Name: visualization of endogenous mitophagy complexes in situ in human pancreatic beta cells utilizing proximity ligation assay
Uploaded: 2019-05-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay at JoVE.com

Författarna erkänner finansiering stöd från JDRF (CDA-2016-189 och SRA-2018-539), det nationella institutet för diabetes och mag-och njursjukdomar, National Institutes of Health (R01-DK-108921), familjen Brehm, och Anthony familjen. JDRF-utmärkelsen för karriärutveckling till S.A.S. stöds delvis av den danska diabetes akademin, som stöds av stiftelsen Novo Nordisk.

Användning av avidentifierade givare mänskliga bukspottskörteln öar är via en institutionell översyn Board (IRB) undantag och i enlighet med University of Michigan IRB politik. Mänskliga bukspottskörteln öar tillhandahölls av NIH/NIDDK-sponsrade Integrated Islet distribution program (IIDP).
1. beredning av mänskligt ö-prov
<ol><li>
Separering av enstaka celler
	<ol>
<li>Kultur Human Holmen prover (4000-6000 Holmen motsvarigheter/10 mL Media) för minst 1 dag vid ...

<ol>
	<li>Pearson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clec16a,+Nrdp1,+and+USP8+Form+a+Ubiquitin-Dependent+Tripartite+Complex+That+Regulates+beta-Cell+Mitophagy.">Clec16a, Nrdp1, and USP8 Form a Ubiquitin-Dependent Tripartite Complex That Regulates beta-Cell Mitophagy.</a> Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).</li><li>Soleimanpour, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diabetes+susceptibility+gene+Clec16a+regulates+mitophagy.">The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy.</a> Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).</li><li>Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+regulation+of+&#946;-cell+function:+Maintaining+the+momentum+for+insulin+release.">Mitochondrial regulation of &#946;-cell function: Maintaining the momentum for insulin release.</a> Molecular Aspects of Medicine. , (2015).</li><li>Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+by+mitophagy.">Regulation by mitophagy.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 53, 147-150 (2014).</li><li>Soleimanpour, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+Susceptibility+Genes+Pdx1+and+Clec16a+Function+in+a+Pathway+Regulating+Mitophagy+in+beta-Cells.">Diabetes Susceptibility Genes Pdx1 and Clec16a Function in a Pathway Regulating Mitophagy in beta-Cells.</a> Diabetes. 64 (10), 3475-3484 (2015).</li><li>Zhong, L., Tan, Y., Zhou, A., Yu, Q., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RING+Finger+Ubiquitin-Protein+Isopeptide+Ligase+Nrdp1/FLRF+Regulates+Parkin+Stability+and+Activity.">RING Finger Ubiquitin-Protein Isopeptide Ligase Nrdp1/FLRF Regulates Parkin Stability and Activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9425-9430 (2005).</li><li>Durcan, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=USP8+regulates+mitophagy+by+removing+K6-linked+ubiquitin+conjugates+from+parkin.">USP8 regulates mitophagy by removing K6-linked ubiquitin conjugates from parkin.</a> The EMBO Journal. 33 (21), 2473-2491 (2014).</li><li>Gauthier, T., Claude-Taupin, A., Delage-Mourroux, R., Boyer-Guittaut, M., Hervouet, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+Ligation+In+situ+Assay+is+a+Powerful+Tool+to+Monitor+Specific+ATG+Protein+Interactions+following+Autophagy+Induction.">Proximity Ligation In situ Assay is a Powerful Tool to Monitor Specific ATG Protein Interactions following Autophagy Induction.</a> PLoS ONE. 10 (6), e0128701 (2015).</li><li>Silva Xavier, D. a., G, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cells+of+the+Islets+of+Langerhans.">The Cells of the Islets of Langerhans.</a> Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54 (2018).</li><li>Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+islet+plasticity:+Interspecies+comparison+of+islet+architecture+and+composition.">Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition.</a> Islets. 2 (3), 135-145 (2010).</li><li>Cabrera, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unique+cytoarchitecture+of+human+pancreatic+islets+has+implications+for+islet+cell+function.">The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (7), 2334 (2006).</li><li>Brissova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Human+Pancreatic+Islet+Architecture+and+Composition+by+Laser+Scanning+Confocal+Microscopy.">Assessment of Human Pancreatic Islet Architecture and Composition by Laser Scanning Confocal Microscopy.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).</li><li>Babu, D. A., Deering, T. G., Mirmira, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+feat+of+metabolic+proportions:+Pdx1+orchestrates+islet+development+and+function+in+the+maintenance+of+glucose+homeostasis.">A feat of metabolic proportions: Pdx1 orchestrates islet development and function in the maintenance of glucose homeostasis.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 92 (1), 43-55 (2007).</li><li>Poitout, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucolipotoxicity+of+the+pancreatic+beta+cell.">Glucolipotoxicity of the pancreatic beta cell.</a> Biochimica Biophysica Acta. 1801 (3), 289-298 (2010).</li><li>Pearson, G., Soleimanpour, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ubiquitin-dependent+mitophagy+complex+maintains+mitochondrial+function+and+insulin+secretion+in+beta+cells.">A ubiquitin-dependent mitophagy complex maintains mitochondrial function and insulin secretion in beta cells.</a> Autophagy. 14 (7), 1160-1161 (2018).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomes+reveal+characteristic+features+of+human+pancreatic+islet+cell+types.">Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types.</a> EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).</li><li>DiGruccio, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+alpha,+beta+and+delta+cell+transcriptomes+reveal+that+ghrelin+selectively+activates+delta+cells+and+promotes+somatostatin+release+from+pancreatic+islets.">Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets.</a> Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).</li><li>Lawlor, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomes+identify+human+islet+cell+signatures+and+reveal+cell-type&#8211;specific+expression+changes+in+type+2+diabetes.">Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type&#8211;specific expression changes in type 2 diabetes.</a> Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).</li><li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+islets+contain+four+distinct+subtypes+of+&#946;+cells.">Human islets contain four distinct subtypes of &#946; cells.</a> Nature Communications. 7, 11756 (2016).</li><li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+major+pancreatic+cell+types+and+long-term+culture-initiating+cells+using+novel+human+surface+markers.">Isolation of major pancreatic cell types and long-term culture-initiating cells using novel human surface markers.</a> Stem Cell Research. 1 (3), 183-194 (2008).</li><li>Jayaraman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+detection+of+viable+human+pancreatic+beta+cells+by+flow+cytometry+using+fluorophores+that+selectively+detect+labile+zinc,+mitochondrial+membrane+potential+and+protein+thiols.">A novel method for the detection of viable human pancreatic beta cells by flow cytometry using fluorophores that selectively detect labile zinc, mitochondrial membrane potential and protein thiols.</a> Cytometry Part A. 73 (7), 615-625 (2008).</li><li>Arda, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Dependent+Pancreatic+Gene+Regulation+Reveals+Mechanisms+Governing+Human+&#223;-Cell+Function.">Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human &#223;-Cell Function.</a> Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).</li><li>Allen, G. F. G., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+iron+triggers+PINK1/Parkin-independent+mitophagy.">Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy.</a> EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).</li><li>Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. -. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+Parkin+Zone:+Mitophagy+without+Parkin.">No Parkin Zone: Mitophagy without Parkin.</a> Trends in Cell Biology. , (2018).</li></ol>

Här beskriver vi ett enkelt och effektivt sätt att använda NRDP1: USP8 PLA i vävnader/celler av intresse för att kvantifiera bildandet av uppströms mitofagkomplex. Vi bekräftade tidigare bildandet av CLEC16A-NRDP1-USP8 mitophagy Complex i bukspottskörteln betaceller av flera metoder, inklusive Co-immunoprecipitation experiment, cellfria interaktionsstudier, och in vitro-samt cellbaserade ubiquitination analyser, och visade hur denna komplexa enheter reglerade mitophagic Flux1,<s...

Bukspottskörteln betaceller producerar det insulin som krävs för att upprätthålla normala glukos homeostas, och deras misslyckande resulterar i utvecklingen av alla former av diabetes. Beta celler behåller en robust mitokondriell förmåga att generera den energi som krävs för att par glukos metabolism med insulin release. Nyligen har det blivit uppenbart att upprätthållandet av funktionell mitokondriell massa är av avgörande betydelse för optimal betacellsfunktion1,2,3. För att upprätthålla funktionell mitokondriell massa, betaceller förlitar sig på mekanismer för kvalitetskontroll för att avlägsna dysfunktionella, skadade, eller åldrande mitokondrier4. Vi och andra har tidigare visat att betaceller förlitar sig på en specialiserad form av mitokondriell omsättning, som kallas mitokondriell autofagi (eller mitophagy), för att bibehålla mitokondriell kvalitetskontroll i både gnagare och Human öar1, 2,5. Tyvärr, det fanns dock ingen enkel metod för att upptäcka mitophagy, eller endogent uttryckte mitophagy komponenter, i mänskliga bukspottskörteln betaceller.
Vi har nyligen visat att uppströms regleringen av mitophagy i betaceller förlitar sig på bildandet av ett proteinkomplex som består av E3 Ligaser CLEC16A och NRDP1 och deubiquitinase USP81. NRDP1 och USP8 har visats självständigt påverka mitophagy genom åtgärder på nyckeln mitophagy initiativtagare Parkin6,7. NRDP1 mål Parkin för ubiquitination och nedbrytning för att stänga av mitophagy6, och USP8 specifikt deubiquitinates K6-länkade Parkin för att främja dess flyttning till mitokonen7. Proximity ligering assay (PLA) teknik har varit en nyligen förväg inom området protein interaktion biologi8, vilket möjliggör visualisering av endogena protein interaktioner in situ i enskilda celler, och begränsas inte av knappa provmaterial. Denna metod är särskilt lockande för Human Islet/beta cellbiologi, på grund av den glesa av urvalet tillgänglighet, kopplat till behovet av att förstå fysiologiskt relevanta proteinkomplex inom heterogena celltyper.
Utnyttja PLA strategi, vi har möjlighet att observera viktiga endogena mitophagy komplex i primära mänskliga bukspottskörteln betaceller och neuronala cellinjer, och demonstrera effekterna av en diabetogena miljö på mitophagy väg1. Sammanfattnings, det övergripande målet med detta protokoll är att analysera specifika mitophagy proteinkomplex i vävnader som saknar rikligt material, eller där konventionella protein-interaktionsstudier inte är möjliga.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA 1X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Block solution</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>Use 1X PBS, add 10 % donkey serum, and 0.3% Triton X-100 detergent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer A</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>To make 1L: Mix 8.8g NaCl, 1.2g Tris base, 500ul Tween-20, with 750mL ddH20. pH to 7.5 with HCl, and fill to 1L. Filter solution and store at 4C. Bring to RT before experimental use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer B</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>To make 1L: Mix 5.84g NaCl, 4.24g Tris base, 26g Tris-HCl with 500mL ddH20. pH to 7.5, and fill to 1L. Filter solution and store a 4C. Bring to RT before experimental use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5-conjugated AffiniPure donkey anti-goat</td>
			<td>Jackson Labs</td>
			<td>705-175-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detection Reagents Red</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>DU092008-100RXN</td>
			<td>Kit containing: ligation solution stock (5X), ligase, amplification solution stock (5X) and polymerase.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink PLA probe anti-mouse MINUS</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>DU092004-100RXN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink PLA probe anti-rabbit PLUS</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>DU092002-100RXN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polyclonal anti-PDX1 (clone A17)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-14664</td>
			<td>RRID: AB_2162373</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIN6 pancreatic cell line</td>
			<td>Gift from D. Stoffers</td>
			<td></td>
			<td>Mouse insulinoma cell line, utilized for cell-based assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-USP8 antibody (clone US872)</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>SAB200527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pap-pen</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>195505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use to seal antibody and probe solutions on your cells to prevent evaporation when using small solution volumes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBT (phosphate buffered saline with triton)</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>To make 50mL: 43.5mLddH2O, 5mL 10X PBS, 0.5mL 10X BSA(100mg/mL solution), 1mL 10% triton X-100 solution in ddH20)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 10X</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIM(ABS) Human AB serum</td>
			<td>Prodo Labs</td>
			<td>PIM-ABS001GMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIM(G) (glutamine)</td>
			<td>Prodo Labs</td>
			<td>PIM-G001GMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIM(S) media</td>
			<td>Prodo Labs</td>
			<td>PIM-S001GMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PR619</td>
			<td>Apex Bio</td>
			<td>A812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td>Life Technologies (Molecular Probes)</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal anti-FLRF/RNF41 (Nrdp1)</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>A300-049A</td>
			<td>RRID: AB_2181251</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y cells</td>
			<td>Gift from L. Satin</td>
			<td></td>
			<td>Human neuroblastoma cell line, utilized for cell-based assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water for RNA work (DEPC water)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP361-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of endogenous mitophagy complexes in situ in human pancreatic beta cells utilizing proximity ligation assay

Mitophagy är en viktig mitokondriell kvalitetskontroll väg, vilket är avgörande för bukspottskörteln holme beta cell blockeringar till bränsle glukos-stimulerad insulinfrisättning. Bedömning av mitophagy är utmanande och kräver ofta genetiska reportrar eller flera kompletterande tekniker som inte lätt utnyttjas i vävnadsprover, såsom primära mänskliga pankreasöar. Här visar vi en robust metod för att visualisera och kvantifiera bildandet av viktiga endogena mitofagkomplex i primära mänskliga pankreasöar. Utnyttja den känsliga närhet ligering assay teknik för att upptäcka interaktion av mitophagy regulatorer NRDP1 och USP8, vi har möjlighet att specifikt kvantifiera bildandet av viktiga mitophagy komplex in situ. Genom att koppla detta förhållningssätt till motfärgning för transkriptionsfaktorn PDX1 kan vi kvantifiera mitofagkomplex, och de faktorer som kan försämra mitophagy, specifikt inom betaceller. Den metodik vi beskriver övervinner behovet av stora mängder cellulära extrakt som krävs för andra protein-protein interaktionsstudier, såsom immunoprecipitation (IP) eller masspektrometri, och är idealisk för värdefulla mänskliga Holmen prover i allmänhet inte tillgängliga i tillräckliga kvantiteter för dessa metoder. Vidare, denna metod undanrömer behovet av flödes sortering tekniker för att rena betaceller från en heterogen holme population för nedströms protein tillämpningar. Således beskriver vi ett värdefullt protokoll för visualisering av mitophagy mycket kompatibel för användning i heterogena och begränsade cellpopulationer.

Vi genomförde initiala experiment i MIN6 bukspottskörteln beta cell linjen och sh-SY5Y neuroblastom cellinjer sh-SY5Y, att optimera och bekräfta både specificitet av antikropparna och visualiserade proteininteraktioner. MIN6 celler var pläterade på täckglas på 30 000 celler/mL och vänster för att fästa för 48 h, SH-SY5Y celler var pläterade på täckglas på 15 000 celler/mL och vänster för att följa 24 h. Den PLA-protokollet följdes sedan som ovan, med början i steg 1.2...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay at JoVE.com

Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

Visualisering av endogena Mitofagkomplex in situ i mänskliga bukspottskörteln beta celler använder närhet ligation assay

Detta protokoll beskriver en metod för kvantitativ analys av mitophagy proteinkomplex formation specifikt i betaceller från primära Human Holmen prover. Denna teknik möjliggör därför analys av mitophagy från begränsat biologiskt material, som är avgörande i värdefulla mänskliga bukspottskörteln beta cell prover.

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...

Detta protokoll gör det möjligt för oss att övervaka endogena mitophagy-komplex i mänskliga vävnader såsom betaceller, underlätta mitophagy forskning i pivotala translationally-relevanta vävnader. En fördel med denna teknik är dess förmåga att visualisera viktiga mitophagy komplex in vivo i vävnader med en sällsynt tillgänglighet eller i små provnummer. Efter isolering enligt standardprotokoll, kultur fyra till sex gånger 10 till den tredje mänskliga holme motsvarigheter i 10 milliliter av komplett bukspottskörteln holme medium för minst en dag vid 37 grader Celsius.Nästa dag, använd en dissekering ljusmikroskop vid en tre gånger förstoring för att räkna enskilda mänskliga holmar inom kulturen. Plocka 40 holmar per behandling eller tillstånd av intresse i 1,5 milliliter rör av holme medium. Sediment holmarna genom centrifugering och resuspend pelleten i en milliliter av PBS kompletterat med 50 mikromolar PR619.Invertera röret och samla in holmarna genom centrifugering för en andra tvätt i färsk PBS plus deubiquitinashämmare. Efter den andra centrifugeringen, separera holmarna i enstaka celler med 125 mikroliter på 0,25%trypsin plus-hämmare i tre minuter vid 37 grader Celsius med periodisk skonsam pipettering. I slutet av inkubationen, arrestera reaktionen med en milliliter av 37 grader Celsius värms bukspottskörteln holme medium kompletteras med PR619.Samla upp holmarna genom centrifugering för två tvättar i färsk PBS plus-hämmare per tvätt. Efter den andra tvätten, resuspend de dissociated holmarna i 150 mikroliter av färska PBS plus hämmare. För följsamhet och fixering av de enskilda holmarna, cytospin celllösningen på frostat laddade mikroskop diabilder och skissera cellområdet med en hydrofoba penna.Sedan fixera de inringade cellerna med 4%paraformaldehyd och PBS i 15 minuter vid rumstemperatur. För immunohistokemisk analys av holmeproverna, tvätta cellerna med två femminuterstvättar i PBS vid rumstemperatur, följt av icke-specifik bindningsblockering med 10%åsneserum och PBS plus 0,3%tvättmedel i en timme vid rumstemperatur. I slutet av den blockerande inkubationen, mynta cellerna med primär musantikropp mot ubiquitin-specifik peptidas 8, primär kaninantikropp mot neuregulinreceptornedbrytning protein-1, och en markör som är specifik för betacellsidentifiering som inte höjdes i mus eller kanin för att inte störa närhets-ligationssignalen över natten vid fyra grader Celsius.Nästa morgon, tvätta proverna med två fem minuters tvättar i PBS på en vipp. Lägg till anti-get Cy5 sekundär antikropp till en nyberedda närhets ligatur assay lösning. Efter den andra tvätten, märka varje holme prov med 20 mikroliter av sondlösning och återvinna diabilderna med plastfilm för en timmes inkubation vid 37 grader Celsius.Vid slutet av inkubationen tvättar du cellerna med två femminuterstvättar i buffert A på en vipp följt av inkubation med 20 mikroliter av nyberedd ligationslösning kompletterad med 0,25 enheter per mikroliter ligase per objektglas för en 30-minuters inkubation vid 37 grader Celsius. Vid slutet av ligeringen tvättar du cellerna två gånger med buffert A i två minuter per tvätt. Täck varje prov med 20 mikroliter av förstärkningslösningar kompletterade med polymeras för en 100-till 120-minuters inkubation vid 37 grader Celsius.För att förbereda cellerna för avbildning, tvätta proverna två gånger i färsk buffert A i 10 minuter per tvätt på en vipp följt av en tvätt i 0,1x buffert B i två minuter på vippen. Efter den sista tvätten, montera objektglasen med en droppe monteringsmedium som innehåller DAPI och placera försiktigt en täckbild över varje prov med hjälp av en skalpell för att trycka ut eventuella bubblor. Sedan förseglar du täcksliparna med klart nagellack runt kanterna.Om du vill avbilda proverna placerar du en bild på scenen i ett mikroskop som kan fånga flera fokalplan och välja 100 gångers förstoring. Ställ in Z-stackhöjden på ungefär 0,45 mikrometer och lämpliga fläck-, räknaren och livecellssignalexcitation och utsläppsparametrar. Få minst nio olika fokalplansbilder.För att säkerställa att fluorescens bildens bakgrundssignaler och ströljus minimeras, bearbeta bilderna utnyttja en tvådimensionell deconvolution närmaste granne algoritm med hjälp av en standard bildbehandling programvara val. För att kvantifiera närhetsaligeringsanalysinteraktionerna öppnar du ImageJ och öppnar analysen av proximity ligation. Med början från den första skarpt i fokus bilden, klicka på Bild och välj Justera och Tröskelvärde.Justera tröskeln för att ta bort alla de icke-specifika närhets ligatur assay signal och göra en anteckning om tröskeln justering för att försöka hålla signalen konsekvent hela analysen. Klicka på Process och välj Binärt och Gör binärt. Bekräfta att Storlek är inställd på noll till oändlighet, Cirkulärhet är inställd på noll till en, Visa är inställd på Konturer och markera Display resultat och Rensa resultat rutorna.Observera antalet partiklar som analyserats i ett kalkylblad som betecknar provet och Z-stackpositionen. Klicka sedan på Analysera och analysera partiklar för att mäta partiklarna. När alla i fokus Z-stackar för provet har analyserats, skicka det totala antalet partiklar för provet i kalkylbladet för att kvantifiera det totala antalet interaktioner.De antikroppar som används i närhetsanalysen är specifika för liganderna och visar inte på någon överlappning. Som observerats är dispersion protokollet mycket effektivt på att erhålla enstaka celler i mikroskopet synfält för nedströms analys och betacellen färgning behålls efter närhet ligering assay färgning i primära mänskliga holmar. Med hjälp av de påvisade teknikerna skulle man kunna fastställa att interaktionen mellan neuregulinreceptorns nedbrytningsprotein-1 och ubiquitinspecifik peptidas 8 minskas efter en 48-timmars exponering för palmitat, vilket belyser genomförbarheten av denna analys för bedömning av viktiga endogena mitofaginfaktorer efter diabetogena stimuli.En effektiv och skonsam spridning av mänskliga holmar är avgörande för att säkerställa kvantifiering av de korrekta cellpopulationerna nedströms. PLA möjliggör bedömning av viktiga mitophagy komplex i mänskliga holme prover möjliggör analys av mitophagy och biologiskt viktiga mänskliga patientprover flytta området diabetes forskning framåt.

Research

JoVE Journal

Medicine

Staining Protocols for Human Pancreatic Islets

Färgning Protokoll för mänskliga pankreatiska öar

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and ...

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Förbättrad Visualisering av lungmetastaser på Single Cell Upplösning i möss i Kombinerade<em&gt; In-situ</em&gt; Perfusion av lungvävnad och X-gal-färgning av<em&gt; LacZ</em&gt;-Taggade tumörceller

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells

Coculture Analys av extracellulärt protein interaktioner som kan påverka insulinutsöndringen från betacellerna i bukspottkörteln

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within ...

A Protocol for Genetic Induction and Visualization of Benign and Invasive Tumors in Cephalic Complexes of Drosophila melanogaster

A Protocol for Genetic Induction and Visualization of Benign and Invasive Tumors in Cephalic Complexes of Drosophila melanogaster

Ett protokoll för genetisk Induktion och visualisering av godartad och invasiva tumörer i Cephalic komplex av<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila has illuminated our  understanding of the genetic basis of normal development and disease for the  past several decades and today it continues ...

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Simula Pancreatic Neuroplasticity:<em&gt; In Vitro</em&gt; Dual-neuron Plasticity analys

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Multi-elektrod Array Inspelningar av Human Epileptic Postoperativ kortikalvävnad

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studera bukspottkörtelcancer Stem Cell egenskaper för att utveckla nya behandlingsstrategier

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Utarmning av musceller från humana tumörxenotransplantat avsevärt förbättrar Nedströms analys av målceller

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

In Vitro och In Vivo upptäckt av Mitophagy i mänskliga celler, C. Elegansoch möss

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

Application of End-to-end Anastomosis in Robotic Central Pancreatectomy

Tillämpningen av End-to-end anastomos i Robotic centrala Pancreatectomy

Central pancreatectomy is carried out for the treatment of benign or low-malignant potential tumors located in the pancreatic neck or proximal part of ...