli isolotti dissociati in 150 microlitri di PBS fresco più inibitore. Per l'aderenza e la fissazione dei singoli isolotti, citospin la soluzione cellulare su vetrini al microscopio carico smerigliati e delineare l'area cellulare con una penna idrofobica.Quindi fissare le celle accerchiate con paraformaldeide e PBS al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente. Per l'analisi immunoistochimica dei campioni di isolotto, lavare le cellule con due lavaggi di cinque minuti in PBS a temperatura ambiente, seguiti da un blocco legante non specifico con siero d'asino al 10% e PBS più 0,3% detergente per un'ora a temperatura ambiente. Alla fine dell'incubazione di blocco, coincubare le cellule con anticorpo primario del topo contro la peptidasi 8 specifica dell'ubiquitina, anticorpo primario del coniglio contro la proteina di degradazione del recettore della neuregulina-1 e un marcatore specifico per l'identificazione delle cellule beta che non è stato sollevato nel topo o nel coniglio in modo da non interferire con il segnale di dosaggio della legatura di prossimità durante la notte a quattro gradi Celsius.La mattina dopo, lavare i campioni con due lavaggi di cinque minuti in PBS su un rocker. Aggiungere anticorpo secondario Cy5 anti-capra a una soluzione di dosaggio di ligation di prossimità preparata al momento. Dopo il secondo lavaggio, etichettare ogni campione di isolotto con 20 microlitri di soluzione di sonda e recuperare gli scivoli con pellicola di plastica per un'incubazione di un'ora a 37 gradi Celsius.Al termine dell'incubazione, lavare le cellule con due lavaggi di cinque minuti nel tampone A su un rocker seguito da incubazione con 20 microlitri di soluzione di legatura appena preparata integrata con 0,25 unità per microlitro di ligasi per scivolo per un'incubazione di 30 minuti a 37 gradi Celsius. Al termine della legatura, lavare le cellule due volte con tampone A per due minuti per lavaggio. Coprire ogni campione con 20 microlitri di soluzioni di amplificazione integrati con polimerasi per un'incubazione da 100 a 120 minuti a 37 gradi Celsius.Per preparare le cellule per l'imaging, lavare i campioni due volte in tampone fresco A per 10 minuti per lavaggio su un rocker seguito da un lavaggio in tampone B 0,1x per due minuti sul rocker. Dopo l'ultimo lavaggio, montare le diapositive con una goccia di supporto di montaggio contenente DAPI e posizionare con cura un coverslip su ogni campione utilizzando un bisturi per premere eventuali bolle. Quindi sigillare i copripavimenti con smalto chiaro intorno ai bordi.Per immaginire i campioni, posizionare una diapositiva sul palco di un microscopio in grado di catturare più piani focali e selezionare l'ingrandimento 100 volte. Impostare l'altezza della pila Z su circa 0,45 micrometri e i parametri appropriati di eccitazione ed emissione del segnale di macchia, controsostenimento e segnale a celle vive. Ottenere almeno nove diverse immagini del piano focale.Per garantire che i segnali di sfondo dell'immagine a fluorescenza e la luce vagante siano ridotti al minimo, elaborare le immagini utilizzando un algoritmo adiacente più vicino alla deconvoluzione bidimensionale utilizzando un software standard di elaborazione delle immagini preferito. Per quantificare le interazioni del saggio di legatura di prossimità, aprire ImageJ e aprire l'immagine del saggio di ligation di prossimità. A partire dalla prima immagine con lo stato attivo, fare clic su Immagine e selezionare Regola e soglia.Regolare la soglia per rimuovere tutto il segnale di dosaggio della legatura di prossimità non specifico e prendere nota della regolazione della soglia per cercare di mantenere il segnale coerente durante l'analisi. Fate clic su Elabora (Process) e selezionate Binario (Binary) e Rendi binario (Make Binary). Verificare che Dimensione sia impostata su zero su infinito, Circolarità è impostata su zero su uno, Mostra è impostato su Contorni e selezionare le caselle Visualizza risultati e Cancella risultati.Si noti il numero di particelle analizzate in un foglio di calcolo che indica il campione e la posizione dello stack Z. Quindi fate clic su Analizza (Analyze) e analizza particelle (Analyze and Analyze Particles) per misurare le particelle. Quando tutti gli Z-stack a fuoco per il campione sono stati analizzati, inviare il numero totale di particelle per il campione nel foglio di calcolo per quantificare il numero totale di interazioni.Gli anticorpi utilizzati nel saggio di prossimità sono specifici per i ligandi e non dimostrano alcuna sovrapposizione. Come osservato, il protocollo di dispersione è altamente efficiente nell'ottenere singole cellule nel campo visivo del microscopio per l'analisi a valle e la colorazione delle cellule beta viene mantenuta a seguito di un saggio di legatura di prossimità nella colorazione degli isolotti umani primari. Utilizzando le tecniche dimostrate, si potrebbe determinare che l'interazione della proteina di degradazione del recettore della neuregulina-1 e della peptidasi 8 specifica dell'ubiquitina è diminuita a seguito di un'esposizione di 48 ore al palmitato, evidenziando la fattibilità di questo saggio per valutare i principali fattori di mitofagia endogena a seguito di stimoli diabetogenici.L'efficiente e delicata dispersione degli isolotti umani è essenziale per garantire la quantificazione delle corrette popolazioni cellulari a valle. Il PLA consente la valutazione di importanti complessi di micofagia in campioni di isolotti umani consentendo l'analisi della micofagia e campioni di pazienti umani biologicamente importanti che spostano il campo della ricerca sul diabete in avanti.

Research

JoVE Journal

Medicine

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