Name: opsonophagocytic killing assay to assess immunological responses against bacterial pathogens
Uploaded: 2019-04-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens at JoVE.com

ونحن نشكر الدكتور القمر Nahm (جامعة ألاباما في برمنغهام) له مساعدة لا تقدر بثمن في إنشاء أوبكا فحوصات في المختبر. وأيد هذا العمل "المعاهد الوطنية للصحة منحة" 1R01AI123383-01A1 إلى فيا.

1-الثقافة، والتمايز، والتحقق من صحة الخلايا HL-60

<ol><li>إعداد HL-60 الخلايا ثقافة وسائل الإعلام مؤلفة من 500 مل ربمي مع الجلوتامين لام و 50 مل إبطال الحرارة الجنيني البقري المصل. لا تقم بإضافة المضادات الحيوية كما قد يؤثر هذا على التفريق بين الخلايا HL-60.</li>
	<li>لنشر وصيانة HL-60 الخلايا، تنفيس الث?...

<ol>
	<li>Romero-Steiner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+an+opsonophagocytic+assay+for+the+measurement+of+functional+antibody+activity+against+Streptococcus+pneumoniae+using+differentiated+HL-60+cells.">Standardization of an opsonophagocytic assay for the measurement of functional antibody activity against Streptococcus pneumoniae using differentiated HL-60 cells.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 4 (4), 415-422 (1997).</li><li>Nanra, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsular+polysaccharides+are+an+important+immune+evasion+mechanism+for+Staphylococcus+aureus.">Capsular polysaccharides are an important immune evasion mechanism for Staphylococcus aureus.</a> Human Vaccines and Immunotherapeutics. 9 (3), 480-487 (2013).</li><li>Ishibashi, K., Yamaguchi, O., Shiraiwa, Y., Ogihara, M., Shigeta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+therapy+of+Pseudomonas+aeruginosa+pyelonephritis+in+neutropenic+mice+with+human+antilipopolysaccharide+monoclonal+antibody+and+cefsulodin.">Combination therapy of Pseudomonas aeruginosa pyelonephritis in neutropenic mice with human antilipopolysaccharide monoclonal antibody and cefsulodin.</a> Journal of Urology. 155 (6), 2094-2097 (1996).</li><li>Middleton, D. R., Paschall, A. V., Duke, J. A., Avci, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+Hydrolysis+of+Pneumococcal+Capsular+Polysaccharide+Renders+the+Bacterium+Vulnerable+to+Host+Defense.">Enzymatic Hydrolysis of Pneumococcal Capsular Polysaccharide Renders the Bacterium Vulnerable to Host Defense.</a> Infection and Immunity. , (2018).</li><li>Baker, C. J., Noya, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+use+of+intravenous+immune+globulin+for+group+B+streptococcal+infection.">Potential use of intravenous immune globulin for group B streptococcal infection.</a> Reviews of Infectious Diseases. 12, 476-482 (1990).</li><li>Tian, H., Weber, S., Thorkildson, P., Kozel, T. R., Pirofski, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+opsonic+and+nonopsonic+serotype+3+pneumococcal+capsular+polysaccharide-specific+monoclonal+antibodies+against+intranasal+challenge+with+Streptococcus+pneumoniae+in+mice.">Efficacy of opsonic and nonopsonic serotype 3 pneumococcal capsular polysaccharide-specific monoclonal antibodies against intranasal challenge with Streptococcus pneumoniae in mice.</a> Infection and Immunity. 77 (4), 1502-1513 (2009).</li><li>Parameswarappa, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Semi-synthetic+Oligosaccharide+Conjugate+Vaccine+Candidate+Confers+Protection+against+Streptococcus+pneumoniae+Serotype+3+Infection.">A Semi-synthetic Oligosaccharide Conjugate Vaccine Candidate Confers Protection against Streptococcus pneumoniae Serotype 3 Infection.</a> Cell Chemical Biology. 23 (11), 1407-1416 (2016).</li><li>Jackson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomized+clinical+trial+of+a+single+versus+a+double+dose+of+13-valent+pneumococcal+conjugate+vaccine+in+adults+55+through+74+years+of+age+previously+vaccinated+with+23-valent+pneumococcal+polysaccharide+vaccine.">Randomized clinical trial of a single versus a double dose of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in adults 55 through 74 years of age previously vaccinated with 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine.</a> Vaccine. 36 (5), 606-614 (2018).</li><li>Cywes-Bentley, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+to+a+conserved+antigenic+target+is+protective+against+diverse+prokaryotic+and+eukaryotic+pathogens.">Antibody to a conserved antigenic target is protective against diverse prokaryotic and eukaryotic pathogens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (24), 2209-2218 (2013).</li><li>Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+HL-60+cell+line+to+measure+opsonic+capacity+of+pneumococcal+antibodies.">Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).</li><li>Collins, S. J., Ruscetti, F. W., Gallagher, R. E., Gallo, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+differentiation+of+human+promyelocytic+leukemia+cells+induced+by+dimethyl+sulfoxide+and+other+polar+compounds.">Terminal differentiation of human promyelocytic leukemia cells induced by dimethyl sulfoxide and other polar compounds.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 75 (5), 2458-2462 (1978).</li><li>Melnick, N., Rajam, G., Carlone, G. M., Sampson, J. S., Ades, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+novel+therapeutic+approach+to+treating+severe+pneumococcal+infection+using+a+mouse+model.">Evaluation of a novel therapeutic approach to treating severe pneumococcal infection using a mouse model.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 16 (6), 806-810 (2009).</li><li>Dwyer, M., Gadjeva, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opsonophagocytic+assay.">Opsonophagocytic assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1100, 373-379 (2014).</li><li>Burton, R. L., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+fourfold+multiplexed+opsonophagocytosis+assay+for+pneumococcal+antibodies+against+additional+serotypes+and+discovery+of+serological+subtypes+in+Streptococcus+pneumoniae+serotype+20.">Development of a fourfold multiplexed opsonophagocytosis assay for pneumococcal antibodies against additional serotypes and discovery of serological subtypes in Streptococcus pneumoniae serotype 20.</a> Clinical and Vaccine Immunololgy. 19 (6), 835-841 (2012).</li><li>Clarke, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-cost,+high-throughput,+automated+counting+of+bacterial+colonies.">Low-cost, high-throughput, automated counting of bacterial colonies.</a> Cytometry Part A. 77 (8), 790-797 (2010).</li><li>Aanei, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Database-guided+Flow-cytometry+for+Evaluation+of+Bone+Marrow+Myeloid+Cell+Maturation.">Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e57867 (2018).</li><li>Hirz, T., Dumontet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Isolation+and+Analysis+to+Determine+their+Role+in+Lymphoma+Cell+Sensitivity+to+Therapeutic+Agents.">Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents.</a> Journal of Visulaized Experiments. (109), e53846 (2016).</li><li>Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+annexin+V/propidium+iodide+apoptosis+assay+for+accurate+assessment+of+cell+death.">Modified annexin V/propidium iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), 2597 (2011).</li><li>Blair, O. C., Carbone, R., Sartorelli, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+HL-60+promyelocytic+leukemia+cells:+simultaneous+determination+of+phagocytic+activity+and+cell+cycle+distribution+by+flow+cytometry.">Differentiation of HL-60 promyelocytic leukemia cells: simultaneous determination of phagocytic activity and cell cycle distribution by flow cytometry.</a> Cytometry. 7 (2), 171-177 (1986).</li><li>Middleton, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+the+Streptococcus+pneumoniae+type+3+capsule-specific+glycoside+hydrolase+of+Paenibacillus+species+32352.">Identification and characterization of the Streptococcus pneumoniae type 3 capsule-specific glycoside hydrolase of Paenibacillus species 32352.</a> Glycobiology. 28 (2), 90-99 (2018).</li></ol>

أوبكاس تخدم أدوار أساسية في تقييم الاستجابات المناعية الأجسام المضادة بوساطة الناجمة عن التطعيم6،8. المغزى الرئيسي لهذه أوبكا مبسطة هو قدرة على التكيف في الظروف لفحصها (أي الأجسام المضادة، والعلاجات إنزيم، إلخ.). وبهذا المعني، بينما يمكن استخدام هذا التحلي...

أوبسونوفاجوسيتيك مما أسفر عن مصرع الإنزيم (أوبكا) أداة حاسمة لربط التعديلات في هيكل البكتيرية أو دالة للتغيرات اللاحقة في الاستجابة المناعية والدالة. على هذا النحو، فإنه كثيرا ما يستخدم كتحليل تكميلي لتحديد فعالية العلاجات جسم، المرشحين اللقاح، إنزيم الأمثل، إلخ المستندة إلى جهاز المناعة. حين المجراة في فحوصات ضرورية لتحديد فعالية التخليص أو الحماية في نموذج عدوى بكتيرية، أوبكا يمكن أن تستخدم لتقييم مساهمة محصنة إلى موت الخلايا البكتيرية المكونات الأساسية في معظم: البكتيريا والخلايا المناعية، والتجريبية العلاجات. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن أوبكاس يمكن تعديلها واستخدامها لمجموعة متنوعة من البكتيريا واللقاح، بما في ذلك العقدية الرئوية1،2من المكوّرات العنقودية الذهبية، الزائفة الزّنجاريّة3. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام هذه الاختبارات الأمثل لتقييم علاجات تجريبية مختلفة، بما في ذلك قدرة إنزيم جعل البكتيريا أكثر يسرا لتكملة بوساطة الخلايا المناعية4 وجسم علاجات لتحسين أوبسونيزاتيون5. كلاسيكي، الإنزيم أوبكا وقد استخدمت بنجاح في مجال البحوث الأساسية والسريرية الناجمة عن الإعدادات كمؤشر قوي لحماية الأجسام المضادة الخاصة بالعوامل الممرضة6،،من78،9 .
يمكن استخدام أنواع مختلفة من الخلايا المناعية للتقييم لقتل أوبسونوفاجوسيتيك. أحد السكان متجولة استخداماً هو خط الخلية ليوكيميك البشرية HL-60. يمكن الاحتفاظ بهذا الخط خلية بروميلوسيتيس المعطل في الثقافة؛ ومع ذلك، يمكن أن تكون متباينة في مختلف الدول المنشط عن طريق المخدرات مختلف العلاجات10،11. علاج HL60 مع N، N-ديميثيلفورماميدي يميز خط الخلية في العَدلات مفعّلة مع النشاط متجولة قوية11. حين يكون قد تم تحسين HL-60 الخلايا وتستخدم بشكل متكرر لهذه الاختبارات البلعمه10، يمكن استخدام أخرى الكريات البيض النوى الأولية كذراع محصنة من التجربة12.
بالإضافة إلى ذلك، هذه فحوصات يمكن أن تكون مبسطة13 أو14 إلقاء نظرة على السلالات المقاومة للمضادات الحيوية متعددة من البكتيريا لاختبار متعدد. الأسلوب متعدد أحرز أكثر جدوى من خلال تطوير البرمجيات التي يمكن عد كفاءة مستعمرة بكتيرية تشكيل وحدات (كفوس) كل بقعة على لوحة أجار15. وهنا يصف لنا طريقة مبسطة باستخدام سلالة بكتيرية واحدة HL-60 الخلايا، وتكملة الأرنب الرضيع ولوحات أجار الدم. باستخدام هذا الأسلوب، يمكن تقييم علاجات متعددة بسرعة لمعالجة مسائل بحثية محددة حول كيف يمكن أن يكون التضمين الاستجابة المناعية الفطرية للعدوى البكتيرية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:636px;" width="637">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Annexin V (APC conjugated)</td>
			<td style="width:147px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">640919</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">anti-CD35, human (PE conjugated)</td>
			<td style="width:147px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">333405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">anti-CD71, human (PE conjugated)</td>
			<td style="width:147px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">334105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:204px;">bacterial strain to be used (ie, Streptococcus pneumoniae, WU2)</td>
			<td style="width:147px;">Bacterial Respiratory Reference Laboratory (Dr. Moon Nahm)&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">blood agar plates</td>
			<td>Hardy Diagnostic</td>
			<td>A10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Fetal Clone serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30080.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9012-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">HL-60 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">IgG Isotype Control (PE conjugated)</td>
			<td style="width:147px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">400907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">N,N-dimethylformamide (DMF)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>UN2265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">propidium iodide</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">RPMI media with L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

opsonophagocytic killing assay to assess immunological responses against bacterial pathogens

أحد جوانب رئيسية للاستجابة المناعية للاستعمار الجرثومي للمضيف هو البلعمه. مقايسة قتل أوبسونوفاجوسيتيك (أوبكا) هو إجراء تجريبية التي خلايا متجولة مثقف يشترك مع وحدات البكتيرية. وسوف phagocytose الخلايا المناعية وقتل الثقافات البكتيرية بطريقة تعتمد على تكملة. كفاءة قتل الخلايا المناعية بوساطة يعتمد على عدد من العوامل، ويمكن استخدامها لتحديد البكتيريا المختلفة كيفية مقارنة الثقافات فيما يتعلق بالمقاومة لموت الخلايا. وبهذه الطريقة، يمكن تقييم فعالية العلاجات المحتملة المستندة إلى المناعة ضد السلالات البكتيرية محددة و/أو اللقاح. في هذا البروتوكول، يصف لنا أوبكا مبسطة التي تستخدم شروط الثقافة الأساسية وخلية العد لتحديد صلاحية الخلايا البكتيرية بعد ثقافة المشارك مع ظروف العلاج و HL-60 الخلايا المناعية. وقد استخدمت هذه الطريقة بنجاح مع عدد من اللقاح المكوّرات الرئوية مختلفة، الحافظة وسلالات أكابسولار، وغيرها من الأنواع البكتيرية. مزايا هذا البروتوكول أوبكا هي بساطته، براعة (كما لا يقتصر هذا الفحص على العلاجات جسم أوبسونينس)، والتقليل إلى أدنى حد من الوقت والمواد الكاشفة لتقييم المجموعات التجريبية الأساسية.

وينبغي أن يكون إجراء التحقق من صحة التمايز HL-60 قبل البدء في أوبكا. هذا أن يمكن إنجاز باستخدام التدفق الخلوي لتحديد التعبير خارج الخلية CD11b، CD35، CD71، والخامس أنيكسين (الشكل 1). يمكن أيضا استخدام يوديد Propidium كعلامة سلامة. بعد أن تلقي علاجاً مع DMF لمدة 3 أيام، وينبغي زيادة التعبير ?...

Watch this Scientific Journal Video about Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens at JoVE.com

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

هذا الإنزيم قتل أوبسونوفاجوسيتيك يستخدم لمقارنة قدرة الخلايا المناعية متجولة التجاوب وتقتل البكتيريا التي تستند إلى معالجات مختلفة و/أو شروط. كلاسيكي، هذا التحليل بمثابة المعيار الذهبي لتقييم الوظائف المستجيب للأجسام المضادة التي أثيرت ضد بكتيريا طاهية.

أوبسونوفاجوسيتيك قتل المقايسة لتقييم الاستجابات المناعية ضد مسببات الأمراض البكتيرية

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

هذا الفحص يربط تعديل بنية البكتيريا وظيفة إلى الخلايا المناعية القائمة على النشاط المضاد للبكتيريا. وعلى هذا النحو، يمكن تقييم علاج مناعي رئيسي للعلاج المحتمل في تحديد احتمال تحسين إزالة البكتيريا. يستخدم مقايسة القتل Opsonophagocytic تقليديا كمعيار ذهبي لتقييم الوظائف الفعالة للأجسام المضادة التي يتم رفعها ضد البكتيريا باعتبارها مُعَدَّة.هذا البروتوكول يوفر البساطة وبراعة أكثر من القائمة عالية الإنتاجية موحدة المقايسة. في هذا البروتوكول ، نتحقق من آثار العلاج من المخدرات على الالتهاب الرئوي العقدي وكيف تترجم هذه الآثار إلى تحسين البلعميات من البكتيريا. هنا، ونحن تطبيق OPKA على الخلايا الالتهاب الرئوي العقدية.ومع ذلك يمكن اعتماد هذا البروتوكول لتقييم القتل البلعومي لمسببات الأمراض الأخرى من قبل الخلايا المناعية. خصص الوقت لتحسين المخزونات البكتيرية وضمان أن تكون وحدات CFUs النهائية التي سيتم عدها تقع ضمن النطاق الأمثل. نوصي بشدة باستخدام عملية استئصال الخلايا التدفق لضمان خلايا HL60 قابلة للحياة ونشطة وتحاول ظروف ثقافة مختلفة لضمان الخلايا النشطة وظيفيا.سوف تعطي مظاهرة بصرية فهم أفضل لكيفية العينة ينبغي أن تكون مطلية وكيفية تحقيق عينات يمكن عدها. للبدء، وإعداد HL60 وسائل الإعلام ثقافة الخلية تتألف من 500 ملليلتر RPMI تكملها L-الجلوتامين و 15 ملليلتر الحرارة تنشيط مصل البقرة الجنين. لنشر وصيانة خلايا HL60، ثقافة خمسة ملايين خلية في 10 ملليلتر من وسائل الإعلام ثقافة الخلايا HL60 في 75 سنتيمترا مربعا تنفيس قارورة في 37 درجة مئوية وخمسة في المئة ثاني أكسيد الكربون.لتوليد مخزون العمل من الخلايا HL60، إضافة ما يقرب من مليون خلية لكل ملليلتر في وسائل الإعلام ثقافة HL60 تكملها 10٪ ثنائي الفينيل السلفيد في أنابيب مبردة ملليلتر واحد. للتمييز بين خلايا HL60، الثقافة 1.5 مرات 10 إلى الخلايا السبع في 15 ملليلتر من وسائل الإعلام ثقافة الخلايا HL60 تكملها 0.6٪ DMF في مرشح معقم توج 75 قارورة سنتيمتر مربع في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاثة أيام قبل OPKA. لإعداد عينات الأرصدة البكتيرية، قم بزراعة سلالة WU2 البكتيرية في مرق مناسب لمدة ساعتين إلى أربع ساعات تقريبًا عند 37 درجة مئوية.بعد ذلك ، بيليه البكتيريا عن طريق الطرد المركزي في ستة آلاف مرة G لمدة دقيقتين وإعادة تعليق الخلايا في 10 إلى 30 ملليلتر من 15 ٪ الجلسرين في مرق المناسبة. Aliquot ثقافة البكتيريا في أنابيب أجهزة الطرد المركزي 1.5 ملليلتر العقيمة وتخزينها في 80 درجة مئوية. بعد ذلك، ذوبان قارورة واحدة من المخزون البكتيري في حمام الماء 37 درجة مئوية.بيليه الخلايا البكتيرية و resuspend في 500 ميكرولترات من OBB في ظروف معقمة. يخفف لوحة من المخزون البكتيري غير المعالجة على لوحات أجار الدم وثقافة لوحات بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية. بعد خطوة الحضانة، عد المستعمرات لكل تخفيف من الأسهم البكتيرية غير المعالجة المشتركة مع خلايا HL60.سجل الذي تخفيف البكتيريا ينتج العدد الأمثل من المستعمرات القابلة للعد لOPKAs المستقبلية مع هذا المخزون البكتيري. ذوبان أنبوب واحد من المخزون البكتيري. بيليه البكتيريا في ستة آلاف مرة G لمدة دقيقتين وإعادة تعليق بيليه الخلية في OBB في التخفيف الأمثل التي تم الحصول عليها في الخطوة السابقة.Pipette 10 ميكرولترات من التخفيف البكتيرية resuspended في البئر في أسفل جولة 96 جيدا لوحة الخلية الثقافة. ثم، إضافة 20 ميكرولترات من جسم مضاد مناسب أو علاج المخدرات إلى كل بئر تجريبية في مكررة. بالنسبة لآبار التحكم، استخدم 1XPBS أو OBB حسب المخزن المؤقت المستخدم لآبار المعالجة.هز لوحة العينة عند حوالي 90 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. لحصاد الخلايا المتمايزة HL60 التي يتم التعامل مع DMF قبل ثلاثة أيام، بيليه الخلايا في 500 مرات G لمدة ثلاث دقائق. تجاهل عظمى وغسل بيليه مع ما لا يقل عن 10 ملليلتر من 1XPBS.بيليه الخلايا المغسولة في 500 مرة G لمدة ثلاث دقائق. تجاهل افرا و resuspend الخلايا في OBB. إضافة معقمة غير مخففة مصل أرنب الطفل في حجم واحد إلى خمسة النهائي.بعد استزراع بكتيري لمدة ساعة، قم بتقسيم كل عينة إلى آبار مكررة لمجموعتين. بعد ذلك، إضافة 50 ميكرولترات من خليط HL60 تكملة لكل مجموعة تجريبية من الآبار و 50 ميكرولتر من OBB إلى آبار البكتيريا فقط. يهز 96 لوحة البئر في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.إلى عينات لوحة، تمييع كل بئر مع OBB في حجم واحد إلى خمسة النهائي بحيث كل عينة لديها حجم لا يقل عن 50 ميكرولترات. بعد ذلك، الماصات 50 ميكرولترات من كل عينة مباشرة على منطقة معينة من لوحة ثقافة بكتيرية، وضمان المباعدة الكافية بين العينات. يُغطّى المزيج ويُغطّى ليُجفف لمدة 15 دقيقة تقريباً في درجة حرارة الغرفة.عكس لوحات والثقافة بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية. بدلا من ذلك، لوحات الاستزراع في الجرار اللاهوائية لاختبار ما إذا كانت الظروف الأنوكسي تؤثر على النمو البكتيري أو للتحكم في مورفولوجيا. بعد الاستزراع بين عشية وضحاها، عد المستعمرات في كل منطقة عينة معينة ثم انتقل إلى تحليل البيانات بمقارنة عدد الخلايا الحية في كل مجموعة إلى عناصر التحكم المقابلة.من المرجح أن تكون الجوانب الأكثر صعوبة في إنشاء هذه التقنية لأول مرة هي تحسين وحدات CFUs الأولية للمخزون البكتيري ، بالإضافة إلى ضمان تمييز خلايا HL60 بشكل فعال. قبل البدء في OPKA، تم التحقق من صحة HL60 التفريق باستخدام عملية استئصال الخلايا تدفق مع يوديد بروبدييوم كعلامة البقاء. بعد أن تم علاجها مع DMF لمدة ثلاثة أيام، زاد التعبير عن CD35 وانخفض التعبير عن CD71.تم استخدام متوسط النسب المئوية للبكتيريا CFUs في المجموعات المعالجة HL60 مقارنة مع المجموعات المعالجة غير HL60 المناظرة لمقارنة بقاء الخلايا البكتيرية في العلاجات المختلفة. وأظهرت النتائج أنه مع العلاج الفعال، كانت أعداد المستعمرات مختلفة بين HL60 المشتركة في الثقافة والخلايا HL60، مما يدل على أكثر كفاءة البلعميات. وأظهرت النتائج أنه عندما لم يتم تحسين التخفيف البكتيري أو لم يتم ملاحظة نمو المستعمرة بعناية بعد الطلاء ، يمكن أن يمنع فرط نمو المستعمرات من العد الدقيق للمستعمرات.أهم شيء يجب تذكره عند محاولة هذا الإجراء هو مراقبة حضانة البكتيريا بعناية وذلك لتجنب فرط نمو وحدات CFUs. في مقايسات الجسم الحي يمكن استخدامها لقنين إزالة البكتيريا الفعالة داخل المضيف. ويمكن استخدام هذه الأقوال لتأكيد فعالية المناعة لوحظت مع OPKA قابلة للترجمة إلى نماذج الإنسان أو الحيوان.وقد استخدمت عملية القتل opsonophagocytic لـ تأثير كبير في الدراسات البحثية الهامة السابقة لربط العلاجات المضادة للبكتيريا بالاستجابات المناعية الفاتنة. يمكن أن يكون العمل مع مسببات الأمراض البكتيرية خطرًا. يرجى ارتداء معدات شخصية واقية في جميع الأوقات خلال هذه الحسبة.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

انزيم مرتبط Immunospot الفحص (ELISPOT) : القياس الكمي للردود TH - 1 المناعة الخلوية ضد مولدات المضادات الجرثومية

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

مستضد محددة في فيفو الفحص باستخدام خلايا القتل المستهدف CFSE إعتبر

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation.  ...

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

الإدارة السلبي من الاجسام المضادة ضد H. المغمدة مسببات الأمراض الفطرية وآخرون

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating ...

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

باستخدام الفحص ميكروأري عموم الفيروسي (Virochip) إلى الشاشة العينات السريرية لمسببات الأمراض الفيروسية

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

&#39;Bioluminescent&#39; بالعاثية مراسل للكشف عن مسببات الأمراض البكتيرية الفئة أ

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

إصابة الأجنة الزرد مع مسببات الأمراض البكتيرية بين الخلايا

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

تربية وحقن<em&gt; ماندوكا سيكستا</em&gt; اليرقات لتقييم الفوعة البكتيرية

Manduca sexta, commonly known as the tobacco hornworm, is considered a significant agricultural pest, feeding on solanaceous plants including tobacco and ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Application of Long-term cultured Interferon-ÃƒÅ½Ã‚Â³ Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

تطبيق على المدى الطويل مثقف انترفيرون γ انزيم مرتبط Immunospot الفحص لتقييم المستجيب والذاكرة T الردود خلية في الماشية

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

تحديد مسببات الأمراض البكتيرية النادرة التي 16S الريباسي جين تسلسل وMALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...