Name: opsonophagocytic killing assay to assess immunological responses against bacterial pathogens
Uploaded: 2019-04-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens at JoVE.com

Vi takker Dr. Moon Nahm (University of Alabama Birmingham) for hans uvurderlige hjælp i etablering af OPKA assays i vores laboratorium. Dette arbejde blev støttet af nationale institutter af sundhed Grant 1R01AI123383-01A1 til FYA.

1. kultur, differentiering og validering af HL-60 celler

<ol><li>Forberede HL-60 celle Kulturmedier består af 500 mL RPMI med L-glutamin og 50 mL varme-inaktiverede føtal bovint serum. Må ikke tilsættes antibiotika, da dette kan påvirke differentiering af HL-60 celler.</li>
	<li>For formering/vedligeholdelse af HL-60 celler, kultur 5 x 106 celler i 10 mL af HL-60 celle kultur medier i 75 cm2 udluftet kolber på 37 ° C og 5% CO2. Passage celler hver 3−4 dage for at opreth...

<ol>
	<li>Romero-Steiner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+an+opsonophagocytic+assay+for+the+measurement+of+functional+antibody+activity+against+Streptococcus+pneumoniae+using+differentiated+HL-60+cells.">Standardization of an opsonophagocytic assay for the measurement of functional antibody activity against Streptococcus pneumoniae using differentiated HL-60 cells.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 4 (4), 415-422 (1997).</li><li>Nanra, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsular+polysaccharides+are+an+important+immune+evasion+mechanism+for+Staphylococcus+aureus.">Capsular polysaccharides are an important immune evasion mechanism for Staphylococcus aureus.</a> Human Vaccines and Immunotherapeutics. 9 (3), 480-487 (2013).</li><li>Ishibashi, K., Yamaguchi, O., Shiraiwa, Y., Ogihara, M., Shigeta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+therapy+of+Pseudomonas+aeruginosa+pyelonephritis+in+neutropenic+mice+with+human+antilipopolysaccharide+monoclonal+antibody+and+cefsulodin.">Combination therapy of Pseudomonas aeruginosa pyelonephritis in neutropenic mice with human antilipopolysaccharide monoclonal antibody and cefsulodin.</a> Journal of Urology. 155 (6), 2094-2097 (1996).</li><li>Middleton, D. R., Paschall, A. V., Duke, J. A., Avci, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+Hydrolysis+of+Pneumococcal+Capsular+Polysaccharide+Renders+the+Bacterium+Vulnerable+to+Host+Defense.">Enzymatic Hydrolysis of Pneumococcal Capsular Polysaccharide Renders the Bacterium Vulnerable to Host Defense.</a> Infection and Immunity. , (2018).</li><li>Baker, C. J., Noya, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+use+of+intravenous+immune+globulin+for+group+B+streptococcal+infection.">Potential use of intravenous immune globulin for group B streptococcal infection.</a> Reviews of Infectious Diseases. 12, 476-482 (1990).</li><li>Tian, H., Weber, S., Thorkildson, P., Kozel, T. R., Pirofski, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+opsonic+and+nonopsonic+serotype+3+pneumococcal+capsular+polysaccharide-specific+monoclonal+antibodies+against+intranasal+challenge+with+Streptococcus+pneumoniae+in+mice.">Efficacy of opsonic and nonopsonic serotype 3 pneumococcal capsular polysaccharide-specific monoclonal antibodies against intranasal challenge with Streptococcus pneumoniae in mice.</a> Infection and Immunity. 77 (4), 1502-1513 (2009).</li><li>Parameswarappa, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Semi-synthetic+Oligosaccharide+Conjugate+Vaccine+Candidate+Confers+Protection+against+Streptococcus+pneumoniae+Serotype+3+Infection.">A Semi-synthetic Oligosaccharide Conjugate Vaccine Candidate Confers Protection against Streptococcus pneumoniae Serotype 3 Infection.</a> Cell Chemical Biology. 23 (11), 1407-1416 (2016).</li><li>Jackson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomized+clinical+trial+of+a+single+versus+a+double+dose+of+13-valent+pneumococcal+conjugate+vaccine+in+adults+55+through+74+years+of+age+previously+vaccinated+with+23-valent+pneumococcal+polysaccharide+vaccine.">Randomized clinical trial of a single versus a double dose of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in adults 55 through 74 years of age previously vaccinated with 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine.</a> Vaccine. 36 (5), 606-614 (2018).</li><li>Cywes-Bentley, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+to+a+conserved+antigenic+target+is+protective+against+diverse+prokaryotic+and+eukaryotic+pathogens.">Antibody to a conserved antigenic target is protective against diverse prokaryotic and eukaryotic pathogens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (24), 2209-2218 (2013).</li><li>Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+HL-60+cell+line+to+measure+opsonic+capacity+of+pneumococcal+antibodies.">Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).</li><li>Collins, S. J., Ruscetti, F. W., Gallagher, R. E., Gallo, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+differentiation+of+human+promyelocytic+leukemia+cells+induced+by+dimethyl+sulfoxide+and+other+polar+compounds.">Terminal differentiation of human promyelocytic leukemia cells induced by dimethyl sulfoxide and other polar compounds.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 75 (5), 2458-2462 (1978).</li><li>Melnick, N., Rajam, G., Carlone, G. M., Sampson, J. S., Ades, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+novel+therapeutic+approach+to+treating+severe+pneumococcal+infection+using+a+mouse+model.">Evaluation of a novel therapeutic approach to treating severe pneumococcal infection using a mouse model.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 16 (6), 806-810 (2009).</li><li>Dwyer, M., Gadjeva, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opsonophagocytic+assay.">Opsonophagocytic assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1100, 373-379 (2014).</li><li>Burton, R. L., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+fourfold+multiplexed+opsonophagocytosis+assay+for+pneumococcal+antibodies+against+additional+serotypes+and+discovery+of+serological+subtypes+in+Streptococcus+pneumoniae+serotype+20.">Development of a fourfold multiplexed opsonophagocytosis assay for pneumococcal antibodies against additional serotypes and discovery of serological subtypes in Streptococcus pneumoniae serotype 20.</a> Clinical and Vaccine Immunololgy. 19 (6), 835-841 (2012).</li><li>Clarke, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-cost,+high-throughput,+automated+counting+of+bacterial+colonies.">Low-cost, high-throughput, automated counting of bacterial colonies.</a> Cytometry Part A. 77 (8), 790-797 (2010).</li><li>Aanei, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Database-guided+Flow-cytometry+for+Evaluation+of+Bone+Marrow+Myeloid+Cell+Maturation.">Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e57867 (2018).</li><li>Hirz, T., Dumontet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Isolation+and+Analysis+to+Determine+their+Role+in+Lymphoma+Cell+Sensitivity+to+Therapeutic+Agents.">Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents.</a> Journal of Visulaized Experiments. (109), e53846 (2016).</li><li>Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+annexin+V/propidium+iodide+apoptosis+assay+for+accurate+assessment+of+cell+death.">Modified annexin V/propidium iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), 2597 (2011).</li><li>Blair, O. C., Carbone, R., Sartorelli, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+HL-60+promyelocytic+leukemia+cells:+simultaneous+determination+of+phagocytic+activity+and+cell+cycle+distribution+by+flow+cytometry.">Differentiation of HL-60 promyelocytic leukemia cells: simultaneous determination of phagocytic activity and cell cycle distribution by flow cytometry.</a> Cytometry. 7 (2), 171-177 (1986).</li><li>Middleton, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+the+Streptococcus+pneumoniae+type+3+capsule-specific+glycoside+hydrolase+of+Paenibacillus+species+32352.">Identification and characterization of the Streptococcus pneumoniae type 3 capsule-specific glycoside hydrolase of Paenibacillus species 32352.</a> Glycobiology. 28 (2), 90-99 (2018).</li></ol>

OPKAs tjener væsentlige roller i vurderingen af antistof medieret immunrespons induceret af vaccinationer6,8. Den centrale betydning af denne forenklede OPKA er tilpasningsevne i betingelserne, der skal testes (dvs. antistoffer, enzym behandlinger, osv.). I denne forstand, mens dette assay kan bruges til at teste bidrag af opsonins (dvs. antistoffer) i fagocytose, kan det også bruges til at vurdere måder at overvinde virulens faktorer (dvs. kapsulær polysakka...

Opsonophagocytic dræbe assay (OPKA) er et kritisk værktøj for forbinder ændringer i bakteriel struktur eller funktion til efterfølgende ændringer i immunrespons og funktion. Som sådan, er det ofte brugt som en supplerende analyse til at bestemme immun-baserede effekten af antistof behandlinger, vaccine kandidater og enzym optimering. Mens in vivo assays er nødvendigt at fastlægge effektive clearance eller beskyttelse i en bakteriel infektion model, OPKA kan bruges til at vurdere immun bidrag til bakteriel celledød på det mest grundlæggende komponenter: bakterier, immunceller, og eksperimenterende behandlinger. Tidligere undersøgelser har vist, at OPKAs kan ændres og anvendes til en bred vifte af bakterier og serotyper, herunder Streptococcus pneumoniae1, Staphylococcus aureus2, Pseudomonas aeruginosa3. Desuden, disse optimeret assays kan bruges til at vurdere forskellige eksperimentelle behandlinger, herunder et enzym evne til at gøre bakterien mere tilgængelige for komplement-medieret immun celler4 og antistof behandlinger til at forbedre opsonization5. Klassisk, OPKA assay held har været anvendt i grundforskning og klinisk forskning indstillinger som en stærk indikator for beskyttelse induceret af patogen-specifikke antistoffer6,7,8,9 .
Forskellige typer af immunceller kan anvendes til vurdering af opsonophagocytic drab. Et almindeligt anvendte fagocyterende befolkning er HL-60 menneskelige leukemic cellelinie. Denne cellelinje kan holdes som inaktiverede promyelocytes i kultur; de kan dog opdeles i forskellige aktiveret stater via forskellige stof behandlinger10,11. Behandling af HL60 med N, N-dimethylformamid adskiller linjen celle i aktiverede neutrofiler med stærk Fagocytisk aktivitet11. Mens HL-60 celler er blevet optimeret og anvendes ofte til disse fagocytose assays10, kan andre primære polymorfnukleære leukocytter bruges som eksperiment12immun arm.
Derudover disse assays kan være forenklet13 eller multipleksede14 at se på flere antibiotika-resistente stammer af bakterier til at blive testet. Metoden multipleksede er gjort mere realistisk gennem udvikling af software, der effektivt kan tælle bakteriel kolonidannende enheder (CFUs) pr. spot på en agar plade15. Her, beskriver vi en strømlinet metode ved hjælp af en bakteriel stamme, HL-60 celler, baby kanin supplement og blod agar plader. Med denne metode kan flere behandlinger vurderes hurtigt for at løse specifikke forskningsspørgsmål om hvordan den medfødte immun reaktion på bakteriel infektion kan moduleres.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:636px;" width="637">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Annexin V (APC conjugated)</td>
			<td style="width:147px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">640919</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">anti-CD35, human (PE conjugated)</td>
			<td style="width:147px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">333405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">anti-CD71, human (PE conjugated)</td>
			<td style="width:147px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">334105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:204px;">bacterial strain to be used (ie, Streptococcus pneumoniae, WU2)</td>
			<td style="width:147px;">Bacterial Respiratory Reference Laboratory (Dr. Moon Nahm)&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">blood agar plates</td>
			<td>Hardy Diagnostic</td>
			<td>A10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Fetal Clone serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30080.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9012-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">HL-60 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">IgG Isotype Control (PE conjugated)</td>
			<td style="width:147px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">400907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">N,N-dimethylformamide (DMF)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>UN2265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">propidium iodide</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">RPMI media with L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

opsonophagocytic killing assay to assess immunological responses against bacterial pathogens

Et centralt aspekt af immunrespons på bakteriel kolonisering af værten er fagocytose. En opsonophagocytic drab assay (OPKA) er en eksperimentel procedure hvor fagocyterende celler er co kulturperler med bakteriel enheder. Immunceller vil phagocytosis og dræbe de bakterielle kulturer på en måde, komplement-afhængig. Effektiviteten af immun-medieret celle drab er afhængig af en række faktorer og kan bruges til at bestemme, hvordan forskellige bakterielle kulturer sammenligne med hensyn til modstand til celledød. På denne måde, kan effekten af potentielle immun-baserede therapeutics vurderes mod specifikke bakteriestammer og/eller serotyper. I denne protokol beskriver vi en forenklet OPKA, der udnytter grundlæggende dyrkningsbetingelserne og celle tælle Bestem bakteriel cellernes levedygtighed efter fælles kultur med behandling betingelser og HL-60 immunceller. Denne metode har udnyttet med held med en række forskellige pneumokok serotyper, kapsulær, og acapsular stammer og andre bakteriearter. Fordelene ved denne OPKA protokol er dets enkelhed, alsidighed (som denne analyse ikke er begrænset til antistof behandlinger som opsonins), og minimering af tid og reagenser til at vurdere grundlæggende eksperimentelle grupper.

Validering af HL-60 differentiering bør udføres før du starter OPKA. Dette kan opnås ved hjælp af flowcytometri til at bestemme den ekstracellulære udtryk for CD11b, CD35, CD71 og annexin V (figur 1). Propidium Iodid kan også bruges som levedygtighed markør. Efter behandling med DMF for 3 dage, forhøjes udtryk for CD35 (≥55% af alle celler) og udtryk for CD71 bør være faldet (≤20% af alle celler). Procentdelen af annexin V + og propidium Iodid (PI +) celler sammen bør være <...

Watch this Scientific Journal Video about Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens at JoVE.com

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

Denne opsonophagocytic drab analysen bruges til at sammenligne evne til fagocyterende immunceller til at reagere på og dræbe bakterier baseret på forskellige behandlinger og/eller betingelser. Klassisk, fungerer dette assay som den gyldne standard for vurdering af effektor funktion af antistoffer, der er rejst mod en bakterie som opsonin.

Opsonophagocytic drab Assay at vurdere immunologiske reaktioner mod bakterielle patogener

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Denne analyse links modulering af bakteriel struktur og funktion til immuncellebaseret antibakteriel aktivitet. Som sådan, en vigtig immunterapeutisk af en potentiel behandling kan vurderes ved fastsættelsen af sandsynligheden for forbedret bakteriel clearance. Opsonophagocytic drab assay traditionelt tjener som guld standard for vurdering af effektive funktioner af antistoffer rejst mod bakterien som obsonant.Denne protokol giver enkelhed og alsidighed over eksisterende høj gennemløb standardiserede analyser. I denne protokol undersøger vi virkningerne af en lægemiddelbehandling på streptokokkerumoni, og hvordan disse virkninger giver sig udslag i forbedret fagocytose i bakterien. Her anvender vi OPKA til streptokokker lungebetændelse celler.Men denne protokol kan vedtages for at vurdere fagocytiske drab på andre patogener af immunceller. Afsætte tid til at optimere bakterielagrene og sikre, at de endelige CFUs, der skal tælles, falder inden for det optimale område. Vi anbefaler på det kraftigste at bruge flowcytometri for at sikre, at HL60-cellerne er levedygtige og aktive, og forsøger forskellige kulturforhold for at sikre funktionelt aktive celler.Visuel demonstration vil give en bedre forståelse af, hvordan prøven skal belagt, og hvordan man opnår tællelige prøver. Til at begynde, forberede HL60 cellekultur medier bestående af 500 milliliter RPMI suppleret med L-glutamin og 15 milliliter varme inaktiveret føtal kvæg serum. Til formering og vedligeholdelse af HL60 celler, kultur fem millioner celler i 10 milliliter HL60 cellekultur medier i 75 kvadratcentimeter udluftede kolber ved 37 grader celsius og fem procent kuldioxid.For at generere arbejdslagre af HL60 celler, tilsættes ca. en million celler pr. milliliter i HL60-kulturmedier suppleret med 10% dimethylsulfoxid i et milliliter kryogenrør. For at differentiere HL60 celler, kultur 1,5 gange 10 til de syv celler i 15 milliliter HL60 cellekultur medier suppleret med 0,6% DMF i sterilt filter udjævnet 75 kvadratcentimeter kolber ved 37 grader celsius og 5% kuldioxid i tre dage før OPKA. For at forberede bakteriemasse prøver, dyrke WU2 bakteriestamme i en passende bouillon i cirka to til fire timer ved 37 grader celsius.Dernæst pellet bakterierne ved centrifugering på seks tusinde gange G i to minutter og resuspend cellerne i 10 til 30 milliliter 15% glycerol i den relevante bouillon. Aliquot bakterier kultur i sterile 1,5 milliliter centrifuge rør og opbevares ved 80 grader celsius. Dernæst tø et hætteglas af bakteriebestand i en 37 grader celsius vandbad.Pellet de bakterielle celler og resuspenderet i 500 mikroliter obb under sterile forhold. Pladefortyndinger af den ubehandlede bakteriemasse på blodgarplader og kultur pladerne natten over ved 30 grader celsius. Efter inkubationen trin, tælle kolonierne for hver fortynding af ubehandlet bakteriel bestand co-dyrket med HL60 celler.Optag hvilken fortynding af bakterier giver det optimale antal tællelige kolonier til fremtidige OPK'er med denne bakteriebestand. Tø et rør af bakteriebestand. Pellet bakterier på seks tusinde gange G i to minutter og resuspend cell pellet i OBB på den optimale fortynding opnået i det foregående trin.Pipette 10 mikroliter af den resuspenderede bakteriel fortynding pr brønd i en rund bund 96 godt cellekultur plade. Derefter tilsættes 20 mikroliter af et passende antistof eller en narkotikabehandling til hver eksperimentel brønd i to eksemplarer. Til kontrolb godtinger skal du bruge 1XPBS eller OBB afhængigt af den buffer, der bruges til behandlingsbæderne.Prøvepladen rystes ved ca. 90 omdr./min. ved stuetemperatur i en time. At høste HL60 differentierede celler, der behandles med DMF tre dage før, pellet cellerne ved 500 gange G i tre minutter. Supernatanten kasseres, og pelleten vaskes med mindst 10 milliliter 1XPBS.Pellet de vaskede celler ved 500 gange G i tre minutter. Kassér supernatanten og opspjæn dine celler i OBB. Tilføj sterile ufortyndet baby kanin serum på en en til fem endelige volumen.Efter en times bakteriekultur opdeles hver prøve i dublerede brønde til to grupper. Dernæst tilsættes 50 mikroliter af HL60 komplement blandingen til hvert eksperimentelt sæt brønde og 50 mikroliter OBB til brønde af bakterier alene. Ryst 96 brøndpladen ved 37 grader celsius i en time.Til pladeprøver fortyndes hver brønd med OBB ved et slutvolumen på 1-5, således at hver prøve har et volumen på mindst 50 mikroliter. Dernæst pipette 50 mikroliter af hver prøve direkte på et udpeget område af en bakteriekulturplade, hvilket sikrer tilstrækkelig afstand mellem prøverne. Lad prøverne tørre i ca. 15 minutter ved stuetemperatur.Inverter pladerne og kultur natten over ved 30 grader celsius. Alternativt kan der anvendes kulturplader i anaerobe krukker for at teste, om anoxiske tilstande påvirker bakterievæksten eller til at kontrollere for morfologi. Efter nattens kultur skal kolonierne tælles i hvert udpeget prøveområde og analysere data ved at sammenligne antallet af levende celler i hvert sæt med de tilsvarende kontroller.De vanskeligste aspekter ved at etablere denne teknik for første gang vil sandsynligvis være at optimere de begyndende CFUs af bakterielageret, samt at sikre, at HL60 cellerne er effektivt differentieret. Før OPKA blev HL60-differentiering valideret ved hjælp af flowcytometri med propidiumidodid som levedygtighedsmarkør. Efter at være blevet behandlet med DMF i tre dage blev ekspressionen af CD35 øget, og ekspressionen af CD71 blev reduceret.Den gennemsnitlige procentdel af bakterielle CFUs i de HL60 behandlede grupper sammenlignet med de tilsvarende ikke-HL60 behandlede grupper blev anvendt til at sammenligne bakteriecelleoverlevelsen af forskellige behandlinger. Resultaterne viste, at med en effektiv behandling var antallet af kolonier forskelligt mellem HL60 co-kultur og ingen HL60 celler, hvilket indikerer mere effektiv fagocytose. Resultaterne viste, at når den bakterielle fortynding ikke var optimeret eller kolonivæksten ikke blev observeret omhyggeligt efter plettering, kunne overvækst af kolonierne forhindre nøjagtig optælling af kolonier.Det vigtigste at huske, når du forsøger denne procedure er at overvåge bakteriel inkubation omhyggeligt for at undgå overvækst af CFUs. In vivo-analyser kan bruges til at eses effektiv bakteriel clearance inden for en vært. Disse analyser kan bruges til at bekræfte immuneffekten observeret med OPKA kan oversættes til humane eller animalske modeller.Den opsonophagocytiske drab assay er blevet brugt med stor effekt i tidligere væsentlige forskningsundersøgelser at forbinde antibakterielle behandlinger til fagocyre immunrespons. Arbejde med bakterielle patogener kan være farligt. Bær venligst beskyttelsesudstyr på alle tidspunkter i løbet af denne analyse.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation.  ...

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating ...

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Infektion af zebrafisk embryoner med intracellulære bakterielle patogener

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Opdræt og Injektion af<em&gt; Manduca sexta</em&gt; Larver at vurdere bakteriel virulens

Manduca sexta, commonly known as the tobacco hornworm, is considered a significant agricultural pest, feeding on solanaceous plants including tobacco and ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Application of Long-term cultured Interferon-ÃƒÅ½Ã‚Â³ Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Anvendelse af Langsigtet kulturperler Interferon-γ Enzyme-linked immunospot Assay til Vurdering Effektorceller og Memory T celle responser i Cattle

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

Identifikation af sjældne bakterielle patogener ved 16S rRNA Gene Sequencing og MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...