Name: visualization of endogenous mitophagy complexes in situ in human pancreatic beta cells utilizing proximity ligation assay
Uploaded: 2019-05-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay at JoVE.com

Forfatterne erkjenner finansiering støtte fra JDRF (CDA-2016-189 og SRA-2018-539), National Institute of diabetes og fordøyelses-og nyre sykdommer, National Institutes of Health (R01-DK-108921), den Brehm familien, og Anthony familien. JDRF karriere utviklings pris til S.A.S. støttes delvis av det danske diabetes akademiet, som støttes av Novo nordisk Foundation.

Bruk av de-identifiserte donor menneskelige bukspyttkjertelen holmer er via en institusjonell gjennomgang Board (IRB) fritak og i samsvar med University of Michigan IRB politikk. Human bukspyttkjertelen holmer ble gitt av NIH/NIDDK-sponset Integrated Islet Distribution program (IIDP).
1. Human Holme prøveforberedelse
<ol><li>
Dissosiasjon med én celle
	<ol>
<li>Kultur Human Holmen prøver (4000 – 6000 Holme ekvivalenter/10 mL Media) i minst 1 dag ved 37 ° c i bukspyttkj...

<ol>
	<li>Pearson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clec16a,+Nrdp1,+and+USP8+Form+a+Ubiquitin-Dependent+Tripartite+Complex+That+Regulates+beta-Cell+Mitophagy.">Clec16a, Nrdp1, and USP8 Form a Ubiquitin-Dependent Tripartite Complex That Regulates beta-Cell Mitophagy.</a> Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).</li><li>Soleimanpour, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diabetes+susceptibility+gene+Clec16a+regulates+mitophagy.">The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy.</a> Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).</li><li>Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+regulation+of+&#946;-cell+function:+Maintaining+the+momentum+for+insulin+release.">Mitochondrial regulation of &#946;-cell function: Maintaining the momentum for insulin release.</a> Molecular Aspects of Medicine. , (2015).</li><li>Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+by+mitophagy.">Regulation by mitophagy.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 53, 147-150 (2014).</li><li>Soleimanpour, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+Susceptibility+Genes+Pdx1+and+Clec16a+Function+in+a+Pathway+Regulating+Mitophagy+in+beta-Cells.">Diabetes Susceptibility Genes Pdx1 and Clec16a Function in a Pathway Regulating Mitophagy in beta-Cells.</a> Diabetes. 64 (10), 3475-3484 (2015).</li><li>Zhong, L., Tan, Y., Zhou, A., Yu, Q., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RING+Finger+Ubiquitin-Protein+Isopeptide+Ligase+Nrdp1/FLRF+Regulates+Parkin+Stability+and+Activity.">RING Finger Ubiquitin-Protein Isopeptide Ligase Nrdp1/FLRF Regulates Parkin Stability and Activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9425-9430 (2005).</li><li>Durcan, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=USP8+regulates+mitophagy+by+removing+K6-linked+ubiquitin+conjugates+from+parkin.">USP8 regulates mitophagy by removing K6-linked ubiquitin conjugates from parkin.</a> The EMBO Journal. 33 (21), 2473-2491 (2014).</li><li>Gauthier, T., Claude-Taupin, A., Delage-Mourroux, R., Boyer-Guittaut, M., Hervouet, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+Ligation+In+situ+Assay+is+a+Powerful+Tool+to+Monitor+Specific+ATG+Protein+Interactions+following+Autophagy+Induction.">Proximity Ligation In situ Assay is a Powerful Tool to Monitor Specific ATG Protein Interactions following Autophagy Induction.</a> PLoS ONE. 10 (6), e0128701 (2015).</li><li>Silva Xavier, D. a., G, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cells+of+the+Islets+of+Langerhans.">The Cells of the Islets of Langerhans.</a> Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54 (2018).</li><li>Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+islet+plasticity:+Interspecies+comparison+of+islet+architecture+and+composition.">Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition.</a> Islets. 2 (3), 135-145 (2010).</li><li>Cabrera, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unique+cytoarchitecture+of+human+pancreatic+islets+has+implications+for+islet+cell+function.">The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (7), 2334 (2006).</li><li>Brissova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Human+Pancreatic+Islet+Architecture+and+Composition+by+Laser+Scanning+Confocal+Microscopy.">Assessment of Human Pancreatic Islet Architecture and Composition by Laser Scanning Confocal Microscopy.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).</li><li>Babu, D. A., Deering, T. G., Mirmira, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+feat+of+metabolic+proportions:+Pdx1+orchestrates+islet+development+and+function+in+the+maintenance+of+glucose+homeostasis.">A feat of metabolic proportions: Pdx1 orchestrates islet development and function in the maintenance of glucose homeostasis.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 92 (1), 43-55 (2007).</li><li>Poitout, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucolipotoxicity+of+the+pancreatic+beta+cell.">Glucolipotoxicity of the pancreatic beta cell.</a> Biochimica Biophysica Acta. 1801 (3), 289-298 (2010).</li><li>Pearson, G., Soleimanpour, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ubiquitin-dependent+mitophagy+complex+maintains+mitochondrial+function+and+insulin+secretion+in+beta+cells.">A ubiquitin-dependent mitophagy complex maintains mitochondrial function and insulin secretion in beta cells.</a> Autophagy. 14 (7), 1160-1161 (2018).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomes+reveal+characteristic+features+of+human+pancreatic+islet+cell+types.">Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types.</a> EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).</li><li>DiGruccio, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+alpha,+beta+and+delta+cell+transcriptomes+reveal+that+ghrelin+selectively+activates+delta+cells+and+promotes+somatostatin+release+from+pancreatic+islets.">Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets.</a> Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).</li><li>Lawlor, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomes+identify+human+islet+cell+signatures+and+reveal+cell-type&#8211;specific+expression+changes+in+type+2+diabetes.">Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type&#8211;specific expression changes in type 2 diabetes.</a> Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).</li><li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+islets+contain+four+distinct+subtypes+of+&#946;+cells.">Human islets contain four distinct subtypes of &#946; cells.</a> Nature Communications. 7, 11756 (2016).</li><li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+major+pancreatic+cell+types+and+long-term+culture-initiating+cells+using+novel+human+surface+markers.">Isolation of major pancreatic cell types and long-term culture-initiating cells using novel human surface markers.</a> Stem Cell Research. 1 (3), 183-194 (2008).</li><li>Jayaraman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+detection+of+viable+human+pancreatic+beta+cells+by+flow+cytometry+using+fluorophores+that+selectively+detect+labile+zinc,+mitochondrial+membrane+potential+and+protein+thiols.">A novel method for the detection of viable human pancreatic beta cells by flow cytometry using fluorophores that selectively detect labile zinc, mitochondrial membrane potential and protein thiols.</a> Cytometry Part A. 73 (7), 615-625 (2008).</li><li>Arda, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Dependent+Pancreatic+Gene+Regulation+Reveals+Mechanisms+Governing+Human+&#223;-Cell+Function.">Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human &#223;-Cell Function.</a> Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).</li><li>Allen, G. F. G., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+iron+triggers+PINK1/Parkin-independent+mitophagy.">Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy.</a> EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).</li><li>Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. -. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+Parkin+Zone:+Mitophagy+without+Parkin.">No Parkin Zone: Mitophagy without Parkin.</a> Trends in Cell Biology. , (2018).</li></ol>

Her beskriver vi en enkel og effektiv tilnærming til bruk NRDP1: USP8 PLA i vev/celler av interesse å kvantifisere dannelsen av oppstrøms mitophagy komplekser. Vi har tidligere bekreftet dannelsen av CLEC16A-NRDP1-USP8 mitophagy kompleks i bukspyttkjertelen beta celler av flere metoder, inkludert co-immunutfelling eksperimenter, celle-frie interaksjonsstudier, og in vitro samt celle-baserte ubiqitinering analyser, og demonstrerte hvordan dette komplekse stasjoner regulert mitophagic Flux1,...

Bukspyttkjertelen beta celler produserer insulin som kreves for å opprettholde normal glukose homeostase, og deres svikt resulterer i utviklingen av alle former for diabetes. Beta celler beholde en robust mitokondrie kapasitet til å generere energien som kreves for å par glukose metabolisme med insulin utgivelse. Nylig har det blitt klart at vedlikehold av funksjonell mitokondrie massen er av avgjørende betydning for optimal beta celle funksjon1,2,3. For å opprettholde funksjonell mitokondrie masse, beta celler stole på kvalitetskontroll mekanismer for å fjerne dysfunksjonelle, skadet eller aldrende mitokondrier4. Vi og andre har tidligere vist at beta celler stole på en spesialisert form for mitokondrie omsetning, kalt mitokondrie autofagi (eller mitophagy), for å opprettholde mitokondrie kvalitetskontroll i både gnager og menneskelige holmer1, 2,5. Beklageligvis, imidlertid, der var nei enkel metoden å merker mitophagy, eller endogenously uttrykt mitophagy komponentene, inne human bukspyttkjertelen beta celler.
Vi har nylig vist at oppstrøms regulering av mitophagy i beta celler er avhengig av dannelsen av et protein kompleks bestående av E3 ligases CLEC16A og NRDP1 og deubiquitinase USP81. NRDP1 og USP8 har blitt vist uavhengig å påvirke mitophagy gjennom handling på nøkkelen mitophagy initiator PARKIN6,7. NRDP1 mål PARKIN for ubiqitinering og degradering å skru av mitophagy6, og USP8 spesielt deubiquitinates K6-sammenkoblet PARKIN å fremme dens translokasjon å mitokondrier7. Nærhet ligation analysen (PLA) teknologi har vært en fersk forhånd innen protein interaksjon biologi8, slik visualisering av endogene protein interaksjoner in situ i enkeltceller, og er ikke begrenset av knappe sample materiale. Denne metodikken er spesielt fristende for menneskelig Holme/beta cellebiologi, på grunn av sparsity av prøven tilgjengelighet, koplet til behovet for å forstå fysiologisk relevante protein komplekser innenfor heterogene celletyper.
Utnytte PLA tilnærming, er vi i stand til å observere sentrale endogene mitophagy komplekser i primære menneskelige bukspyttkjertelen beta celler og neuronal cellelinjer, og demonstrere virkningene av et diabetogenic miljø på mitophagy Pathway1. Oppsummert er det overordnede målet med denne protokollen å analysere spesifikke mitophagy protein komplekser i vev som mangler rikelig materiale, eller hvor konvensjonelle protein-interaksjon studier er ikke mulig.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA 1X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Block solution</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>Use 1X PBS, add 10 % donkey serum, and 0.3% Triton X-100 detergent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer A</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>To make 1L: Mix 8.8g NaCl, 1.2g Tris base, 500ul Tween-20, with 750mL ddH20. pH to 7.5 with HCl, and fill to 1L. Filter solution and store at 4C. Bring to RT before experimental use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer B</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>To make 1L: Mix 5.84g NaCl, 4.24g Tris base, 26g Tris-HCl with 500mL ddH20. pH to 7.5, and fill to 1L. Filter solution and store a 4C. Bring to RT before experimental use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5-conjugated AffiniPure donkey anti-goat</td>
			<td>Jackson Labs</td>
			<td>705-175-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detection Reagents Red</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>DU092008-100RXN</td>
			<td>Kit containing: ligation solution stock (5X), ligase, amplification solution stock (5X) and polymerase.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink PLA probe anti-mouse MINUS</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>DU092004-100RXN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink PLA probe anti-rabbit PLUS</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>DU092002-100RXN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polyclonal anti-PDX1 (clone A17)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-14664</td>
			<td>RRID: AB_2162373</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIN6 pancreatic cell line</td>
			<td>Gift from D. Stoffers</td>
			<td></td>
			<td>Mouse insulinoma cell line, utilized for cell-based assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-USP8 antibody (clone US872)</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>SAB200527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pap-pen</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>195505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use to seal antibody and probe solutions on your cells to prevent evaporation when using small solution volumes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBT (phosphate buffered saline with triton)</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>To make 50mL: 43.5mLddH2O, 5mL 10X PBS, 0.5mL 10X BSA(100mg/mL solution), 1mL 10% triton X-100 solution in ddH20)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 10X</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIM(ABS) Human AB serum</td>
			<td>Prodo Labs</td>
			<td>PIM-ABS001GMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIM(G) (glutamine)</td>
			<td>Prodo Labs</td>
			<td>PIM-G001GMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIM(S) media</td>
			<td>Prodo Labs</td>
			<td>PIM-S001GMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PR619</td>
			<td>Apex Bio</td>
			<td>A812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td>Life Technologies (Molecular Probes)</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal anti-FLRF/RNF41 (Nrdp1)</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>A300-049A</td>
			<td>RRID: AB_2181251</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y cells</td>
			<td>Gift from L. Satin</td>
			<td></td>
			<td>Human neuroblastoma cell line, utilized for cell-based assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water for RNA work (DEPC water)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP361-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of endogenous mitophagy complexes in situ in human pancreatic beta cells utilizing proximity ligation assay

Mitophagy er en viktig mitokondrie kvalitetskontroll sti, som er avgjørende for bukspyttkjertel beta celle bioenergi til drivstoff glukose-stimulert insulin utgivelse. Vurdering av mitophagy er utfordrende og krever ofte genetiske journalister eller flere komplementære teknikker som ikke er lett å anvende i vevsprøver, slik som primære, menneskelige bukspyttkjertelen. Her viser vi en robust tilnærming for å visualisere og kvantifisere dannelsen av sentrale endogene mitophagy komplekser i primære menneskelige bukspyttkjertelen holmer. Utnytte den følsomme nærhet ligation analysen teknikk for å oppdage samspillet av mitophagy regulatorer NRDP1 og USP8, er vi i stand til å spesifikt kvantifisere dannelsen av essensielle mitophagy komplekser in situ. Ved sammenkobling denne tilnærmingen til counterstaining for transkripsjon faktor PDX1, kan vi kvantifisere mitophagy komplekser, og faktorer som kan svekke mitophagy, spesielt i beta-celler. Metodikken vi beskriver overvinner behovet for store mengder av cellulære ekstrakter som kreves for andre protein-protein interaksjonsstudier, slik som immunutfelling (IP) eller masse massespektrometri, og er ideell for dyrebare menneskelige Holmen prøver generelt ikke tilgjengelig i tilstrekkelige mengder for disse tilnærmingene. Videre, denne metodikken obviates behovet for flyt sortering teknikker for å rense beta celler fra en heterogen Holme befolkning for nedstrøms protein applikasjoner. Derfor beskriver vi en verdifull protokoll for visualisering av mitophagy som er svært kompatibel for bruk i heterogene og begrensede celle populasjoner.

Vi gjennomførte innledende eksperimenter i MIN6 bukspyttkjertelen beta cellelinje og SH-SY5Y neuroblastom cellelinje SH-SY5Y, for å optimalisere og bekrefte både spesifisitet av antistoffer og visualisere protein interaksjoner. MIN6 celler ble belagt på coverslips på 30 000 celler/mL og venstre for å overholde 48 h, SH-SY5Y celler ble belagt på coverslips på 15 000 celler/mL og venstre for å overholde 24 h. PLA-protokollen ble deretter fulgt som ovenfor, og begynte ved Step 1.2.3...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay at JoVE.com

Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

Visualisering av endogene Mitophagy komplekser in situ i Human bukspyttkjertelen beta Cells utnytte nærhet ligation analysen

Denne protokollen skisserer en metode for kvantitativ analyse av mitophagy protein kompleks formasjon spesielt i beta celler fra primære menneskelige Holme prøver. Denne teknikken gir dermed analyse av mitophagy fra begrenset biologisk materiale, som er avgjørende i dyrebare menneskelige bukspyttkjertelen beta celleprøver.

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...

Denne protokollen tillater oss å overvåke endogene mitophagy komplekser i menneskelige vev som betaceller, tilrettelegge mitophagy forskning i pivotale translasjonelt relevante vev. En fordel med denne teknikken er dens evne til å visualisere viktige mitophagy komplekser in vivo i vev med en sjelden tilgjengelighet eller i små prøvenumre. Etter isolasjon i henhold til standardprotokoller, kultur fire til seks ganger 10 til den tredje menneskelige holmekvivalenter i 10 milliliter med komplett bukspyttkjertel holme medium i minst en dag på 37 grader Celsius.Neste dag, bruk et disseksjonslysmikroskop på en tre ganger forstørrelse for å telle individuelle menneskelige holmer i kulturen. Velg 40 holmer per behandling eller tilstand av interesse i 1,5 milliliter rør av holmemedium. Sediment holmene ved sentrifugering og gjenbruk pellet i en milliliter PBS supplert med 50 mikromos PR619.Inverter røret og samle holmene ved sentrifugering for en ekstra vask i frisk PBS pluss deubiquitinasehemmer. Etter den andre sentrifugeringen, dissosiere holmene i enkeltceller med 125 mikroliter på 0,25% trypsin pluss hemmer i tre minutter ved 37 grader Celsius med periodisk mild pipettering. På slutten av inkubasjonen, arrester reaksjonen med en milliliter på 37 grader Celsius oppvarmet bukspyttkjerteløye supplert med PR619.Samle holmene ved sentrifugering for to vasker i fersk PBS pluss hemmer per vask. Etter den andre vasken, resuspend de dissosierte holmene i 150 mikroliter av friske PBS pluss hemmer. For etterlevelse og fiksering av de enkelte holmene, cytospin celleløsningen på frostede ladede mikroskoplyser og skissere celleområdet med en hydrofob penn.Fest deretter de omkransede cellene med 4% paraformaldehyd og PBS i 15 minutter ved romtemperatur. For immunohistokjemisk analyse av holmeprøvene, vask cellene med to fem minutters vasker i PBS ved romtemperatur, etterfulgt av ikke-spesifikk bindingsblokkering med 10% eselserum og PBS pluss 0,3% vaskemiddel i en time ved romtemperatur. På slutten av blokkeringsinkubasjonen, coincubate cellene med primær mus antistoff mot ubiquitin-spesifikk peptidase 8, primær kanin antistoff mot neuregulin reseptor nedbrytning protein-1, og en markør spesifikk for beta celle identifikasjon som ikke ble hevet i mus eller kanin for ikke å forstyrre nærhet ligation analysesignal over natten på fire grader Celsius.Neste morgen vasker du prøvene med to fem minutters vasker i PBS på en rocker. Tilsett anti-geit Cy5 sekundært antistoff til en nylaget nærhet ligation analyseløsning. Etter den andre vasken, merk hver holmeprøve med 20 mikroliter sondeløsning og gjenopprette lysbildene med plastfilm for en times inkubasjon ved 37 grader Celsius.På slutten av inkubasjonen, vask cellene med to fem minutters vasker i buffer A på en rocker etterfulgt av inkubasjon med 20 mikroliter nylaget ligation løsning supplert med 0,25 enheter per mikroliter ligase per lysbilde for en 30-minutters inkubasjon ved 37 grader Celsius. På slutten av ligation, vask cellene to ganger med buffer A i to minutter per vask. Dekk hver prøve med 20 mikroliter forsterkningsløsninger supplert med polymerase for en 100-120-minutters inkubasjon ved 37 grader Celsius.For å forberede cellene for bildebehandling, vask prøvene to ganger i fersk buffer A i 10 minutter per vask på en rocker etterfulgt av en vask i 0,1x buffer B i to minutter på vipperen. Etter siste vask monterer du lysbildene med en dråpe monteringsmedium som inneholder DAPI og plasserer forsiktig en dekkslipp over hver prøve ved hjelp av en skalpell for å trykke ut eventuelle bobler. Tet deretter dekkglassene med klar neglelakk rundt kantene.For å se for deg prøvene plasserer du et lysbilde på scenen i et mikroskop som kan fange flere fokalplan og velge 100 ganger forstørrelse. Sett Z-stack-høyden til ca. 0,45 mikrometer og passende flekk, konstain og levende cellesignalutseparatasjons- og utslippsparametere. Få minst ni forskjellige fokalplanbilder.For å sikre at fluorescensbildebakgrunnssignaler og bortkommen lys minimeres, behandle bildene ved hjelp av en todimensjonal deconvolution nærmeste nabo algoritme ved hjelp av en standard bildebehandling programvare av valget. For å kvantifisere nærhetsligationanalysen, åpne ImageJ og åpne nærhetsanalysebildet. Fra det første skarpt fokusbildet klikker du på Bilde og velger Juster og Terskel.Juster terskelen for å fjerne alle de ikke-spesifikke nærhetsligationanalysesignalet og noter terskeljusteringen for å prøve å holde signalet konsekvent gjennom analyse. Klikk Behandle og velg Binær og Gjør binær. Bekreft at Størrelsen er satt til null til uendelig, Sirkelalitet er satt til null til en, Vis er satt til Disposisjoner og sjekk boksene Vis resultater og Fjern resultater.Legg merke til antall partikler som analyseres i et regneark som betegner prøven og Z-stakkposisjonen. Klikk deretter Analyser og analyser partikler for å måle partiklene. Når alle in-focus Z-stablene for prøven er analysert, sender du det totale antallet partikler for prøven i regnearket for å kvantifisere det totale antallet interaksjoner.Antistoffene som brukes i nærhetsanalysen er spesifikke for ligandene og viser ingen overlapping. Som observert er dispersjonsprotokollen svært effektiv til å skaffe enkeltceller i mikroskopfeltet for nedstrøms analyse, og betacellefarging beholdes etter nærhetsligationsanalyse i primære menneskelige holmer. Ved hjelp av de demonstrerte teknikkene kan det fastslås at samspillet mellom neuregulinreseptornedbrytning protein-1 og ubiquitin-spesifikk peptidase 8 reduseres etter en 48-timers eksponering for palmititt, noe som fremhever muligheten for denne analysen for å vurdere viktige endogene mitophagy faktorer etter diabetogene stimuli.Effektiv og mild spredning av menneskelige holmer er avgjørende for å sikre kvantifisering av de riktige cellepopulasjonene nedstrøms. PLA gjør det mulig å vurdering av viktige mitophagy komplekser i menneskelige holmeprøver som tillater analyse av mitophagy og biologisk viktige menneskelige pasientprøver som beveger feltet diabetesforskning fremover.

Research

JoVE Journal

Medicine

Staining Protocols for Human Pancreatic Islets

Fargeløsninger Protokoller for Human pancreatic holmer

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and ...

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Forbedret Visualisering av lungemetastaser ved Single Cell Oppløsning i Mus med Kombinert<em&gt; In-situ</em&gt; Perfusjon av lungevev og X-Gal Farging av<em&gt; LacZ</em&gt;-Merket tumorceller

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells

Coculture Analyse av Ekstracellulære protein interaksjoner som påvirker insulinsekresjon ved betaceller i bukspyttkjertelen

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within ...

A Protocol for Genetic Induction and Visualization of Benign and Invasive Tumors in Cephalic Complexes of Drosophila melanogaster

A Protocol for Genetic Induction and Visualization of Benign and Invasive Tumors in Cephalic Complexes of Drosophila melanogaster

En protokoll for Genetic Induksjon og visualisering av godartede og invasive tumorer i Cephalic Komplekser av<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila has illuminated our  understanding of the genetic basis of normal development and disease for the  past several decades and today it continues ...

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Simulabukspyttkjertel Neuroplasticity:<em&gt; In Vitro</em&gt; Dual-nevron Plasticity analysen

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Multi-elektrode Array Recordings of Human Epileptiske Postoperativ Kortikal Tissue

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studerer Bukspyttkjertelkreft Stem Cell Kjennetegn for å utvikle nye behandlingsstrategier

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Nedbryting av museceller fra menneske tumorxenotransplantater forbedrer Nedstrøms Analyse av Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

In Vitro og i Vivo oppdagelse av Mitophagy i menneskelige celler, C. Elegansog mus

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

Application of End-to-end Anastomosis in Robotic Central Pancreatectomy

Anvendelse av ende-til-ende anastomose i robot sentrale Pancreatectomy

Central pancreatectomy is carried out for the treatment of benign or low-malignant potential tumors located in the pancreatic neck or proximal part of ...