Name: visualization of endogenous mitophagy complexes in situ in human pancreatic beta cells utilizing proximity ligation assay
Uploaded: 2019-05-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay at JoVE.com

Авторы признают финансовую поддержку со стороны JDRF (CDA-2016-189 и SRA-2018-539), Национального института диабета и болезней пищеварения и почек, Национальных институтов здравоохранения (R01-DK-108921), семьи Брем и семьи Энтони. Премия JDRF по развитию карьеры s.A.S. частично поддерживается Датской академией диабета, которая поддерживается Фондом Ново Нордиска.

Использование де-идентифицированных донорских островков поджелудочной железы человека через Институциональный наблюдательный совет (IRB) освобождение и в соответствии с Мичиганского университета IRB политики. Островки поджелудочной железы были предоставлены NIH/NIDDK спонсируемой Компл?...

<ol>
	<li>Pearson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clec16a,+Nrdp1,+and+USP8+Form+a+Ubiquitin-Dependent+Tripartite+Complex+That+Regulates+beta-Cell+Mitophagy.">Clec16a, Nrdp1, and USP8 Form a Ubiquitin-Dependent Tripartite Complex That Regulates beta-Cell Mitophagy.</a> Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).</li><li>Soleimanpour, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diabetes+susceptibility+gene+Clec16a+regulates+mitophagy.">The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy.</a> Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).</li><li>Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+regulation+of+&#946;-cell+function:+Maintaining+the+momentum+for+insulin+release.">Mitochondrial regulation of &#946;-cell function: Maintaining the momentum for insulin release.</a> Molecular Aspects of Medicine. , (2015).</li><li>Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+by+mitophagy.">Regulation by mitophagy.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 53, 147-150 (2014).</li><li>Soleimanpour, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+Susceptibility+Genes+Pdx1+and+Clec16a+Function+in+a+Pathway+Regulating+Mitophagy+in+beta-Cells.">Diabetes Susceptibility Genes Pdx1 and Clec16a Function in a Pathway Regulating Mitophagy in beta-Cells.</a> Diabetes. 64 (10), 3475-3484 (2015).</li><li>Zhong, L., Tan, Y., Zhou, A., Yu, Q., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RING+Finger+Ubiquitin-Protein+Isopeptide+Ligase+Nrdp1/FLRF+Regulates+Parkin+Stability+and+Activity.">RING Finger Ubiquitin-Protein Isopeptide Ligase Nrdp1/FLRF Regulates Parkin Stability and Activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9425-9430 (2005).</li><li>Durcan, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=USP8+regulates+mitophagy+by+removing+K6-linked+ubiquitin+conjugates+from+parkin.">USP8 regulates mitophagy by removing K6-linked ubiquitin conjugates from parkin.</a> The EMBO Journal. 33 (21), 2473-2491 (2014).</li><li>Gauthier, T., Claude-Taupin, A., Delage-Mourroux, R., Boyer-Guittaut, M., Hervouet, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+Ligation+In+situ+Assay+is+a+Powerful+Tool+to+Monitor+Specific+ATG+Protein+Interactions+following+Autophagy+Induction.">Proximity Ligation In situ Assay is a Powerful Tool to Monitor Specific ATG Protein Interactions following Autophagy Induction.</a> PLoS ONE. 10 (6), e0128701 (2015).</li><li>Silva Xavier, D. a., G, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cells+of+the+Islets+of+Langerhans.">The Cells of the Islets of Langerhans.</a> Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54 (2018).</li><li>Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+islet+plasticity:+Interspecies+comparison+of+islet+architecture+and+composition.">Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition.</a> Islets. 2 (3), 135-145 (2010).</li><li>Cabrera, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unique+cytoarchitecture+of+human+pancreatic+islets+has+implications+for+islet+cell+function.">The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (7), 2334 (2006).</li><li>Brissova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Human+Pancreatic+Islet+Architecture+and+Composition+by+Laser+Scanning+Confocal+Microscopy.">Assessment of Human Pancreatic Islet Architecture and Composition by Laser Scanning Confocal Microscopy.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).</li><li>Babu, D. A., Deering, T. G., Mirmira, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+feat+of+metabolic+proportions:+Pdx1+orchestrates+islet+development+and+function+in+the+maintenance+of+glucose+homeostasis.">A feat of metabolic proportions: Pdx1 orchestrates islet development and function in the maintenance of glucose homeostasis.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 92 (1), 43-55 (2007).</li><li>Poitout, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucolipotoxicity+of+the+pancreatic+beta+cell.">Glucolipotoxicity of the pancreatic beta cell.</a> Biochimica Biophysica Acta. 1801 (3), 289-298 (2010).</li><li>Pearson, G., Soleimanpour, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ubiquitin-dependent+mitophagy+complex+maintains+mitochondrial+function+and+insulin+secretion+in+beta+cells.">A ubiquitin-dependent mitophagy complex maintains mitochondrial function and insulin secretion in beta cells.</a> Autophagy. 14 (7), 1160-1161 (2018).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomes+reveal+characteristic+features+of+human+pancreatic+islet+cell+types.">Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types.</a> EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).</li><li>DiGruccio, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+alpha,+beta+and+delta+cell+transcriptomes+reveal+that+ghrelin+selectively+activates+delta+cells+and+promotes+somatostatin+release+from+pancreatic+islets.">Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets.</a> Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).</li><li>Lawlor, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomes+identify+human+islet+cell+signatures+and+reveal+cell-type&#8211;specific+expression+changes+in+type+2+diabetes.">Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type&#8211;specific expression changes in type 2 diabetes.</a> Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).</li><li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+islets+contain+four+distinct+subtypes+of+&#946;+cells.">Human islets contain four distinct subtypes of &#946; cells.</a> Nature Communications. 7, 11756 (2016).</li><li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+major+pancreatic+cell+types+and+long-term+culture-initiating+cells+using+novel+human+surface+markers.">Isolation of major pancreatic cell types and long-term culture-initiating cells using novel human surface markers.</a> Stem Cell Research. 1 (3), 183-194 (2008).</li><li>Jayaraman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+detection+of+viable+human+pancreatic+beta+cells+by+flow+cytometry+using+fluorophores+that+selectively+detect+labile+zinc,+mitochondrial+membrane+potential+and+protein+thiols.">A novel method for the detection of viable human pancreatic beta cells by flow cytometry using fluorophores that selectively detect labile zinc, mitochondrial membrane potential and protein thiols.</a> Cytometry Part A. 73 (7), 615-625 (2008).</li><li>Arda, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Dependent+Pancreatic+Gene+Regulation+Reveals+Mechanisms+Governing+Human+&#223;-Cell+Function.">Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human &#223;-Cell Function.</a> Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).</li><li>Allen, G. F. G., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+iron+triggers+PINK1/Parkin-independent+mitophagy.">Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy.</a> EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).</li><li>Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. -. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+Parkin+Zone:+Mitophagy+without+Parkin.">No Parkin Zone: Mitophagy without Parkin.</a> Trends in Cell Biology. , (2018).</li></ol>

Здесь мы описываем простой и эффективный подход к использованию NRDP1:USP8 PLA в тканях/клетках, представляющих интерес для количественной оценки формирования высокопотечения митофагических комплексов. Ранее мы подтвердили формирование CLEC16A-NRDP1-USP8 митофагии комплекса в бета-клеток поджелу...

Бета-клетки поджелудочной железы производят инсулин, необходимый для поддержания нормального гомеостаза глюкозы, и их неудача приводит к развитию всех форм диабета. Бета-клетки сохраняют надежную митохондриальную способность генерировать энергию, необходимую для сочетания метаболизма глюкозы с высвобождением инсулина. В последнее время стало очевидно, что поддержание функциональной митохондриальноймассы имеет ключевое значение для оптимальной функции бета-клеток 1,2,3. Для поддержания функциональной митохондриальной массы бета-клетки полагаются на механизмы контроля качествадля удаления дисфункциональных, поврежденных или стареющих митохондрий 4. Мы и другие ранее показали, что бета-клетки полагаются на специализированную форму митохондриального оборота, называемую митохондриальной аутофагией (или митофагией), для поддержания контроля качества митохондрии как у грызунов, так и у человека островков1, 2,5. К сожалению, однако, не было простого способа обнаружения митофагии, или эндогенно выраженных митофагических компонентов, в бета-клетках поджелудочной железы человека.
Недавно мы показали, что регулирование вверх по течению митофагии в бета-клетках опирается на формирование белкового комплекса, включающего E3 лигазаclees CLEC16A и NRDP1 и deubiquitinase USP81. NRDP1 и USP8 были показаны независимо, чтобы повлиять на митофагию через действие на ключевой митофаг иинициатор PARKIN6,7. NRDP1 цели PARKIN для повсеместности и деградации, чтобы выключить митофагии6, и USP8 специально deubiquitinates K6 связанных PARKIN содействовать его транслокации в митохондрии7. Близость перевязки анализ (PLA) технология была недавний прогресс в области белкового взаимодействия биологии8, что позволяет визуализации эндогенных белковых взаимодействий на месте в одиночных клетках, и не ограничивается дефицитным материалом образца. Эта методология особенно заманчиво для человека островк / бета-клеточной биологии, в связи с редкостью наличия образцов, в сочетании с необходимостью понимания физиологически значимых белковых комплексов в неоднородных типов клеток.
Используя подход PLA, мы можем наблюдать ключевые комплексы эндофагии в первичных бета-клеток поджелудочной железы человека и нейрональных клеточных линий, и продемонстрировать влияние диабетогенной среды на митофагическом пути1. Таким образом, главной целью этого протокола является анализ конкретных митофагных белковых комплексов в тканях, не хватает обильного материала, или где обычные исследования взаимодействия белка невозможны.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA 1X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Block solution</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>Use 1X PBS, add 10 % donkey serum, and 0.3% Triton X-100 detergent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer A</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>To make 1L: Mix 8.8g NaCl, 1.2g Tris base, 500ul Tween-20, with 750mL ddH20. pH to 7.5 with HCl, and fill to 1L. Filter solution and store at 4C. Bring to RT before experimental use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer B</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>To make 1L: Mix 5.84g NaCl, 4.24g Tris base, 26g Tris-HCl with 500mL ddH20. pH to 7.5, and fill to 1L. Filter solution and store a 4C. Bring to RT before experimental use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5-conjugated AffiniPure donkey anti-goat</td>
			<td>Jackson Labs</td>
			<td>705-175-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detection Reagents Red</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>DU092008-100RXN</td>
			<td>Kit containing: ligation solution stock (5X), ligase, amplification solution stock (5X) and polymerase.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink PLA probe anti-mouse MINUS</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>DU092004-100RXN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink PLA probe anti-rabbit PLUS</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>DU092002-100RXN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polyclonal anti-PDX1 (clone A17)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-14664</td>
			<td>RRID: AB_2162373</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIN6 pancreatic cell line</td>
			<td>Gift from D. Stoffers</td>
			<td></td>
			<td>Mouse insulinoma cell line, utilized for cell-based assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-USP8 antibody (clone US872)</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>SAB200527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pap-pen</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>195505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use to seal antibody and probe solutions on your cells to prevent evaporation when using small solution volumes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBT (phosphate buffered saline with triton)</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>To make 50mL: 43.5mLddH2O, 5mL 10X PBS, 0.5mL 10X BSA(100mg/mL solution), 1mL 10% triton X-100 solution in ddH20)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 10X</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIM(ABS) Human AB serum</td>
			<td>Prodo Labs</td>
			<td>PIM-ABS001GMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIM(G) (glutamine)</td>
			<td>Prodo Labs</td>
			<td>PIM-G001GMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIM(S) media</td>
			<td>Prodo Labs</td>
			<td>PIM-S001GMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PR619</td>
			<td>Apex Bio</td>
			<td>A812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td>Life Technologies (Molecular Probes)</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal anti-FLRF/RNF41 (Nrdp1)</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>A300-049A</td>
			<td>RRID: AB_2181251</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y cells</td>
			<td>Gift from L. Satin</td>
			<td></td>
			<td>Human neuroblastoma cell line, utilized for cell-based assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water for RNA work (DEPC water)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP361-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of endogenous mitophagy complexes in situ in human pancreatic beta cells utilizing proximity ligation assay

Митофагия является важным митохондриальным пути контроля качества, который имеет решающее значение для поджелудочной железы газа бета-клеток биоэнергетики для топлива глюкозы стимулировали высвобождение инсулина. Оценка митофагии является сложной задачей и часто требует генетических репортеров или несколько дополнительных методов не легко использовать в образцах тканей, таких как первичные островки поджелудочной железы человека. Здесь мы демонстрируем надежный подход к визуализации и количественной оценке формирования ключевых эндогенных митофагических комплексов в первичных островках поджелудочной железы. Используя чувствительный метод перевязки близости для обнаружения взаимодействия регуляторов митофагии NRDP1 и USP8, мы можем специально количественно определить формирование основных митофагных комплексов на месте. Соединяя этот подход к противодействию транскрипции факторPDX1, мы можем количественно митофагических комплексов, и факторы, которые могут ухудшить митофагии, в частности, в бета-клетки. Методология, которая мы описываем, преодолевает потребность в больших количествах клеточных экстрактов, необходимых для других исследований взаимодействия белково-белкового взаимодействия, таких как иммунопреципиция (ИС) или масс-спектрометрия, и идеально подходит для драгоценных образцов человека, как правило, не в достаточном количестве для этих подходов. Кроме того, эта методология устраняет необходимость в методах сортировки потоков для очистки бета-клеток от неоднородной популяции островков для применения белка ниже по течению. Таким образом, мы описываем ценный протокол для визуализации митофагии, хорошо совместимых для использования в разнородных и ограниченных популяциях клеток.

Мы провели первоначальные эксперименты в линии бета-клеток поджелудочной железы MIN6 и линии нейробластомы SH-SY5Y SH-SY5Y, чтобы оптимизировать и подтвердить как специфичность антител, так и визуализированные белковые взаимодействия. Клетки MIN6 были покрыты крышками на крыш...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay at JoVE.com

Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

Визуализация эндогенных митофагных комплексов на месте в бета-клетках поджелудочной железы человека, используя асссы Лигации близости

Этот протокол излагает метод количественного анализа образования митофагии протеинового комплекса, специально в бета-клетках из первичных образцов человека- иаклетов. Этот метод, таким образом, позволяет анализ митофагии из ограниченного биологического материала, которые имеют решающее значение в драгоценных человеческих образцов бета-клеток поджелудочной железы.

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...

Этот протокол позволяет нам контролировать эндогенные митофагийные комплексы в тканях человека, такие как бета-клетки, облегчая исследования митофагии в ключевых переводно-соответствующих тканях. Одним из преимуществ этого метода является его способность визуализировать важные митофагийные комплексы in vivo в тканях с редкой доступностью или небольшими номерами выборки. После изоляции в соответствии со стандартными протоколами, культура от четырех до шести раз от 10 до третьего человека островков эквиваленты в 10 миллилитров полной среды островка поджелудочной железы, по крайней мере один день при 37 градусов по Цельсию.На следующий день используйте световой микроскоп для вскрытия при трехкратных увеличении, чтобы подсчитать отдельные человеческие островки в культуре. Выберите 40 островков для лечения или состояние интереса в 1,5 миллилитровые трубки островка среды. Осадок островков центрифугации и повторно гранулы в один миллилитр PBS дополняется 50 микромолярной PR619.Инвертировать трубку и собирать островки центрифугации для второй стирки в свежем PBS плюс ингибитор deubiquitinase. После второй центрифугации, разобщить островки в одиночные клетки с 125 микролитров 0,25%трипсина плюс ингибитор в течение трех минут при 37 градусов по Цельсию с периодической нежной пипетки. В конце инкубации, арест реакции с одним миллилитр 37 градусов по Цельсию нагревается островок поджелудочной железы среды дополняется PR619.Соберите островки путем центрифугации для двух моет в свежем PBS плюс ингибитор на стирку. После второй стирки, resuspend диссоциированных островков в 150 микролитров свежего ингибитора PBS плюс. Для присоединения и фиксации отдельных островков, цитоскопии клеточного раствора на матовой заряженный микроскоп слайды и наброски клеточной области с гидрофобной ручкой.Затем исправить окружающие клетки с 4%paraformaldehyde и PBS в течение 15 минут при комнатной температуре. Для иммуногистохимического анализа образцов островка, мыть клетки с двумя пятиминутными моет в PBS при комнатной температуре, а затем неспецифические связывания блокировки с 10%осла сыворотки и PBS плюс 0,3% моющего средства в течение одного часа при комнатной температуре. В конце блокирования инкубации, coincubate клетки с первичными антителами мыши против убиквитина конкретных пептидаза 8, первичные антитела кролика против неурегулиновых рецепторов деградации белка-1, и маркер, специфический для бета-идентификации клеток, которые не были подняты в мыши или кролика, чтобы не вмешиваться в близость перевязки сигнал анализа ночь на четыре градуса Цельсия.На следующее утро, мыть образцы с двумя пятиминутные моет в PBS на рокер. Добавьте анти-коза Cy5 вторичное антитело к свежеприготовленной близости перевязки анализа раствора. После второй стирки, этикетка каждого образца островка с 20 микролитров раствора зонда и восстановить слайды с пластиковой пленкой для одного часа инкубации при 37 градусов по Цельсию.В конце инкубации, мыть клетки с двумя пятиминутными моет в буфере на рокер следуют инкубации с 20 микролитров свежеприготовленного раствора перевязки дополняется 0,25 единиц на микролитер лигазы на слайд для 30-минутной инкубации при 37 градусов по Цельсию. В конце перевязки, мыть клетки два раза с буфером В течение двух минут за стирку. Обложка каждого образца с 20 микролитров усиления решений, дополненных полимеразы для 100-120-минутной инкубации при 37 градусов по Цельсию.Чтобы подготовить клетки к визуализации, мыть образцы два раза в свежем буфере А в течение 10 минут за стирку на рокере с последующим одной стиркой в буфере B в 0,1 раза в течение двух минут на рокере. После последней стирки, смонтировать слайды с каплей монтажа среды, содержащей DAPI и тщательно место coverslip над каждым образцом с помощью скальпеля, чтобы выжимать любые пузыри. Затем запечатать крышки с четким лаком для ногтей по краям.Чтобы издать образцы, поместите слайд на сцену микроскопа, способного захватить несколько фокусных плоскостей, и выберите увеличение в 100 раз. Установите высоту стека до примерно 0,45 микрометра и соответствующие параметры пятна, счетчики и параметры живого сигнала клетки. Получить по крайней мере девять различных фокусных изображений плоскости.Чтобы свести к минимуму фоновые сигналы изображения флуоресценции и рассеянный свет, обработайте изображения с помощью двухмерного алгоритма деконволюции ближайшего соседа с помощью стандартного программного обеспечения для обработки изображений по выбору. Для количественной оценки взаимодействия перевязки близости, откройте ImageJ и откройте изображение анализа перевязки близости. Начиная с первого резко в фокусе изображения, нажмите изображение и выберите Настроить и порог.Отрегулируйте порог, чтобы удалить весь неспецифический сигнал анализа перевязки близости и обратите внимание на регулировку порога, чтобы попытаться сохранить сигнал последовательным на протяжении всего анализа. Нажмите процесс и выберите двоичный и сделать двоичный. Подтвердите, что размер установлен с нуля до бесконечности, Циркулярность устанавливается на ноль к одному, Показать устанавливается для очертания и проверить результаты отображения и очистить коробки результатов.Обратите внимание на количество частиц, анализируемых в электронной таблице, обозначающих образец и положение в стеке. Затем нажмите Анализ и анализ частиц для измерения частиц. Когда все в фокусе стеки для образца были проанализированы, отправьте общее количество частиц для выборки в электронной таблице для количественной оценки общего числа взаимодействий.Антитела, используемые в анализе близости, специфичны для лигандов и не демонстрируют никакого перекрытия. Как было отмечено, протокол дисперсии является высокоэффективным при получении одиночных клеток в области микроскопа зрения для анализа вниз по течению и бета-клеток окрашивания сохраняется после близости перевязки анализа окрашивания в первичных человеческих островков. Используя продемонстрированые методы, можно определить, что взаимодействие белка деградации рецепторов нейрегулина-1 и ubiquitin-специфической пептидазы 8 снижается после 48-часового воздействия пальмитата, подчеркивая целесообразность этого анализа для оценки ключевых эндогенных факторов митофагии после диабетогенных стимулов.Эффективная и мягкая рассеивание человеческих островков имеет важное значение для обеспечения количественной оценки правильной популяции клеток ниже по течению. НОАК позволяет проводить оценку важных митофагийных комплексов в образцах островка человека, что позволяет проводить анализ митофагии и биологически важных образцов пациентов, перемещая области исследований диабета вперед.

Research

JoVE Journal

Medicine

Staining Protocols for Human Pancreatic Islets

Окрашивание протоколы по правам островков поджелудочной железы

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and ...

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Улучшена визуализация метастазов в легких на одной резолюции сотовый у мышей, комбинированные<em&gt; В месте</em&gt; Перфузии легочной ткани и X-Gal Окрашивание<em&gt; LacZ</em&gt;-Меткой опухолевых клеток

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells

Coculture Анализ внеклеточных белковых взаимодействий влияющие секрецию инсулина клетками поджелудочной железы бета

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within ...

A Protocol for Genetic Induction and Visualization of Benign and Invasive Tumors in Cephalic Complexes of Drosophila melanogaster

A Protocol for Genetic Induction and Visualization of Benign and Invasive Tumors in Cephalic Complexes of Drosophila melanogaster

Протокол генной индукции и визуализации доброкачественных и инвазивных опухолей в Cephalic комплексов<em&gt; Дрозофилы</em

Drosophila has illuminated our  understanding of the genetic basis of normal development and disease for the  past several decades and today it continues ...

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Имитация поджелудочной Нейропластичность:<em&gt; Экстракорпоральное</em&gt; Dual-нейрон Пластичность Анализ

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Многоэлектродной массива Записи человека эпилептические Послеоперационный корковой ткани

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Изучение рака поджелудочной железы стволовых клеток Характеристики для разработки новых стратегий лечения

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Истощение мышиных клеток из ксенотрансплантатов опухолей человека значительно улучшает Downstream Анализ клеток-мишеней

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

In Vitro и In Vivo обнаружения Mitophagy в клетки человека и C. Elegans, мышей

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

Application of End-to-end Anastomosis in Robotic Central Pancreatectomy

Применение анастомоза конец в конец в роботизированной Центральной Панкреатэктомия

Central pancreatectomy is carried out for the treatment of benign or low-malignant potential tumors located in the pancreatic neck or proximal part of ...