Name: visualization of endogenous mitophagy complexes in situ in human pancreatic beta cells utilizing proximity ligation assay
Uploaded: 2019-05-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay at JoVE.com

著者らは、JDRF(CDA-2016-189およびSRA-2018-539)、国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所、国立衛生研究所(R01-DK-108921)、ブレム家、およびアンソニー家からの資金援助を認めている。S.A.S.へのJDRFキャリア開発賞は、ノボ・ノルディスク財団が支援するデンマーク糖尿病アカデミーの支援を受けています。

非同定ドナーヒト膵島の使用は、機関審査委員会(IRB)の免除を介して、ミシガン大学IRBポリシーに準拠しています。ヒト膵島は、NIH/NIDDK主催の統合島分布プログラム(IIDP)によって提供された。
1. ヒトのイレットサンプル調製
<ol><li>
単一細胞解離
	<ol>
<li>培養ヒト島試料(4000~6000個相当/10mL培地)膵島培地(PIM(S))で少なくとも1日、1mMグルタミン(PIM(G))、100単位/mL?...

<ol>
	<li>Pearson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clec16a,+Nrdp1,+and+USP8+Form+a+Ubiquitin-Dependent+Tripartite+Complex+That+Regulates+beta-Cell+Mitophagy.">Clec16a, Nrdp1, and USP8 Form a Ubiquitin-Dependent Tripartite Complex That Regulates beta-Cell Mitophagy.</a> Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).</li><li>Soleimanpour, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diabetes+susceptibility+gene+Clec16a+regulates+mitophagy.">The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy.</a> Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).</li><li>Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+regulation+of+&#946;-cell+function:+Maintaining+the+momentum+for+insulin+release.">Mitochondrial regulation of &#946;-cell function: Maintaining the momentum for insulin release.</a> Molecular Aspects of Medicine. , (2015).</li><li>Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+by+mitophagy.">Regulation by mitophagy.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 53, 147-150 (2014).</li><li>Soleimanpour, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+Susceptibility+Genes+Pdx1+and+Clec16a+Function+in+a+Pathway+Regulating+Mitophagy+in+beta-Cells.">Diabetes Susceptibility Genes Pdx1 and Clec16a Function in a Pathway Regulating Mitophagy in beta-Cells.</a> Diabetes. 64 (10), 3475-3484 (2015).</li><li>Zhong, L., Tan, Y., Zhou, A., Yu, Q., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RING+Finger+Ubiquitin-Protein+Isopeptide+Ligase+Nrdp1/FLRF+Regulates+Parkin+Stability+and+Activity.">RING Finger Ubiquitin-Protein Isopeptide Ligase Nrdp1/FLRF Regulates Parkin Stability and Activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9425-9430 (2005).</li><li>Durcan, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=USP8+regulates+mitophagy+by+removing+K6-linked+ubiquitin+conjugates+from+parkin.">USP8 regulates mitophagy by removing K6-linked ubiquitin conjugates from parkin.</a> The EMBO Journal. 33 (21), 2473-2491 (2014).</li><li>Gauthier, T., Claude-Taupin, A., Delage-Mourroux, R., Boyer-Guittaut, M., Hervouet, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+Ligation+In+situ+Assay+is+a+Powerful+Tool+to+Monitor+Specific+ATG+Protein+Interactions+following+Autophagy+Induction.">Proximity Ligation In situ Assay is a Powerful Tool to Monitor Specific ATG Protein Interactions following Autophagy Induction.</a> PLoS ONE. 10 (6), e0128701 (2015).</li><li>Silva Xavier, D. a., G, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cells+of+the+Islets+of+Langerhans.">The Cells of the Islets of Langerhans.</a> Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54 (2018).</li><li>Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+islet+plasticity:+Interspecies+comparison+of+islet+architecture+and+composition.">Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition.</a> Islets. 2 (3), 135-145 (2010).</li><li>Cabrera, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unique+cytoarchitecture+of+human+pancreatic+islets+has+implications+for+islet+cell+function.">The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (7), 2334 (2006).</li><li>Brissova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Human+Pancreatic+Islet+Architecture+and+Composition+by+Laser+Scanning+Confocal+Microscopy.">Assessment of Human Pancreatic Islet Architecture and Composition by Laser Scanning Confocal Microscopy.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).</li><li>Babu, D. A., Deering, T. G., Mirmira, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+feat+of+metabolic+proportions:+Pdx1+orchestrates+islet+development+and+function+in+the+maintenance+of+glucose+homeostasis.">A feat of metabolic proportions: Pdx1 orchestrates islet development and function in the maintenance of glucose homeostasis.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 92 (1), 43-55 (2007).</li><li>Poitout, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucolipotoxicity+of+the+pancreatic+beta+cell.">Glucolipotoxicity of the pancreatic beta cell.</a> Biochimica Biophysica Acta. 1801 (3), 289-298 (2010).</li><li>Pearson, G., Soleimanpour, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ubiquitin-dependent+mitophagy+complex+maintains+mitochondrial+function+and+insulin+secretion+in+beta+cells.">A ubiquitin-dependent mitophagy complex maintains mitochondrial function and insulin secretion in beta cells.</a> Autophagy. 14 (7), 1160-1161 (2018).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomes+reveal+characteristic+features+of+human+pancreatic+islet+cell+types.">Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types.</a> EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).</li><li>DiGruccio, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+alpha,+beta+and+delta+cell+transcriptomes+reveal+that+ghrelin+selectively+activates+delta+cells+and+promotes+somatostatin+release+from+pancreatic+islets.">Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets.</a> Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).</li><li>Lawlor, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomes+identify+human+islet+cell+signatures+and+reveal+cell-type&#8211;specific+expression+changes+in+type+2+diabetes.">Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type&#8211;specific expression changes in type 2 diabetes.</a> Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).</li><li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+islets+contain+four+distinct+subtypes+of+&#946;+cells.">Human islets contain four distinct subtypes of &#946; cells.</a> Nature Communications. 7, 11756 (2016).</li><li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+major+pancreatic+cell+types+and+long-term+culture-initiating+cells+using+novel+human+surface+markers.">Isolation of major pancreatic cell types and long-term culture-initiating cells using novel human surface markers.</a> Stem Cell Research. 1 (3), 183-194 (2008).</li><li>Jayaraman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+detection+of+viable+human+pancreatic+beta+cells+by+flow+cytometry+using+fluorophores+that+selectively+detect+labile+zinc,+mitochondrial+membrane+potential+and+protein+thiols.">A novel method for the detection of viable human pancreatic beta cells by flow cytometry using fluorophores that selectively detect labile zinc, mitochondrial membrane potential and protein thiols.</a> Cytometry Part A. 73 (7), 615-625 (2008).</li><li>Arda, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Dependent+Pancreatic+Gene+Regulation+Reveals+Mechanisms+Governing+Human+&#223;-Cell+Function.">Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human &#223;-Cell Function.</a> Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).</li><li>Allen, G. F. G., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+iron+triggers+PINK1/Parkin-independent+mitophagy.">Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy.</a> EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).</li><li>Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. -. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+Parkin+Zone:+Mitophagy+without+Parkin.">No Parkin Zone: Mitophagy without Parkin.</a> Trends in Cell Biology. , (2018).</li></ol>

ここでは、上流のミトファジー複合体の形成を定量化するために目的の組織/細胞でNRDP1:USP8 PLAを使用するための簡単で効率的なアプローチについて説明する。我々は以前に、共免疫沈殿実験、無細胞相互作用研究、インビトロおよび細胞ベースを含むいくつかの方法論によって、膵臓ベータ細胞におけるCLEC16A-NRDP1-USP8ミトファジー複合体の形成を確認した。ユビキチン化アッセイは、この複?...

膵臓ベータ細胞は、正常なグルコース恒常性を維持するために必要なインスリンを産生し、その失敗は糖尿病のすべての形態の発症をもたらす。ベータ細胞は、グルコース代謝とインスリン放出を結合するために必要なエネルギーを生成するために堅牢なミトコンドリア容量を保持します。近年,ミトコンドリア質量の維持が最適なβ細胞機能1,2,3にとって極めて重要であることが明らかになった。機能的なミトコンドリア質量を維持するために、ベータ細胞は、機能不全、損傷、または老化ミトコンドリア4を除去するために品質管理メカニズムに依存しています。私たちや他の人は、ベータ細胞がげっ歯類とヒトの島の両方でミトコンドリア品質管理を維持するために、ミトコンドリアオートファジー(またはミトファジー)と呼ばれるミトコンドリアターンオーバーの特殊な形態に依存していることを以前に実証しました。2,5.しかし、残念ながら、ヒト膵臓ベータ細胞では、ミトファジー、または内因性発現ミトファジー成分を検出する簡単な方法はありませんでした。
我々は最近、ベータ細胞におけるミトファジーの上流調節が、E3リガスCLEC16AおよびNRDP1およびデュビキチナーゼUSP81を含むタンパク質複合体の形成に依存することを示した。NRDP1およびUSP8は、主要なミトファジーイニシエーターPARKIN6,7に対する作用を通じてミトファジーに影響を与えるために独立して示されている。NRDP1は、ミトファジー6をオフに切り替えるためにユビキチン化と劣化のためのPARKINをターゲットとし、USP8は特にミトコンドリア7への転座を促進するためにK6リンクされたPARKINをデュビキチンテートします。近接ライゲーションアッセイ(PLA)技術は、タンパク質相互作用生物学8の分野における最近の進歩であり、単一細胞における内因性タンパク質相互作用の可視化を可能にし、かつ希少なサンプル材料によって制限されない。この方法論は、特にヒトの膵物/β細胞生物学にとって魅力的であり、サンプルの入手可能性が非常に小さいため、異種細胞型内の生理学的に関連するタンパク質複合体を理解する必要性と相まって、
PLAアプローチを用いて、原発性ヒト膵臓ベータ細胞および神経細胞株における主要な内因性ミトファジー複合体を観察し、ミトファジー経路1に対する糖尿病性環境の影響を実証することができる。要約すると、このプロトコルの包括的な目標は、豊富な材料を欠いている組織における特定のミトファジータンパク質複合体を分析すること、または従来のタンパク質相互作用研究が不可能な場合です。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA 1X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Block solution</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>Use 1X PBS, add 10 % donkey serum, and 0.3% Triton X-100 detergent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer A</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>To make 1L: Mix 8.8g NaCl, 1.2g Tris base, 500ul Tween-20, with 750mL ddH20. pH to 7.5 with HCl, and fill to 1L. Filter solution and store at 4C. Bring to RT before experimental use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer B</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>To make 1L: Mix 5.84g NaCl, 4.24g Tris base, 26g Tris-HCl with 500mL ddH20. pH to 7.5, and fill to 1L. Filter solution and store a 4C. Bring to RT before experimental use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5-conjugated AffiniPure donkey anti-goat</td>
			<td>Jackson Labs</td>
			<td>705-175-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detection Reagents Red</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>DU092008-100RXN</td>
			<td>Kit containing: ligation solution stock (5X), ligase, amplification solution stock (5X) and polymerase.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink PLA probe anti-mouse MINUS</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>DU092004-100RXN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink PLA probe anti-rabbit PLUS</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>DU092002-100RXN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polyclonal anti-PDX1 (clone A17)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-14664</td>
			<td>RRID: AB_2162373</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIN6 pancreatic cell line</td>
			<td>Gift from D. Stoffers</td>
			<td></td>
			<td>Mouse insulinoma cell line, utilized for cell-based assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-USP8 antibody (clone US872)</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>SAB200527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pap-pen</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>195505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use to seal antibody and probe solutions on your cells to prevent evaporation when using small solution volumes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBT (phosphate buffered saline with triton)</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>To make 50mL: 43.5mLddH2O, 5mL 10X PBS, 0.5mL 10X BSA(100mg/mL solution), 1mL 10% triton X-100 solution in ddH20)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 10X</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIM(ABS) Human AB serum</td>
			<td>Prodo Labs</td>
			<td>PIM-ABS001GMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIM(G) (glutamine)</td>
			<td>Prodo Labs</td>
			<td>PIM-G001GMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIM(S) media</td>
			<td>Prodo Labs</td>
			<td>PIM-S001GMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PR619</td>
			<td>Apex Bio</td>
			<td>A812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td>Life Technologies (Molecular Probes)</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal anti-FLRF/RNF41 (Nrdp1)</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>A300-049A</td>
			<td>RRID: AB_2181251</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y cells</td>
			<td>Gift from L. Satin</td>
			<td></td>
			<td>Human neuroblastoma cell line, utilized for cell-based assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water for RNA work (DEPC water)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP361-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of endogenous mitophagy complexes in situ in human pancreatic beta cells utilizing proximity ligation assay

ミトファジーは、膵島のβ細胞バイオエネルギッシュがグルコース刺激インスリン放出を燃料にする上で重要なミトコンドリア品質管理経路である。ミトファジーの評価は困難であり、多くの場合、一次ヒト膵島などの組織サンプルでは容易に利用できない遺伝的レポーターまたは複数の相補的な技術を必要とする。ここでは、一次ヒト膵島における主要な内因性ミトファジー複合体の形成を可視化し、定量化するための堅牢なアプローチを示す。ミトファジーレギュレータNRDP1とUSP8の相互作用を検出する敏感な近接ライゲーションアッセイ技術を利用して、その中で不可欠なミトファジー複合体の形成を具体的に定量することができる。転写因子PDX1のアンチステインに対するこのアプローチを結合することにより、ミトファジー複合体と、特にベータ細胞内でミトファジーを損なう可能性のある因子を定量化することができます。我々が説明する方法論は、免疫沈殿(IP)または質量分析のような他のタンパク質相互作用研究に必要な大量の細胞抽出物の必要性を克服し、一般的に貴重なヒトのイストリーサンプルにとって理想的ではないこれらのアプローチのために十分な量で利用できる。さらに、この方法論は、下流タンパク質アプリケーションのための不均一なイストリール集団からベータ細胞を精製するためのフローソート技術の必要性を妨げる。したがって、異種および限られた細胞集団での使用に対して高い互換性を持つミトファジーの可視化のための貴重なプロトコルを説明する。

MIN6膵β細胞株とSH-SY5Y神経芽細胞腫細胞株SH-SY5Yで初期実験を行い、抗体の特異性と可視化されたタンパク質相互作用の両方を最適化・確認しました。MIN6細胞を30,000細胞/mLでカバースリップにめっきし、48時間、SH-SY5Y細胞を15,000細胞/mLでカバースリップ上にめっきし、24時間付着させた。PLA プロトコルは、ステップ 1.2.3 から始まり、上記のように続きました。PLAシグナ...

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Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

近接リゲーションアッセイを利用したヒト膵臓ベータ細胞における内因性ミトファジー複合体の可視化

このプロトコルは、一次ヒト化物試料からベータ細胞に特異的にミトファジータンパク質複合体形成の定量分析のための方法を概説する。この技術により、貴重なヒト膵臓ベータ細胞サンプルにおいて重要な限られた生物材料からのミトファジーの分析が可能になります。

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...

このプロトコルは、ベータ細胞などのヒト組織における内因性ミトファジー複合体を監視することを可能にし、極めて重要な翻訳関連組織におけるマイトファジー研究を促進する。この技術の1つの利点は、まれな可用性または少数のサンプル数で組織中の生体内の重要なマイトファジー複合体を視覚化する能力である。標準的なプロトコルに従って分離した後、培養は、完全な膵島培地の10ミリリットルで4〜6回10〜3番目のヒト膵島当量を摂氏37度で少なくとも1日培養する。翌日、解剖用光顕微鏡を3倍の倍率で使用し、培養中の個々のヒト島を数える。1.5ミリリットルの小島培地のチューブに治療または関心のある条件ごとに40個の島を選びます。遠心分離によって小島を沈め、50マイクロモルPR619を補充したPBSの1ミリリットルでペレットを再懸濁する。チューブを反転し、新鮮なPBSプラスデュビキチナーゼ阻害剤で2回目の洗浄のための遠心分離によって島を収集します。第2遠心分離後、0.25%トリプシンと阻害剤の125マイクロリットルの125マイクロリットルを周期的に穏やかなピペッティングで摂氏37度で3分間、単一細胞に解約する。インキュベーションの終わりに、PR619を添加した37°Cの温かい膵島培地の1ミリリットルで反応を逮捕する。新鮮なPBSと洗浄ごとに阻害剤で2回の洗浄のための遠心分離によって島を収集します。2回目の洗浄後、解約された小島を150マイクロリットルの新鮮なPBSプラスインヒビターで再懸濁する。個々の島の付着および固定のために、細胞溶液をフロストチャージされた顕微鏡スライドに、疎水性ペンで細胞領域の輪郭を描く。その後、4%パラホルムアルデヒドとPBSで囲まれた細胞を室温で15分間固定します。この小水サンプルの免疫物質化学的分析では、PBSで5分間の洗浄を2回PBSで洗浄し、続いて10%ロバ血清とPBSに0.3%の洗剤を加えた非特異的結合遮断を室温で1時間洗浄します。ブロッキングインキュベーションの最後に、ユビキチン特異的ペプチダーゼ8に対する一次マウス抗体で細胞をコインキュベートし、ニューレグリン受容体分解タンパク質-1に対する一次ウサギ抗体、およびマウスまたはウサギで生じたβ細胞同定に特異的なマーカーを4°Cで一晩近接ライゲーションアッセイシグナルを妨げないようにする。翌朝、ロッカーのPBSで2回の5分間の洗浄でサンプルを洗います。作製したばかりの近接ライゲーションアッセイ溶液に抗ヤギCy5二次抗体を加えます。2回目の洗浄後、各小藻サンプルに20マイクロリットルのプローブ溶液をラベル付けし、37°Cで1時間のインキュベーションのためにプラスチックフィルムでスライドを回収します。インキュベーションの最後に、ロッカーのバッファAに5分間の洗浄を2回行い、続いて20マイクロリットルの準備されたライゲーション溶液をインキュベーションして、スライド当たり0.25単位のリガーゼあたり30分のインキュベーションを37°Cで洗浄します。ライゲーションの終了時に、細胞を1回の洗浄につき2分間、緩衝Aで2回洗浄する。各サンプルに20マイクロリットルの増幅液を取り付け、ポリメラーゼを補い、摂氏37度で100~120分のインキュベーションを行います。細胞をイメージング用に準備するには、サンプルを新鮮なバッファAで1回、ロッカーで1回10分間洗浄し、その後0.1xバッファBで1回洗浄します。最後の洗浄後、DAPIを含む取り付け媒体の一滴でスライドを取り付け、慎重に任意の気泡を押し出すためにメスを使用して、各サンプルの上にカバースリップを置きます。その後、エッジの周りに明確なマニキュアでカバーリップを密封します。サンプルを画像化するには、複数の焦点面をキャプチャできる顕微鏡のステージにスライドを置き、100倍の倍率を選択します。Zスタックの高さを約0.45マイクロメートルに設定し、適切な染色、カウンターステイン、および生細胞信号励起および発光パラメータを設定します。少なくとも9つの異なる焦点面画像を取得します。蛍光画像の背景信号と浮遊光を最小限に抑えるために、選択した標準画像処理ソフトウェアを使用して、2次元デコンボリューションニアネイバーアルゴリズムを利用して画像を処理します。近接ライゲーションアッセイ相互作用を定量化するために、ImageJを開き、近接ライゲーションアッセイ画像を開く。最初の急激にフォーカスが合った画像から開始し、[イメージ] をクリックして[調整としきい値]を選択します。しきい値を調整して非特異的近接ライゲーションアッセイシグナルをすべて除去し、解析中に信号の一貫性を保つためにしきい値調整をメモします。[処理] をクリックし、[バイナリ] と [バイナリを作成] を選択します。[サイズ] が 0 に設定されて無限大に、循環が 0 に設定されて 1 に設定され、[表示] が [アウトライン] に設定され、[結果の表示] および [結果のクリア] ボックスをオンにします。サンプルと Z スタックの位置を示すスプレッドシートで分析されたパーティクルの数に注意してください。次に、[パーティクルの解析と解析] をクリックして、パーティクルを測定します。サンプルのすべてのフォーカス中 Z スタックを分析したら、サンプルの合計パーティクル数をスプレッドシートに送信して、相互作用の合計数を定量化します。近接アッセイで使用される抗体はリガンドに特異的であり、重複を示すものではありません。観察されるように、分散プロトコルは下流分析のための顕微鏡視野で単一細胞を得る上で非常に効率的であり、β細胞染色は、一次ヒト小島における近接ライゲーションアッセイ染色後に保持される。実証された技術を用いて、ノイレグリン受容体分解タンパク質-1とユビキチン特異的ペプチダーゼ8の相互作用がパルミチントへの48時間の暴露後に減少し、糖尿病性刺激に続く主要な内因性個所因子を評価するためのこのアッセイの実現可能性を強調することができると判断することができる。人間の小島の効率的で穏やかな分散は、下流の正しい細胞集団の定量化を確実にするために不可欠です。PLAは、ヒトの小地サンプル中の重要なマイトファジー複合体の評価を可能にし、糖尿病研究の分野を前進させるマイトファジーおよび生物学的に重要なヒト患者サンプルの分析を可能にする。

Research

JoVE Journal

Medicine

Staining Protocols for Human Pancreatic Islets

ヒト膵島の染色プロトコル

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and ...

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

組み合わせによるマウスのシングルセル解像度で肺転移の可視化の向上<em&gt;のin-situ</em肺組織とのX-gal染色の&gt;灌流<em&gt; lacZを</em&gt;タグ付き腫瘍細胞

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells

膵β細胞によるインスリン分泌に影響を及ぼす細胞外タンパク質相互作用の共培養分析

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within ...

A Protocol for Genetic Induction and Visualization of Benign and Invasive Tumors in Cephalic Complexes of Drosophila melanogaster

A Protocol for Genetic Induction and Visualization of Benign and Invasive Tumors in Cephalic Complexes of Drosophila melanogaster

遺伝的誘導との頭部の複合体における良性および浸潤性腫瘍の可視化のためのプロトコル<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

Drosophila has illuminated our  understanding of the genetic basis of normal development and disease for the  past several decades and today it continues ...

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

膵神経可塑性をシミュレートする。<em&gt;体外</em&gt;デュアルニューロンの可塑性アッセイ

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

人間のてんかん術後皮質組織の多電極アレイ録音

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

新しい治療戦略を開発するための膵臓癌幹細胞特性を研究

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

ヒト腫瘍異種移植片からマウス細胞の枯渇は大幅に標的細胞の下流分析を向上させます

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

In VitroとIn Vivo検出、ひと細胞、線虫、マウス Mitophagy の

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

Application of End-to-end Anastomosis in Robotic Central Pancreatectomy

ロボット中央膵の吻合をエンド ツー エンドのアプリケーション

Central pancreatectomy is carried out for the treatment of benign or low-malignant potential tumors located in the pancreatic neck or proximal part of ...