Name: visualization of endogenous mitophagy complexes in situ in human pancreatic beta cells utilizing proximity ligation assay
Uploaded: 2019-05-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay at JoVE.com

Yazarlar JDRF (CDA-2016-189 ve SRA-2018-539), diyabet ve sindirim ve böbrek hastalıkları Ulusal Enstitüsü, Sağlık Ulusal Enstitüleri (R01-DK-108921), Brehm aile ve Anthony aile finansman desteği kabul eder. S.A.S. yılında JDRF kariyer geliştirme Ödülü, Novo Nordisk Vakfı tarafından desteklenen Danimarka diyabet Akademisi tarafından kısmen desteklenmektedir.

Bir kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) muafiyet ve Michigan Üniversitesi IRB politikası ile uyumlu olarak tanımlanabilen donör insan pankreatik adacıklar kullanımı ile. İnsan pankreatik adacıklar NIH/niddk destekli entegre Islet dağıtım programı (IIDP) tarafından sağlandı.
1. insan Islet numune hazırlama
<ol><li>
Tek hücreli ayrışma
	<ol>
<li>Kültür insan Islet örnekleri (4000 – 6000 Islet eşdeğerleri/10 ml medya) pankreas Islet medya (PIM (S)) medya ...

<ol>
	<li>Pearson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clec16a,+Nrdp1,+and+USP8+Form+a+Ubiquitin-Dependent+Tripartite+Complex+That+Regulates+beta-Cell+Mitophagy.">Clec16a, Nrdp1, and USP8 Form a Ubiquitin-Dependent Tripartite Complex That Regulates beta-Cell Mitophagy.</a> Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).</li><li>Soleimanpour, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diabetes+susceptibility+gene+Clec16a+regulates+mitophagy.">The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy.</a> Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).</li><li>Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+regulation+of+&#946;-cell+function:+Maintaining+the+momentum+for+insulin+release.">Mitochondrial regulation of &#946;-cell function: Maintaining the momentum for insulin release.</a> Molecular Aspects of Medicine. , (2015).</li><li>Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+by+mitophagy.">Regulation by mitophagy.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 53, 147-150 (2014).</li><li>Soleimanpour, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+Susceptibility+Genes+Pdx1+and+Clec16a+Function+in+a+Pathway+Regulating+Mitophagy+in+beta-Cells.">Diabetes Susceptibility Genes Pdx1 and Clec16a Function in a Pathway Regulating Mitophagy in beta-Cells.</a> Diabetes. 64 (10), 3475-3484 (2015).</li><li>Zhong, L., Tan, Y., Zhou, A., Yu, Q., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RING+Finger+Ubiquitin-Protein+Isopeptide+Ligase+Nrdp1/FLRF+Regulates+Parkin+Stability+and+Activity.">RING Finger Ubiquitin-Protein Isopeptide Ligase Nrdp1/FLRF Regulates Parkin Stability and Activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9425-9430 (2005).</li><li>Durcan, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=USP8+regulates+mitophagy+by+removing+K6-linked+ubiquitin+conjugates+from+parkin.">USP8 regulates mitophagy by removing K6-linked ubiquitin conjugates from parkin.</a> The EMBO Journal. 33 (21), 2473-2491 (2014).</li><li>Gauthier, T., Claude-Taupin, A., Delage-Mourroux, R., Boyer-Guittaut, M., Hervouet, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+Ligation+In+situ+Assay+is+a+Powerful+Tool+to+Monitor+Specific+ATG+Protein+Interactions+following+Autophagy+Induction.">Proximity Ligation In situ Assay is a Powerful Tool to Monitor Specific ATG Protein Interactions following Autophagy Induction.</a> PLoS ONE. 10 (6), e0128701 (2015).</li><li>Silva Xavier, D. a., G, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cells+of+the+Islets+of+Langerhans.">The Cells of the Islets of Langerhans.</a> Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54 (2018).</li><li>Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+islet+plasticity:+Interspecies+comparison+of+islet+architecture+and+composition.">Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition.</a> Islets. 2 (3), 135-145 (2010).</li><li>Cabrera, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unique+cytoarchitecture+of+human+pancreatic+islets+has+implications+for+islet+cell+function.">The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (7), 2334 (2006).</li><li>Brissova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Human+Pancreatic+Islet+Architecture+and+Composition+by+Laser+Scanning+Confocal+Microscopy.">Assessment of Human Pancreatic Islet Architecture and Composition by Laser Scanning Confocal Microscopy.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).</li><li>Babu, D. A., Deering, T. G., Mirmira, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+feat+of+metabolic+proportions:+Pdx1+orchestrates+islet+development+and+function+in+the+maintenance+of+glucose+homeostasis.">A feat of metabolic proportions: Pdx1 orchestrates islet development and function in the maintenance of glucose homeostasis.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 92 (1), 43-55 (2007).</li><li>Poitout, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucolipotoxicity+of+the+pancreatic+beta+cell.">Glucolipotoxicity of the pancreatic beta cell.</a> Biochimica Biophysica Acta. 1801 (3), 289-298 (2010).</li><li>Pearson, G., Soleimanpour, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ubiquitin-dependent+mitophagy+complex+maintains+mitochondrial+function+and+insulin+secretion+in+beta+cells.">A ubiquitin-dependent mitophagy complex maintains mitochondrial function and insulin secretion in beta cells.</a> Autophagy. 14 (7), 1160-1161 (2018).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomes+reveal+characteristic+features+of+human+pancreatic+islet+cell+types.">Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types.</a> EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).</li><li>DiGruccio, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+alpha,+beta+and+delta+cell+transcriptomes+reveal+that+ghrelin+selectively+activates+delta+cells+and+promotes+somatostatin+release+from+pancreatic+islets.">Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets.</a> Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).</li><li>Lawlor, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomes+identify+human+islet+cell+signatures+and+reveal+cell-type&#8211;specific+expression+changes+in+type+2+diabetes.">Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type&#8211;specific expression changes in type 2 diabetes.</a> Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).</li><li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+islets+contain+four+distinct+subtypes+of+&#946;+cells.">Human islets contain four distinct subtypes of &#946; cells.</a> Nature Communications. 7, 11756 (2016).</li><li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+major+pancreatic+cell+types+and+long-term+culture-initiating+cells+using+novel+human+surface+markers.">Isolation of major pancreatic cell types and long-term culture-initiating cells using novel human surface markers.</a> Stem Cell Research. 1 (3), 183-194 (2008).</li><li>Jayaraman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+detection+of+viable+human+pancreatic+beta+cells+by+flow+cytometry+using+fluorophores+that+selectively+detect+labile+zinc,+mitochondrial+membrane+potential+and+protein+thiols.">A novel method for the detection of viable human pancreatic beta cells by flow cytometry using fluorophores that selectively detect labile zinc, mitochondrial membrane potential and protein thiols.</a> Cytometry Part A. 73 (7), 615-625 (2008).</li><li>Arda, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Dependent+Pancreatic+Gene+Regulation+Reveals+Mechanisms+Governing+Human+&#223;-Cell+Function.">Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human &#223;-Cell Function.</a> Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).</li><li>Allen, G. F. G., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+iron+triggers+PINK1/Parkin-independent+mitophagy.">Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy.</a> EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).</li><li>Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. -. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+Parkin+Zone:+Mitophagy+without+Parkin.">No Parkin Zone: Mitophagy without Parkin.</a> Trends in Cell Biology. , (2018).</li></ol>

Burada kullanmak için basit ve verimli bir yaklaşım açıklamak NRDP1: USP8 PLA dokularda/ilgi hücreleri upstream mitophagy kompleksleri oluşumunu ölçmek için. Daha önce çeşitli metodolojiler tarafından pankreas Beta hücrelerinde CLEC16A-NRDP1-USP8 mitophagy kompleksi oluşumunu teyit, Co-immünoprecipitation deneyler de dahil olmak üzere, hücre-serbest etkileşim çalışmaları, ve in vitro yanı sıra hücre tabanlı mayası, ve nasıl bu kompleks sürücüler mitophagic Flux düzenlendiği gösterilmi?...

Pankreas Beta hücreleri normal glikoz homeostaz korumak için gerekli insülin üretmek, ve diyabet her türlü gelişiminde onların başarısızlık sonuçları. Beta hücreleri insülin salınımı ile çift glikoz metabolizması için gerekli enerjiyi üretmek için sağlam bir mitokondriyal kapasiteyi korur. Son zamanlarda, fonksiyonel mitokondriyal kütle Bakımı optimum beta hücre fonksiyonu1,2,3için önemli öneme sahip olduğu belirgin hale gelmiştir. Fonksiyonel mitokondriyal kütlesini sürdürmek için, Beta hücreleri disfonksiyonel, hasarlı veya yaşlanma mitokondri4kaldırmak için kalite kontrol mekanizmaları güveniyor. Biz ve diğerleri daha önce beta hücrelerinin mitokondriyal cirosunun özel bir formu, mitokondriyal otophagy (veya mitophagy) denilen, hem kemirgen ve insan adacıklar1 mitokondriyal kalite kontrolünü korumak için güvenmektedir göstermiştir 2,5. Ne yazık ki, ancak, mitophagy tespit etmek için basit bir yöntem yoktu, ya da Endogenously mitophagy bileşenleri ifade, insan pankreas Beta hücrelerinde.
Geçenlerde Beta hücrelerinde mitophagy upstream yönetmelik E3 Ligas CLEC16A ve NRDP1 ve deubiquitinase USP81oluşan bir protein kompleksi oluşumuna dayanır göstermiştir. NRDP1 ve USP8 bağımsız olarak mitophagy anahtar mitophagy Başlatıcı Parkin üzerinde eylem yoluyla etkilemek için gösterildi6,7. NRDP1 mitophagy kapalı kapatmak için mayası ve bozulma için Parkin hedefler6, ve USP8 özellikle mitokondri7için translokasyon tanıtmak için K6 bağlantılı Parkin deubiquitinates. Proximity ligasyon Assay (PLA) teknolojisi, protein etkileşimi biyoloji8alanında yeni bir avans olmuştur, tek hücrelerde situ içinde endojen protein etkileşimleri görselleştirme izin, ve az örnek malzeme ile sınırlı değildir. Bu metodoloji özellikle insan islet/Beta hücresi biyolojisi için, örnek mevcudiyeti, heterojen hücre türleri içinde fizyolojik olarak ilgili protein kompleksler anlamak için ihtiyaç ile birleştiğinde için cazip.
PLA yaklaşımı kullanarak, birincil insan pankreatik Beta hücrelerinde ve nöronal hücre hatlarında anahtar endojen mitophagy kompleksleri gözlemlemek edebiliyoruz, ve mitophagy yolu üzerinde bir diyabet hastalığı etkilerini göstermek1. Özetle, bu protokolün kapsamlı hedefi, bol miktarda malzeme bulunmayan dokulardaki belirli mitophagy protein kompleksini analiz etmektir veya konvansiyonel protein etkileşimi çalışmalarının mümkün olmadığı bir yerdir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA 1X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Block solution</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>Use 1X PBS, add 10 % donkey serum, and 0.3% Triton X-100 detergent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer A</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>To make 1L: Mix 8.8g NaCl, 1.2g Tris base, 500ul Tween-20, with 750mL ddH20. pH to 7.5 with HCl, and fill to 1L. Filter solution and store at 4C. Bring to RT before experimental use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer B</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>To make 1L: Mix 5.84g NaCl, 4.24g Tris base, 26g Tris-HCl with 500mL ddH20. pH to 7.5, and fill to 1L. Filter solution and store a 4C. Bring to RT before experimental use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5-conjugated AffiniPure donkey anti-goat</td>
			<td>Jackson Labs</td>
			<td>705-175-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detection Reagents Red</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>DU092008-100RXN</td>
			<td>Kit containing: ligation solution stock (5X), ligase, amplification solution stock (5X) and polymerase.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink PLA probe anti-mouse MINUS</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>DU092004-100RXN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink PLA probe anti-rabbit PLUS</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>DU092002-100RXN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polyclonal anti-PDX1 (clone A17)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-14664</td>
			<td>RRID: AB_2162373</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIN6 pancreatic cell line</td>
			<td>Gift from D. Stoffers</td>
			<td></td>
			<td>Mouse insulinoma cell line, utilized for cell-based assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-USP8 antibody (clone US872)</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>SAB200527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pap-pen</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>195505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use to seal antibody and probe solutions on your cells to prevent evaporation when using small solution volumes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBT (phosphate buffered saline with triton)</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>To make 50mL: 43.5mLddH2O, 5mL 10X PBS, 0.5mL 10X BSA(100mg/mL solution), 1mL 10% triton X-100 solution in ddH20)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 10X</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIM(ABS) Human AB serum</td>
			<td>Prodo Labs</td>
			<td>PIM-ABS001GMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIM(G) (glutamine)</td>
			<td>Prodo Labs</td>
			<td>PIM-G001GMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIM(S) media</td>
			<td>Prodo Labs</td>
			<td>PIM-S001GMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PR619</td>
			<td>Apex Bio</td>
			<td>A812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td>Life Technologies (Molecular Probes)</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal anti-FLRF/RNF41 (Nrdp1)</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>A300-049A</td>
			<td>RRID: AB_2181251</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y cells</td>
			<td>Gift from L. Satin</td>
			<td></td>
			<td>Human neuroblastoma cell line, utilized for cell-based assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water for RNA work (DEPC water)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP361-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of endogenous mitophagy complexes in situ in human pancreatic beta cells utilizing proximity ligation assay

Mitofajit, glukoz stimüle edilen insülin salınımı için pankreas Islet Beta hücresi Biyoenerji için önemli olan temel bir mitokondriyal kalite kontrol yoludur. Mitophagy değerlendirilmesi zordur ve genellikle genetik gazetecilere veya primer insan pankreatik izletleri gibi doku örneklerinde kolayca kullanılabilen çoklu tamamlayıcı teknikler gerektirir. Burada, primer insan pankreatik izletlerinde anahtar endojen mitophagy kompleksleri görselleştirilmesi ve ölçülmesine yönelik güçlü bir yaklaşım gösteriyoruz. Hassas yakınlık ligasyon assay tekniği kullanarak mitophagy regülatörleri NRDP1 ve USP8 etkileşimi algılamak için, özellikle situ içinde temel mitofajit kompleksleri oluşumunu ölçmek edebiliyoruz. PDX1 transkripsiyon faktörü için bu yaklaşımı kullanarak, biz mitophagy kompleksleri ve özellikle Beta hücreleri içinde mitophagy zarar verebilir faktörleri ölçmek olabilir. Tarif ettiğimiz metodoloji, immünopresipitasyon (IP) veya kütle spektrometresi gibi diğer protein-protein etkileşimi çalışmaları için gerekli olan büyük miktarlarda hücresel ekstraktlara ihtiyacı üstesinden gelir ve genellikle değerli insan Islet örnekleri için idealdir Bu yaklaşımlar için yeterli miktarlarda kullanılabilir. Ayrıca, Bu metodoloji akış ayıklama teknikleri, aşağı protein uygulamaları için heterojen bir Islet nüfusu beta hücrelerini arındırmak için ihtiyaç ortadan kaldırır. Böylece, heterojen ve sınırlı hücre nüfuslarında kullanmak için son derece uyumlu mitofajit görselleştirme için değerli bir protokol açıklanmaktadır.

Biz MIN6 pankreas beta hücre hattı ve SH-SY5Y Nöroblastom hücre hattı SH-SY5Y, optimize etmek ve hem de antikorların özgüllüğü ve görselleştirilmiş protein etkileşimlerini onaylamak için ilk deneyler gerçekleştirdi. MIN6 hücreler/mL ve 48 h için sığmasını sol, SH-SY5Y hücreleri 30.000 ' de Cover, üzerinde kaplama vardı/mL ve 24 h için sığmasını sol 15.000 Cover, üzerine kaplama edildi. PLA Protokolü sonra yukarıdaki gibi, adım 1.2.3 başlayarak izledi. ...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay at JoVE.com

Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

Yakınlık ligasyon assay kullanarak ınsan pankreatik Beta hücrelerinde situ Içinde endojen Mitophagy kompleksleri görselleştirme

Bu protokol, özellikle primer insan Islet örneklerinden Beta hücrelerinde mitofagoy protein kompleksi oluşumunun nicel analizi için bir yöntem özetliyor. Bu teknik, değerli insan pankreatik beta hücre örneklerinde önemli olan sınırlı biyolojik materyalden mitophaginin analizini sağlar.

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...

Bu protokol bize beta hücreleri gibi insan dokularında endojen mitophagi kompleksleri izlemek için izin verir, önemli çeviri ile ilgili dokularda mitophagy araştırma kolaylaştırmak. Bu tekniğin bir avantajı nadir bir kullanılabilirlik veya küçük örnek numaraları ile dokularda vivo önemli mitophagy kompleksleri görselleştirmek için yeteneğidir. Standart protokollere göre izolasyon sonra, kültür 4-6 kez 10 üçüncü insan adacık eşdeğerleri tam pankreas adacık orta 10 mililitre en az bir gün için 37 santigrat derece.Ertesi gün, kültür içinde tek tek insan adacıkları saymak için üç kat büyütme bir diseksiyon ışık mikroskobu kullanın. 1,5 mililitrelik adacık tüpüne tedavi başına 40 adacık veya ilgi durumu seçin. Adacıkları santrifüj ile tortulandırın ve 50 mikromolar PR619 ile desteklenen bir mililitre PBS'de peleti yeniden askıya alın.Tüp ters ve taze PBS artı deubiquitinaz inhibitörü ikinci bir yıkama için santrifüj tarafından adacıkları toplamak. İkinci santrifüjden sonra, adacıkları 125 mikrolitre 0,25 tripsin artı inhibitörle 37 derecede üç dakika boyunca periyodik olarak nazik pipetleme ile tek hücrelere ayırın. Kuluçka sonunda, 37 derece santigrat bir mililitre ile reaksiyon tutuklama PR619 ile desteklenen pankreas adacık orta ısıtılmış.Taze PBS artı yıkama başına inhibitör iki yıkar için santrifüj tarafından adacıkları toplayın. İkinci yıkamadan sonra, taze PBS artı inhibitör 150 mikrolitre ayrıştırılmış adacıklar resuspend. Bireysel adacıkların yapışması ve fiksasyonu için, hücre çözeltisini buzlu yüklü mikroskop slaytlarına sitedin ve hücresel alanı hidrofobik kalemle ana hatlayın.Daha sonra oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ve PBS ile kuşatılmış hücreleri düzeltin. Adacık örneklerinin immünohistokimyasal analizi için hücreleri PBS'de iki beş dakikalık yıkama ile oda sıcaklığında yıkayın ve ardından %10 eşek serumu ve PBS ile spesifik olmayan bağlama engellemesi ve %0,3 deterjan oda sıcaklığında bir saat boyunca. Engelleme kuluçka sonunda, ubikitin özgü peptidaz karşı birincil fare antikor ile hücreleri coincubate 8, neuregulin reseptör yıkım protein-1 karşı birincil tavşan antikor, ve fare veya tavşan yükseltilmiş değildi beta hücre tanımlaması için özel bir marker böylece dört derece santigrat gecede yakınlık ligasyon test sinyali ile müdahale değil.Ertesi sabah, bir rocker üzerinde PBS iki beş dakikalık yıkar ile örnekleri yıkayın. Taze hazırlanmış yakınlık ligasyon hesaplama çözeltisine anti-keçi Cy5 ikincil antikor ekleyin. İkinci yıkamadan sonra, her adacık örneğini 20 mikrolitre prob çözeltisi ile etiketlendirin ve slaytları 37 santigrat derecede bir saatlik kuluçka için plastik filmle geri alın.Kuluçka sonunda, 37 santigrat derece bir 30 dakikalık kuluçka için slayt başına ligaz mikrolitre başına 0,25 adet ile takviye taze hazırlanmış ligasyon çözeltisi 20 mikrolitre ile kuluçka takip bir rocker üzerinde tampon A iki beş dakikalık yıkar ile hücreleri yıkayın. Ligasyonun sonunda, hücreleri yıkama başına iki dakika arabellek A ile iki kez yıkayın. Her numuneyi 37 santigrat derecede 100 ila 120 dakikalık bir kuluçka için polimeraz ile desteklenen 20 mikrolitre amplifikasyon çözeltisi ile kaplayın.Hücreleri görüntülemeye hazırlamak için, numuneleri taze tampon A'da iki kez bir rocker üzerinde yıkama başına 10 dakika yıkayın ve ardından 0,1x tampon B'de iki dakika boyunca bir yıkama. Son yıkamadan sonra, dapi içeren montaj ortamı bir damla ile slaytlar monte ve dikkatlice herhangi bir kabarcıklar dışarı basın için bir neşter kullanarak her örnek üzerinde bir coverslip yerleştirin. Sonra kenarlarında net oje ile kapakları mühür.Örnekleri görüntülemek için, birden çok odak düzlemini yakalayabilen bir mikroskopun sahnesine bir slayt yerleştirin ve 100 kez büyütmeyi seçin. Z-stack yüksekliğini yaklaşık 0,45 mikrometreye ve uygun leke, karşı leke ve canlı hücre sinyal uyarma ve emisyon parametrelerine ayarlayın. En az dokuz farklı odak düzlemi görüntüsü elde edin.Floresan görüntü arka plan sinyallerinin ve başıboş ışığın en aza indirilmesini sağlamak için, tercih edilen standart bir görüntü işleme yazılımı kullanarak iki boyutlu deconvolution en yakın komşu algoritması kullanarak görüntüleri işleyin. Yakınlık ligasyon testi etkileşimlerini ölçmek için ImageJ'i açın ve yakınlık ligasyon testi görüntüsünü açın. İlk keskin odak lama görüntüsünden başlayarak Görüntü'ye tıklayın ve Ayarla ve Eşik'i seçin.Spesifik olmayan yakınlık ligasyon tahlil sinyalini kaldırmak için eşiği ayarlayın ve analiz boyunca sinyali tutarlı tutmaya çalışmak için eşik ayarı notunu yapın. İşlem'i tıklatın ve İkili'yi seçin ve İkili'yi Yapın. Boyutun sıfırdan sonsuza kadar ayarlandığını, Daireselliğin sıfırdan bire ayarlı olduğunu, Göster'in Anahatlara ayarlı olduğunu ve Ekran sonuçlarını ve netsonuçları kutularını denetlediğini doğrulayın.Örnek ve Z-yığın konumunu gösteren bir elektronik tabloda çözümlenen parçacıkların sayısını not edin. Ardından parçacıkları ölçmek için Parçacıkları Analiz Et ve Analiz Et'i tıklatın. Örnek için tüm odak içi Z-yığınları analiz edildiğinde, toplam etkileşim sayısını ölçmek için elektronik tablodaki örnek için toplam parçacık sayısını gönderin.Yakınlık telinde kullanılan antikorlar ligandlara özgür ve herhangi bir çakışma göstermezler. Gözlemlendiği gibi, dağılım protokolü aşağı akım analizi için mikroskop alanında tek hücre elde etmede son derece etkilidir ve beta hücre boyama birincil insan adacıklarında yakınlık ligasyon tahlil boyama sonrasında korunur. Gösterilen teknikler kullanılarak, neuregulin reseptör yıkım protein-1 ve ubikitin spesifik peptidaz etkileşiminin palmitata 48 saatlik maruziyetsonrasında azaldığı saptanarak, diabetojenik uyaranları takiben önemli endojen mitophagi faktörlerinin değerlendirilmesi için bu talın fizibilitesinin vurgulandığı saptanabilir.İnsan adacıklarının verimli ve nazik bir şekilde dağılması, doğru hücre popülasyonlarının aşağıya doğru sayısallaştırılmasını sağlamak için gereklidir. PLA, insan adacık örneklerindeki önemli mitophagi komplekslerinin değerlendirilmesine olanak sağlayarak diyabet araştırma alanını ileriye taşıyan mitophagy ve biyolojik olarak önemli insan hasta örneklerinin analizini sağlar.

Research

JoVE Journal

Medicine

Staining Protocols for Human Pancreatic Islets

İnsan Pankreas Adacıklar için boyama Protokoller

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and ...

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Kombine tarafından Farelerde Tek Hücre çözünürlükte Akciğer Metastaz Geliştirilmiş Görselleştirme<em&gt; In-situ</emAkciğer Doku ve X-Gal Boyanma&gt; Perfüzyon<em&gt; LacZ</em&gt;-Tagged Tümör Hücreleri

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells

Pankreas Beta Hücreleri ile insülin salgılanması Etkileyen Ekstrasellüler Protein etkileşimleri kokültürü Analizi

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within ...

A Protocol for Genetic Induction and Visualization of Benign and Invasive Tumors in Cephalic Complexes of Drosophila melanogaster

A Protocol for Genetic Induction and Visualization of Benign and Invasive Tumors in Cephalic Complexes of Drosophila melanogaster

Arasında Cephalic Kompleksi Genetik İndüksiyon ve Benign ve İnvaziv vizüalizasyonun için Protokol<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila has illuminated our  understanding of the genetic basis of normal development and disease for the  past several decades and today it continues ...

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Pankreas Nöroplastisite benzetme:<em&gt; In Vitro</em&gt; Dual-nöron Plastisitesi Deneyi

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

İnsan Epileptik Ameliyat sonrası Kortikal Doku Çok elektrot Dizi Kayıtlar

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pankreas Kanseri Yeni Tedavi Stratejileri Geliştirme Hücre Özellikleri Kök incelenmesi

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

İnsan Tümör ksenogratflarının gelen Fare Hücrelerinin tükenmesi Anlamlı Hedef Hücre Alt Analizi geliştirir

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Vitro ve In Vivo insan hücreleri, C. Elegansve fareler Mitophagy tespiti

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

Application of End-to-end Anastomosis in Robotic Central Pancreatectomy

Uçtan uca anastomoz Robotik Merkezi Pancreatectomy içinde uygulanması

Central pancreatectomy is carried out for the treatment of benign or low-malignant potential tumors located in the pancreatic neck or proximal part of ...