Name: visualization of endogenous mitophagy complexes in situ in human pancreatic beta cells utilizing proximity ligation assay
Uploaded: 2019-05-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay at JoVE.com

저자는 JDRF (CDA-2016-189 및 SRA-2018-539), 당뇨병 및 소화 및 신장 질환의 국립 연구소, 건강의 국립 연구소 (R01-DK-108921), Brehm 가족, 앤서니 가족의 자금 지원을 인정합니다. JDRF 커리어 개발 어워드는 노보 노디스크 재단이 지원하는 덴마크 당뇨병 아카데미의 지원을 받고 있습니다.

비식별 기증자 인간 췌도의 사용은 기관 검토 위원회 (IRB) 면제를 통해 미시간 대학 IRB 정책을 준수합니다. 인간 췌도는 NIH/NIDDK가 후원하는 통합 섬 분배 프로그램(IIDP)에 의해 제공되었습니다.
1. 인간 아일렛 샘플 준비
<ol><li>
단세포 해리
	<ol>
<li>배양 인간 아일렛 샘플(4000-6000 췌도 등가물/10 mL 배지)은 췌도 에서 37°C에서 적어도 1일 동안 1mMM글루타민(PIM(G)) 및 10...

<ol>
	<li>Pearson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clec16a,+Nrdp1,+and+USP8+Form+a+Ubiquitin-Dependent+Tripartite+Complex+That+Regulates+beta-Cell+Mitophagy.">Clec16a, Nrdp1, and USP8 Form a Ubiquitin-Dependent Tripartite Complex That Regulates beta-Cell Mitophagy.</a> Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).</li><li>Soleimanpour, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diabetes+susceptibility+gene+Clec16a+regulates+mitophagy.">The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy.</a> Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).</li><li>Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+regulation+of+&#946;-cell+function:+Maintaining+the+momentum+for+insulin+release.">Mitochondrial regulation of &#946;-cell function: Maintaining the momentum for insulin release.</a> Molecular Aspects of Medicine. , (2015).</li><li>Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+by+mitophagy.">Regulation by mitophagy.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 53, 147-150 (2014).</li><li>Soleimanpour, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+Susceptibility+Genes+Pdx1+and+Clec16a+Function+in+a+Pathway+Regulating+Mitophagy+in+beta-Cells.">Diabetes Susceptibility Genes Pdx1 and Clec16a Function in a Pathway Regulating Mitophagy in beta-Cells.</a> Diabetes. 64 (10), 3475-3484 (2015).</li><li>Zhong, L., Tan, Y., Zhou, A., Yu, Q., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RING+Finger+Ubiquitin-Protein+Isopeptide+Ligase+Nrdp1/FLRF+Regulates+Parkin+Stability+and+Activity.">RING Finger Ubiquitin-Protein Isopeptide Ligase Nrdp1/FLRF Regulates Parkin Stability and Activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9425-9430 (2005).</li><li>Durcan, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=USP8+regulates+mitophagy+by+removing+K6-linked+ubiquitin+conjugates+from+parkin.">USP8 regulates mitophagy by removing K6-linked ubiquitin conjugates from parkin.</a> The EMBO Journal. 33 (21), 2473-2491 (2014).</li><li>Gauthier, T., Claude-Taupin, A., Delage-Mourroux, R., Boyer-Guittaut, M., Hervouet, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+Ligation+In+situ+Assay+is+a+Powerful+Tool+to+Monitor+Specific+ATG+Protein+Interactions+following+Autophagy+Induction.">Proximity Ligation In situ Assay is a Powerful Tool to Monitor Specific ATG Protein Interactions following Autophagy Induction.</a> PLoS ONE. 10 (6), e0128701 (2015).</li><li>Silva Xavier, D. a., G, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cells+of+the+Islets+of+Langerhans.">The Cells of the Islets of Langerhans.</a> Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54 (2018).</li><li>Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+islet+plasticity:+Interspecies+comparison+of+islet+architecture+and+composition.">Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition.</a> Islets. 2 (3), 135-145 (2010).</li><li>Cabrera, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unique+cytoarchitecture+of+human+pancreatic+islets+has+implications+for+islet+cell+function.">The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (7), 2334 (2006).</li><li>Brissova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Human+Pancreatic+Islet+Architecture+and+Composition+by+Laser+Scanning+Confocal+Microscopy.">Assessment of Human Pancreatic Islet Architecture and Composition by Laser Scanning Confocal Microscopy.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).</li><li>Babu, D. A., Deering, T. G., Mirmira, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+feat+of+metabolic+proportions:+Pdx1+orchestrates+islet+development+and+function+in+the+maintenance+of+glucose+homeostasis.">A feat of metabolic proportions: Pdx1 orchestrates islet development and function in the maintenance of glucose homeostasis.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 92 (1), 43-55 (2007).</li><li>Poitout, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucolipotoxicity+of+the+pancreatic+beta+cell.">Glucolipotoxicity of the pancreatic beta cell.</a> Biochimica Biophysica Acta. 1801 (3), 289-298 (2010).</li><li>Pearson, G., Soleimanpour, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ubiquitin-dependent+mitophagy+complex+maintains+mitochondrial+function+and+insulin+secretion+in+beta+cells.">A ubiquitin-dependent mitophagy complex maintains mitochondrial function and insulin secretion in beta cells.</a> Autophagy. 14 (7), 1160-1161 (2018).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomes+reveal+characteristic+features+of+human+pancreatic+islet+cell+types.">Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types.</a> EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).</li><li>DiGruccio, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+alpha,+beta+and+delta+cell+transcriptomes+reveal+that+ghrelin+selectively+activates+delta+cells+and+promotes+somatostatin+release+from+pancreatic+islets.">Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets.</a> Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).</li><li>Lawlor, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomes+identify+human+islet+cell+signatures+and+reveal+cell-type&#8211;specific+expression+changes+in+type+2+diabetes.">Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type&#8211;specific expression changes in type 2 diabetes.</a> Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).</li><li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+islets+contain+four+distinct+subtypes+of+&#946;+cells.">Human islets contain four distinct subtypes of &#946; cells.</a> Nature Communications. 7, 11756 (2016).</li><li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+major+pancreatic+cell+types+and+long-term+culture-initiating+cells+using+novel+human+surface+markers.">Isolation of major pancreatic cell types and long-term culture-initiating cells using novel human surface markers.</a> Stem Cell Research. 1 (3), 183-194 (2008).</li><li>Jayaraman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+detection+of+viable+human+pancreatic+beta+cells+by+flow+cytometry+using+fluorophores+that+selectively+detect+labile+zinc,+mitochondrial+membrane+potential+and+protein+thiols.">A novel method for the detection of viable human pancreatic beta cells by flow cytometry using fluorophores that selectively detect labile zinc, mitochondrial membrane potential and protein thiols.</a> Cytometry Part A. 73 (7), 615-625 (2008).</li><li>Arda, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Dependent+Pancreatic+Gene+Regulation+Reveals+Mechanisms+Governing+Human+&#223;-Cell+Function.">Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human &#223;-Cell Function.</a> Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).</li><li>Allen, G. F. G., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+iron+triggers+PINK1/Parkin-independent+mitophagy.">Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy.</a> EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).</li><li>Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. -. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+Parkin+Zone:+Mitophagy+without+Parkin.">No Parkin Zone: Mitophagy without Parkin.</a> Trends in Cell Biology. , (2018).</li></ol>

여기에서 우리는 상류 mitophagy 복합물의 대형을 정량화하기 위하여 관심 있는 조직/세포에 NRDP1:USP8 PLA를 사용하는 간단하고 능률적인 접근을 기술합니다. 우리는 이전에 공동 면역 침전 실험, 무세포 상호 작용 연구 및 시험관 내 뿐만 아니라 세포 기지를 둔 몇몇 방법론에 의해 췌장 베타 세포에 있는 CLEC16A-NRDP1-USP8 미토파지 복합체의 대형을 확인했습니다 유비퀴틴 화 검사, 이 복잡한 드라이브가...

췌장 베타 세포는 정상적인 포도당 항상성을 유지하는 데 필요한 인슐린을 생성하고, 그들의 실패는 모든 형태의 당뇨병의 발달을 초래한다. 베타 세포는 인슐린 방출과 포도당 대사를 결합하는 데 필요한 에너지를 생성하는 강력한 미토콘드리아 용량을 유지합니다. 최근에는 기능성 미토콘드리아 질량의 유지가 최적의 베타 세포 기능1,2,3에중추적인 중요성이 있음이 명백해지고 있다. 기능성 미토콘드리아 질량을 유지하기 위해 베타 세포는 기능 장애, 손상 또는 노화 미토콘드리아4를제거하기 위해 품질 관리 메커니즘에 의존합니다. 우리와 다른 사람들은 이전에 베타 세포가 설치류와 인간 섬 모두에서 미토콘드리아 품질 관리를 유지하기 위해 미토콘드리아 자가 포식 (또는 미토파지)이라고 불리는 미토콘드리아 회전율의 특수 한 형태에 의존한다는 것을 입증했습니다1. 2,5. 불행하게도, 그러나, 인간 췌장 베타 세포에서, mitophagy, 또는 내인성 발현 된 미토파지 성분을 검출하는 간단한 방법이 없었다.
우리는 최근 베타 세포에서 미토파지의 상류 조절이 E3 리가제 CLEC16A 및 NRDP1 및 듀비퀴티나아제 USP81을 포함하는 단백질 복합체의 형성에 의존한다는 것을 보여주었다. NRDP1과 USP8은 키 미토파지 이니시에이터 PARKIN6,7에대한 조치를 통해 미토파지에 영향을 미치는 것으로 독립적으로 나타났다. NRDP1은 미토파지 6을 끄기 위해 유비퀴틴화및 분해를 위한 PARKIN을 목표로 하고, USP8은 특히 K6-연결된 PARKIN을 미토콘드리아7로전좌화하기 위해 타겟팅합니다. 근접 결찰 분석(PLA) 기술은 단백질 상호작용 생물학분야에서최근 진보되어 왔으며, 단일 세포에서 현장내 내인성 단백질 상호작용의 시각화를 가능하게 하고, 부족한 샘플 물질에 의해 제한되지 않는다. 이 방법론은 특히 인간 췌도/베타 세포 생물학에 대해 특히 유혹적이며, 표본 가용성의 희소성으로 인해 이기종 세포 유형 내에서 생리학적으로 관련된 단백질 복합체를 이해해야 할 필요성과 결합됩니다.
PLA 접근법을 활용하여, 우리는 1차 인간 췌장 베타 세포 및 뉴런 세포주에서 주요 내인성 미토파지 복합체를 관찰할 수 있으며, 미토파지 경로1에대한 당뇨병 환경의 효과를 입증할 수 있다. 요약하자면, 이 프로토콜의 가장 중요한 목표는 풍부한 물질이 부족한 조직또는 기존의 단백질 상호작용 연구가 불가능한 조직에서 특정 미토파지 단백질 복합체를 분석하는 것입니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA 1X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Block solution</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>Use 1X PBS, add 10 % donkey serum, and 0.3% Triton X-100 detergent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer A</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>To make 1L: Mix 8.8g NaCl, 1.2g Tris base, 500ul Tween-20, with 750mL ddH20. pH to 7.5 with HCl, and fill to 1L. Filter solution and store at 4C. Bring to RT before experimental use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer B</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>To make 1L: Mix 5.84g NaCl, 4.24g Tris base, 26g Tris-HCl with 500mL ddH20. pH to 7.5, and fill to 1L. Filter solution and store a 4C. Bring to RT before experimental use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5-conjugated AffiniPure donkey anti-goat</td>
			<td>Jackson Labs</td>
			<td>705-175-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detection Reagents Red</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>DU092008-100RXN</td>
			<td>Kit containing: ligation solution stock (5X), ligase, amplification solution stock (5X) and polymerase.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink PLA probe anti-mouse MINUS</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>DU092004-100RXN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink PLA probe anti-rabbit PLUS</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>DU092002-100RXN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polyclonal anti-PDX1 (clone A17)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-14664</td>
			<td>RRID: AB_2162373</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIN6 pancreatic cell line</td>
			<td>Gift from D. Stoffers</td>
			<td></td>
			<td>Mouse insulinoma cell line, utilized for cell-based assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-USP8 antibody (clone US872)</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>SAB200527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pap-pen</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>195505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use to seal antibody and probe solutions on your cells to prevent evaporation when using small solution volumes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBT (phosphate buffered saline with triton)</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>To make 50mL: 43.5mLddH2O, 5mL 10X PBS, 0.5mL 10X BSA(100mg/mL solution), 1mL 10% triton X-100 solution in ddH20)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 10X</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIM(ABS) Human AB serum</td>
			<td>Prodo Labs</td>
			<td>PIM-ABS001GMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIM(G) (glutamine)</td>
			<td>Prodo Labs</td>
			<td>PIM-G001GMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIM(S) media</td>
			<td>Prodo Labs</td>
			<td>PIM-S001GMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PR619</td>
			<td>Apex Bio</td>
			<td>A812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td>Life Technologies (Molecular Probes)</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal anti-FLRF/RNF41 (Nrdp1)</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>A300-049A</td>
			<td>RRID: AB_2181251</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y cells</td>
			<td>Gift from L. Satin</td>
			<td></td>
			<td>Human neuroblastoma cell line, utilized for cell-based assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water for RNA work (DEPC water)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP361-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of endogenous mitophagy complexes in situ in human pancreatic beta cells utilizing proximity ligation assay

미토파지는 필수 미토콘드리아 품질 관리 경로로, 췌도 베타 세포 바이오에너지가 포도당 자극 인슐린 방출에 연료를 공급하는 데 매우 중요합니다. mitophagy의 평가는 도전적이고 수시로 1 차적인 인간 췌장 섬과 같은 조직 견본에서 쉽게 이용되지 않는 유전 기자 또는 다중 상보적인 기술을 요구합니다. 여기에서 우리는 1 차적인 인간 적인 췌도에 있는 중요한 내인성 mitophagy 복합물의 대형을 구상하고 정량화하는 강력한 접근을 보여줍니다. 미토파지 조절제 NRDP1 및 USP8의 상호작용을 검출하기 위해 민감한 근접 결찰 분석 기술을 활용하여, 우리는 특히 그(것)들에서 필수적인 미토파지 복합체의 형성을 정량화할 수 있습니다. 전사 인자 PDX1에 대한 역착에 대한 이 접근법을 결합함으로써, 우리는 미토파지 복합체, 특히 베타 세포 내에서 미토파지를 손상시킬 수 있는 요인을 정량화할 수 있다. 우리가 설명하는 방법론은 면역 침전 (IP) 또는 질량 분광법과 같은 다른 단백질 상호 작용 연구에 필요한 다량의 세포 추출물의 필요성을 극복하고 일반적으로 귀중한 인간 췌도 샘플에 이상적입니다. 이러한 접근 방식에 충분한 수량으로 사용할 수 있습니다. 또한, 이 방법론은 다운스트림 단백질 응용을 위한 이기종 아일렛 집단으로부터 베타 세포를 정화하는 유동 선별 기술의 필요성을 제거합니다. 따라서, 우리는 이기종 및 제한된 세포 집단에서 사용하기 위해 매우 호환되는 미토파기의 시각화를 위한 귀중한 프로토콜을 기술한다.

우리는 MIN6 췌장 베타 세포주 및 SH-SY5Y 신경 아세포종 세포주 SH-SY5Y에서 초기 실험을 수행하여 항체의 특이성과 가시화된 단백질 상호작용을 모두 최적화하고 확인하였다. MIN6 세포는 30,000 세포/mL에서 커버슬립에 도금하고 48시간 동안 부착하도록 방치하였고, SH-SY5Y 세포는 15,000 세포/mL에서 커버슬립 상에 도금되고 24시간 동안 부착하도록 방치하였다. PLA 프로토콜은 1.2.3 ?...

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Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

근접 결찰 분석분석서를 활용한 인간 췌장 베타 세포에서 내인성 미토파기 복합체의 시각화

이 프로토콜은 1차 인간 아일렛 샘플로부터의 베타 세포에서 특히 미토파지 단백질 복합체 형성의 정량적 분석을 위한 방법을 간략하게 설명한다. 이 기술은 이렇게 귀중한 인간 췌장 베타 세포 견본에서 결정적인 한정된 생물학 물자에서 mitophagy의 분석을 허용합니다.

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...

이 프로토콜은 우리가 베타 세포와 같은 인간 조직에서 내인성 mitophagy 복합체를 모니터링 할 수 있습니다, 중추적 인 번역 관련 조직에서 mitophagy 연구를 촉진. 이 기술의 한 가지 장점은 희귀 한 가용성 또는 작은 샘플 숫자로 조직에서 생체 내에서 중요한 미노파기 복합체를 시각화하는 능력입니다. 표준 프로토콜에 따라 격리 된 후, 문화권은 섭씨 37도에서 적어도 하루 동안 완전한 췌장 섬 배지의 10 밀리리터에서 세 번째 인간 섬에 4 ~ 6 번 10 배 등가합니다.다음 날, 배율 내에서 개별 인간 섬을 계산하기 위해 세 배율에서 해부 빛 현미경을 사용합니다. 치료 당 40 개의 섬 또는 관심 상태 1.5 밀리리터 튜브 의 섬 매체를 선택하십시오. 퇴적물 원심분리에 의해 섬과 50 마이크로 몰라 PR619로 보충 PBS의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단.튜브를 반전시키고 원심분리로 섬을 수집하여 신선한 PBS와 듀비퀴티나아제 억제제로 두 번째 세척을 합니다. 두 번째 원심 분리 후, 섬들을 125마이크로리터0.25%의 미량리터와 37도에서 3분간 억제제로 분리하여 주기적인 부드러운 파이펫팅을 한다. 인큐베이션이 끝나면 PR619로 보충된 섭씨 37도의 온난한 췌장 암막 매체의 1밀리리터로 반응을 체포한다.신선한 PBS플러스 세척당 억제제에서 두 개의 세척에 원심분리하여 섬을 수집합니다. 두 번째 세척 후, 신선한 PBS 플러스 억제제의 150 마이크로 리터에 해리 된 섬을 다시 중단. 개별 섬의 준수 및 고정을 위해 세포 용액을 서리가 내린 충전 현미경 슬라이드에 고정하고 소수성 펜으로 세포 영역을 간략하게 설명합니다.그런 다음 동봉된 세포를 4%의 파라포름알데히드 및 PBS로 실온에서 15분 동안 수정합니다. 아슬레 샘플의 면역히토화학적 분석을 위해 실온에서 PBS에서 5분 세척 2개로 세포를 세척하고, 실온에서 10%의 당나귀 혈청과 PBS를 1시간 동안 0.3%의 세제로 비특이적 결합 차단을 한다. 차단 인큐베이션의 끝에서, 유비퀴틴 특이적 펩티다아제 8, 호성 조절체 수용체 분해 단백질-1에 대한 1차 토끼 항체, 마우스 나 토끼에서 제기되지 않은 베타 세포 식별에 대한 마커를 사용하여 세포를 4도에서 하룻밤 동안 근접 결집 분석 신호를 방해하지 않도록 하여 세포를 주화한다.다음 아침, 로커에 PBS에서 두 5 분 세척으로 샘플을 씻어. 갓 준비된 근접 계합 분석 용액에 염소 Cy5 이차 항체를 첨가합니다. 두 번째 세척 후 각 섬각 섬 샘플을 프로브 용액 20 마이크로리터로 라벨을 붙이고 플라스틱 필름으로 슬라이드를 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다.인큐베이션이 끝나면 로커에 버퍼 A에 2개의 5분 세척으로 세포를 씻은 다음 새로 준비된 리기션 용액 20마이크로리터를 37도에서 30분 동안 슬라이드당 리구비저 당 0.25 단위로 보충하여 배양합니다. 결찰이 끝나면 완충 A로 셀을 2회 세척할 수 있습니다. 각 샘플을 섭씨 37도에서 100-120분 동안 폴리머라제로 보충한 20마이크로리터의 증폭 용액으로 각 샘플을 덮습니다.이미징을 위해 세포를 준비하려면 로커에서 세척당 10분 동안 신선한 버퍼 A로 샘플을 두 번 세척한 다음 로커에서 2분간 0.1x 버퍼 B로 1회 세척합니다. 마지막 세척 후, DAPI가 들어있는 마운팅 매체한방울로 슬라이드를 장착하고 메스를 사용하여 각 샘플에 커버슬립을 조심스럽게 놓아 거품을 내밀어 놓습니다. 그런 다음 가장자리 주위에 명확한 매니큐어로 커버립을 밀봉합니다.샘플을 이미지화하려면 여러 초점 평면을 캡처할 수 있는 현미경의 단계에 슬라이드를 배치하고 100배 배율을 선택합니다. Z 스택 높이를 약 0.45 마이크로미터및 적절한 얼룩, 카운터스테인 및 라이브 셀 신호 여기 및 방출 매개 변수로 설정합니다. 적어도 9개의 서로 다른 초점 평면 이미지를 가져옵니다.형광 이미지 배경 신호와 길 잃은 빛을 최소화하기 위해 표준 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 2차원 분광에 가까운 이웃 알고리즘을 활용하여 이미지를 처리합니다. 근접 계합 분석 상호 작용을 정량화하려면 ImageJ를 열고 근접 계합 분석 이미지를 엽니다. 첫 번째 급격한 초점 이미지에서 시작하여 이미지를 클릭하고 조정 및 임계값을 선택합니다.임계값을 조정하여 비특이적 근접 계합 분석 신호를 모두 제거하고 분석 전반에 걸쳐 신호를 일관되게 유지하려고 임계값 조정을 기록합니다. 프로세스를 클릭하고 바이너리를 선택하고 바이너리를 만듭니다. 크기가 무한대로 0으로 설정되어 있는지 확인하고, 순환은 0대 1로 설정되어, 표시가 윤곽선으로 설정되어 표시 결과 및 결과 클리어 상자를 확인합니다.샘플 및 Z 스택 위치를 나타내는 스프레드시트에서 분석된 파티클 수를 기록합니다. 그런 다음 파티클 분석 및 분석을 클릭하여 파티클을 측정합니다. 샘플에 대한 모든 초점 Z 스택을 분석한 경우 스프레드시트에서 샘플의 총 입자 수를 보내 총 상호 작용 수를 정량화합니다.근접 분석에서 사용되는 항체는 리간드에 특이하며 중복을 나타내지 않는다. 관찰된 바와 같이, 분산 프로토콜은 다운스트림 분석을 위한 현미경 분야에서 단일 세포를 획득하는 데 매우 효율적이며 베타 세포 염색은 1차 인간 섬에서 근접 결찰 분석 염색에 따라 유지된다. 입증된 기술을 이용하여, 중성조절체 분해 단백질-1 및 유비퀴틴 특이적 펩티다아제 8의 상호작용이 팔미타테에 48시간 노출된 후 감소되는 것을 확인할 수 있으며, 당뇨병 유발 성 자극에 따른 주요 내인성 미소상학 요인을 평가하기 위한 이 분석의 타당성을 강조한다.인간 섬의 효율적이고 부드러운 분산은 올바른 세포 집단하류의 정량화를 보장하는 데 필수적입니다. PLA는 인간 적인 가정 견본에 있는 중요한 mitophagy 복합체의 평가를 앞으로 당뇨병 연구의 필드를 이동하는 mitophagy 및 생물학으로 중요한 인간 적인 참을성 있는 환자 견본의 분석을 허용합니다.

Research

JoVE Journal

Medicine

Staining Protocols for Human Pancreatic Islets

인간의 췌장 Islets위한 염색법 프로토콜

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and ...

연구

의학

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

복합에 의한 마우스의 싱글 셀 해상도에서 폐 Metastases의 향상된 시각화<em&gt;에서 시츄</em폐 조직 및 X-걸의 착색의&gt; 재관류<em&gt; lacZ</em&gt; 태그 종양 세포

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells

췌장의 베타 세포가 인슐린 분비에 영향을 미치는 세포 외 단백질 상호 작용의 배양 분석

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within ...

A Protocol for Genetic Induction and Visualization of Benign and Invasive Tumors in Cephalic Complexes of Drosophila melanogaster

A Protocol for Genetic Induction and Visualization of Benign and Invasive Tumors in Cephalic Complexes of Drosophila melanogaster

의 두부 컴플렉스 유전 유도하고 양성 및 침윤성 종양의 시각화를위한 프로토콜<em&gt; 초파리</em

Drosophila has illuminated our  understanding of the genetic basis of normal development and disease for the  past several decades and today it continues ...

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

췌장 신경 가소성 시뮬레이션 :<em&gt; 체외</em&gt; 이중 신경 가소성 분석

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

인간의 간질 수술 후 두피 조직의 다중 전극 어레이 레코딩

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

췌장암 새로운 치료 전략을 개발하기위한 전지 특성 줄기 공부

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

인간 종양 이종 이식에서 마우스 세포의 고갈은 크게 대상 세포의 다운 스트림 분석을 향상

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

생체 외에서 그리고 Vivo에서 인간 세포, C. 선 충, 쥐에서 Mitophagy의 검출

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

Application of End-to-end Anastomosis in Robotic Central Pancreatectomy

로봇 중앙 Pancreatectomy 문 합 엔드 투 엔드의 응용 프로그램

Central pancreatectomy is carried out for the treatment of benign or low-malignant potential tumors located in the pancreatic neck or proximal part of ...