Name: opsonophagocytic killing assay to assess immunological responses against bacterial pathogens
Uploaded: 2019-04-05T14:00:00
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Nous remercions m. Moon Nahm (Université de l’Alabama, Birmingham) pour son aide précieuse dans l’établissement de tests OPKA dans notre laboratoire. Ce travail a été soutenu par les instituts nationaux de santé Grant 1R01AI123383-01 a 1 à FYA.

1. culture, différenciation et la Validation des cellules HL-60

<ol><li>Préparation des milieux de culture de cellules HL-60 composée de 500 mL RPMI avec la L-glutamine et 50 mL inactivés par la chaleur sérum de veau fœtal. N’ajoutez pas d’antibiotiques car cela peut affecter la différenciation des cellules HL-60.</li>
	<li>Pour propagation/maintenance des cellules HL-60, la culture 5 x 106 cellules dans 10 mL de milieux de culture cellulaire HL-60 à 75 cm2 ventilés flacons à...

<ol>
	<li>Romero-Steiner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+an+opsonophagocytic+assay+for+the+measurement+of+functional+antibody+activity+against+Streptococcus+pneumoniae+using+differentiated+HL-60+cells.">Standardization of an opsonophagocytic assay for the measurement of functional antibody activity against Streptococcus pneumoniae using differentiated HL-60 cells.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 4 (4), 415-422 (1997).</li><li>Nanra, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsular+polysaccharides+are+an+important+immune+evasion+mechanism+for+Staphylococcus+aureus.">Capsular polysaccharides are an important immune evasion mechanism for Staphylococcus aureus.</a> Human Vaccines and Immunotherapeutics. 9 (3), 480-487 (2013).</li><li>Ishibashi, K., Yamaguchi, O., Shiraiwa, Y., Ogihara, M., Shigeta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+therapy+of+Pseudomonas+aeruginosa+pyelonephritis+in+neutropenic+mice+with+human+antilipopolysaccharide+monoclonal+antibody+and+cefsulodin.">Combination therapy of Pseudomonas aeruginosa pyelonephritis in neutropenic mice with human antilipopolysaccharide monoclonal antibody and cefsulodin.</a> Journal of Urology. 155 (6), 2094-2097 (1996).</li><li>Middleton, D. R., Paschall, A. V., Duke, J. A., Avci, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+Hydrolysis+of+Pneumococcal+Capsular+Polysaccharide+Renders+the+Bacterium+Vulnerable+to+Host+Defense.">Enzymatic Hydrolysis of Pneumococcal Capsular Polysaccharide Renders the Bacterium Vulnerable to Host Defense.</a> Infection and Immunity. , (2018).</li><li>Baker, C. J., Noya, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+use+of+intravenous+immune+globulin+for+group+B+streptococcal+infection.">Potential use of intravenous immune globulin for group B streptococcal infection.</a> Reviews of Infectious Diseases. 12, 476-482 (1990).</li><li>Tian, H., Weber, S., Thorkildson, P., Kozel, T. R., Pirofski, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+opsonic+and+nonopsonic+serotype+3+pneumococcal+capsular+polysaccharide-specific+monoclonal+antibodies+against+intranasal+challenge+with+Streptococcus+pneumoniae+in+mice.">Efficacy of opsonic and nonopsonic serotype 3 pneumococcal capsular polysaccharide-specific monoclonal antibodies against intranasal challenge with Streptococcus pneumoniae in mice.</a> Infection and Immunity. 77 (4), 1502-1513 (2009).</li><li>Parameswarappa, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Semi-synthetic+Oligosaccharide+Conjugate+Vaccine+Candidate+Confers+Protection+against+Streptococcus+pneumoniae+Serotype+3+Infection.">A Semi-synthetic Oligosaccharide Conjugate Vaccine Candidate Confers Protection against Streptococcus pneumoniae Serotype 3 Infection.</a> Cell Chemical Biology. 23 (11), 1407-1416 (2016).</li><li>Jackson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomized+clinical+trial+of+a+single+versus+a+double+dose+of+13-valent+pneumococcal+conjugate+vaccine+in+adults+55+through+74+years+of+age+previously+vaccinated+with+23-valent+pneumococcal+polysaccharide+vaccine.">Randomized clinical trial of a single versus a double dose of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in adults 55 through 74 years of age previously vaccinated with 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine.</a> Vaccine. 36 (5), 606-614 (2018).</li><li>Cywes-Bentley, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+to+a+conserved+antigenic+target+is+protective+against+diverse+prokaryotic+and+eukaryotic+pathogens.">Antibody to a conserved antigenic target is protective against diverse prokaryotic and eukaryotic pathogens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (24), 2209-2218 (2013).</li><li>Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+HL-60+cell+line+to+measure+opsonic+capacity+of+pneumococcal+antibodies.">Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).</li><li>Collins, S. J., Ruscetti, F. W., Gallagher, R. E., Gallo, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+differentiation+of+human+promyelocytic+leukemia+cells+induced+by+dimethyl+sulfoxide+and+other+polar+compounds.">Terminal differentiation of human promyelocytic leukemia cells induced by dimethyl sulfoxide and other polar compounds.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 75 (5), 2458-2462 (1978).</li><li>Melnick, N., Rajam, G., Carlone, G. M., Sampson, J. S., Ades, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+novel+therapeutic+approach+to+treating+severe+pneumococcal+infection+using+a+mouse+model.">Evaluation of a novel therapeutic approach to treating severe pneumococcal infection using a mouse model.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 16 (6), 806-810 (2009).</li><li>Dwyer, M., Gadjeva, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opsonophagocytic+assay.">Opsonophagocytic assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1100, 373-379 (2014).</li><li>Burton, R. L., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+fourfold+multiplexed+opsonophagocytosis+assay+for+pneumococcal+antibodies+against+additional+serotypes+and+discovery+of+serological+subtypes+in+Streptococcus+pneumoniae+serotype+20.">Development of a fourfold multiplexed opsonophagocytosis assay for pneumococcal antibodies against additional serotypes and discovery of serological subtypes in Streptococcus pneumoniae serotype 20.</a> Clinical and Vaccine Immunololgy. 19 (6), 835-841 (2012).</li><li>Clarke, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-cost,+high-throughput,+automated+counting+of+bacterial+colonies.">Low-cost, high-throughput, automated counting of bacterial colonies.</a> Cytometry Part A. 77 (8), 790-797 (2010).</li><li>Aanei, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Database-guided+Flow-cytometry+for+Evaluation+of+Bone+Marrow+Myeloid+Cell+Maturation.">Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e57867 (2018).</li><li>Hirz, T., Dumontet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Isolation+and+Analysis+to+Determine+their+Role+in+Lymphoma+Cell+Sensitivity+to+Therapeutic+Agents.">Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents.</a> Journal of Visulaized Experiments. (109), e53846 (2016).</li><li>Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+annexin+V/propidium+iodide+apoptosis+assay+for+accurate+assessment+of+cell+death.">Modified annexin V/propidium iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), 2597 (2011).</li><li>Blair, O. C., Carbone, R., Sartorelli, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+HL-60+promyelocytic+leukemia+cells:+simultaneous+determination+of+phagocytic+activity+and+cell+cycle+distribution+by+flow+cytometry.">Differentiation of HL-60 promyelocytic leukemia cells: simultaneous determination of phagocytic activity and cell cycle distribution by flow cytometry.</a> Cytometry. 7 (2), 171-177 (1986).</li><li>Middleton, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+the+Streptococcus+pneumoniae+type+3+capsule-specific+glycoside+hydrolase+of+Paenibacillus+species+32352.">Identification and characterization of the Streptococcus pneumoniae type 3 capsule-specific glycoside hydrolase of Paenibacillus species 32352.</a> Glycobiology. 28 (2), 90-99 (2018).</li></ol>

OPKAs servir un rôle essentiel dans l’évaluation de médiation immunitaire d’anticorps induits par les vaccins6,8. La signification fondamentale de ce OPKA simplifiée est la capacité d’adaptation dans les conditions à tester (anticorps, traitements enzymatiques, etc..). En ce sens, bien que ce test peut être utilisé pour tester la contribution des opsonines (c.-à-d., anticorps) dans la phagocytose, également utilisable pour évaluer les moyens de s...

L’opsonophagocytic tuant assay (OPKA) est un outil essentiel permettant de relier des altérations de la structure bactérienne ou une fonction aux modifications ultérieures dans la réponse immunitaire et la fonction. À ce titre, il sert souvent une analyse complémentaire afin de déterminer l’efficacité immunitaire basé sur des traitements d’anticorps, vaccins expérimentaux, optimisation de l’enzyme, etc.. Alors que les essais in vivo sont nécessaires pour déterminer la clairance apparente ou protection dans un modèle d’infection bactérienne, le OPKA peut être utilisé pour évaluer la contribution immunisée à la mort de la cellule bactérienne composants à la base : les bactéries, les cellules immunitaires et expérimentale traitements. Des études antérieures ont montré que OPKAs peuvent être modifiées et utilisés pour une variété de bactéries et sérotypes, dont Streptococcus pneumoniae1, Staphylococcus aureus,2,3de la Pseudomonas aeruginosa. En outre, ces dosages optimisés peuvent servir à évaluer différents traitements expérimentaux, y compris la capacité d’une enzyme pour faciliter l’accès aux cellules immunitaires médiée par le complément4 anticorps traitements et pour améliorer la bactérie opsonisation5. Classiquement, le dosage OPKA a été utilisée avec succès dans la recherche fondamentale et clinique paramètres comme un puissant indicateur de protection induite par des anticorps spécifiques6,7,8,9 .
Différents types de cellules immunitaires peuvent servir pour l’évaluation de l’assassinat d’opsonophagocytic. Une population phagocytaire couramment utilisée est la ligne de cellules leucémiques humaines HL-60. Cette lignée cellulaire peut être gardée comme promyélocytes inactivé en culture ; Toutefois, ils peuvent être différenciés dans divers États activés par l’intermédiaire de différents médicaments traitements10,11. Traitement des HL60 avec N, N-diméthylformamide différencie de la lignée cellulaire en neutrophiles activés avec forte activité phagocytaire11. Tandis que les cellules HL-60 ont été optimisés et sont fréquemment utilisés pour ces essais de phagocytose10, autres leucocytes polymorphonucléaires primaires peuvent être utilisés comme le bras immunitaire de l' expérience12.
En outre, ces tests peuvent être simplifiées13 ou multiplexés14 à regarder de nombreuses souches résistantes aux antibiotiques des bactéries à tester. La méthode multiplexée ont été réalisée en plus faisable grâce à l’élaboration d’un logiciel qui peut compter efficacement la colonie bactérienne formant des unités (UFC) par endroit sur une plaque de gélose15. Nous décrivons ici une méthode simplifiée utilisant une souche bactérienne, les cellules HL-60, complément de bébé lapin et géloses au sang. Avec cette méthode, plusieurs traitements peuvent être évalués rapidement pour répondre à des questions de recherche spécifiques sur la façon dont la réponse immunitaire innée à l’infection bactérienne peut être modulée.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:636px;" width="637">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Annexin V (APC conjugated)</td>
			<td style="width:147px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">640919</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">anti-CD35, human (PE conjugated)</td>
			<td style="width:147px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">333405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">anti-CD71, human (PE conjugated)</td>
			<td style="width:147px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">334105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:204px;">bacterial strain to be used (ie, Streptococcus pneumoniae, WU2)</td>
			<td style="width:147px;">Bacterial Respiratory Reference Laboratory (Dr. Moon Nahm)&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">blood agar plates</td>
			<td>Hardy Diagnostic</td>
			<td>A10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Fetal Clone serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30080.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9012-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">HL-60 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">IgG Isotype Control (PE conjugated)</td>
			<td style="width:147px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">400907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">N,N-dimethylformamide (DMF)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>UN2265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">propidium iodide</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">RPMI media with L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

opsonophagocytic killing assay to assess immunological responses against bacterial pathogens

Un aspect clé de la réponse immunitaire à une colonisation bactérienne de l’hôte est la phagocytose. Un test de mise à mort d’opsonophagocytic (OPKA) est une procédure expérimentale dans laquelle les cellules phagocytaires sont conjointement cultivés avec unités bactériennes. Les cellules immunitaires vont phagocyter et tuer les cultures bactériennes d’une manière dépendante du complément. L’efficacité de l’assassinat de cellule immunitaire dépend de plusieurs facteurs et peut être utilisée pour déterminer comment les différentes bactéries comparer les cultures en ce qui concerne la résistance à la mort cellulaire. De cette façon, l’efficacité du potentiel immunitaire base thérapeutique peut être évaluée contre les souches bactériennes spécifiques et/ou des sérotypes. Dans ce protocole, nous décrivons une OPKA simplifiée qui utilise des conditions de culture de base et de la cellule de comptage pour déterminer la viabilité cellulaire bactérienne après co-culture avec des conditions de traitement et HL-60 cellules immunitaires. Cette méthode a été utilisée avec succès avec un certain nombre de différents sérotypes pneumococciques, capsulaires et capsulée souches et d’autres espèces bactériennes. Les avantages du présent protocole OPKA sont sa simplicité, polyvalence (comme ce test n’est pas limité aux traitements d’anticorps comme opsonines) et la minimisation du temps et de réactifs pour évaluer les groupes expérimentaux de base.

Validation de la différenciation de la HL-60 doit être exécutée avant de commencer le OPKA. Ceci peut être accompli à l’aide de cytométrie de flux pour déterminer l’expression extracellulaire de CD11b, CD35, CD71 et l’annexin V (Figure 1). L’iodure de Propidium peut aussi servir comme un marqueur de viabilité. Après avoir été traités avec DMF pendant 3 jours, l’expression du CD35 devrait être augmentée (≥55 % de toutes les cellules) et expression du CD71 devrait ê...

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Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

Ce test de mise à mort d’opsonophagocytic est utilisé pour comparer la capacité des cellules immunitaires phagocytaires de répondre à et de tuer les bactéries issus des différents traitements et/ou des conditions. Classiquement, ce test sert de l’étalon-or pour évaluer les fonctions effectrices des anticorps contre une bactérie comme opsonine.

Opsonophagocytic meurtre dosage pour évaluer les réponses immunologiques contre les bactéries pathogènes

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Cet essai lie la modulation de la structure bactérienne et de la fonction à l’activité antibactérienne à base de cellules immunitaires. En tant que tel, un immunothérapeutique clé d’un traitement potentiel peut être évalué en déterminant la probabilité d’une meilleure dégagement bactérien. L’analyse opsonophagocytique de mise à mort sert traditionnellement d’étalon-or pour évaluer les fonctions efficaces des anticorps soulevés contre la bactérie comme obsonnants.Ce protocole offre simplicité et polyvalence par rapport aux analyses standardisées à haut débit existantes. Dans ce protocole, nous étudions les effets d’un traitement médicamenteux sur la pneumonie streptocoque et comment ces effets se traduisent par une phagocytose améliorée de la bactérie. Ici, nous appliquons l’OPKA aux cellules de pneumonie streptocoque.Cependant ce protocole peut être adopté pour évaluer le meurtre phagocytique d’autres agents pathogènes par les cellules immunitaires. Consacrez du temps à optimiser les stocks bactériens et à vous assurer que les CFC finaux à compter se trouvent dans la plage optimale. Nous recommandons fortement d’utiliser la cytométrie du débit pour nous assurer que les cellules HL60 sont viables et actives et d’essayer différentes conditions de culture pour assurer des cellules fonctionnellement actives.La démonstration visuelle permettra de mieux comprendre comment l’échantillon doit être plaqué et comment obtenir des échantillons dénombrés. Pour commencer, préparez des supports de culture cellulaire HL60 composés de 500 millilitres RPMI complétés par de la L-glutamine et de 15 millilitres de sérum bovin fœtal inactivé. Pour la propagation et le maintien des cellules HL60, la culture de cinq millions de cellules dans 10 millilitres de HL60 corps de culture cellulaire dans 75 centimètres carrés ventilés flacons à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de dioxyde de carbone.Pour générer des stocks de travail de cellules HL60, ajouter environ un million de cellules par millilitre dans les médias de culture HL60 complétées par du sulfure de diméthyle de 10 % en tubes cryogéniques d’un millilitre. Pour différencier les cellules HL60, la culture 1,5 fois 10 aux sept cellules dans 15 millilitres de HL60 médias de culture cellulaire complétée par 0,6%DMF dans le filtre stérile plafonné 75 flacons centimètre carré à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant trois jours avant OPKA. Pour préparer les échantillons de bouillon bactérien, faire pousser la souche bactérienne WU2 dans un bouillon approprié pendant environ deux à quatre heures à 37 degrés Celsius.Ensuite, pelleter les bactéries par centrifugation à six mille fois G pendant deux minutes et resuspendre les cellules en 10 à 30 millilitres de 15% glycérol dans le bouillon approprié. Aliquot la culture des bactéries dans stériles 1,5 millilitres tubes centrifugeuses et stocker à 80 degrés Celsius. Ensuite, décongelez un flacon de bouillon bactérien dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius.Pelleter les cellules bactériennes et les résuser dans 500 microlitres d’OBB dans des conditions stériles. Les dilutions des plaques du stock bactérien non traité sur les plaques d’agar sanguin et la culture des plaques pendant la nuit à 30 degrés Celsius. Après l’étape d’incubation, compter les colonies pour chaque dilution du stock bactérien non traité co-cultivé avec les cellules HL60.Enregistrez quelle dilution des bactéries donne le nombre optimal de colonies dénombrées pour les futurs OPCA avec ce stock bactérien. Décongeler un tube de bouillon bactérien. Bactéries granulés à six mille fois G pendant deux minutes et de résuspendre la pastille cellulaire dans OBB à la dilution optimale obtenue dans l’étape précédente.Pipette 10 microlitres de la dilution bactérienne résuspendue par puits dans une plaque ronde de culture de cellules de 96 puits. Ensuite, ajoutez 20 microlitres d’un anticorps approprié ou d’un traitement médicamenteux à chaque puits expérimental en double. Pour les puits de contrôle, utilisez 1XPBS ou OBB selon le tampon utilisé pour les puits de traitement.Agiter la plaque d’échantillon à environ 90 rpm à température ambiante pendant une heure. Pour récolter les cellules différenciées HL60 qui sont traitées avec DMF trois jours avant, pelleter les cellules à 500 fois G pendant trois minutes. Jetez le supernatant et lavez la pastille avec au moins 10 millilitres de 1XPBS.Pelleter les cellules lavées à 500 fois G pendant trois minutes. Jetez le supernatant et resuspendez les cellules dans OBB. Ajouter le sérum stérile non dilué de lapin de bébé à un à cinq volume final.Après une culture bactérienne d’une heure, diviser chaque échantillon en puits en double pour deux groupes. Ensuite, ajoutez 50 microlitres du mélange HL60 complément à chaque ensemble expérimental de puits et 50 microlitres d’OBB aux puits de bactéries seulement. Agiter la plaque de puits 96 à 37 degrés Celsius pendant une heure.Pour plaquer les échantillons, diluer chaque puits avec de l’OBB à un volume final d’un à cinq afin que chaque échantillon ait un volume d’au moins 50 microlitres. Ensuite, pipette 50 microlitres de chaque échantillon directement sur une zone désignée d’une plaque de culture bactérienne, assurant un espacement adéquat entre les échantillons. Couvrir et laisser sécher les échantillons pendant environ 15 minutes à température ambiante.Inverser les assiettes et la culture pendant la nuit à 30 degrés Celsius. Alternativement, plaques de culture dans des pots anaérobies pour tester si les conditions anoxiques affectent la croissance bactérienne ou pour contrôler la morphologie. Après la culture du jour au lendemain, comptez les colonies dans chaque zone d’échantillonnage désignée et procédez à l’analyse des données en comparant le nombre de cellules vivantes dans chaque ensemble aux contrôles correspondants.Les aspects les plus difficiles de l’établissement de cette technique pour la première fois seront probablement l’optimisation des CFUs de départ du stock bactérien, ainsi que de s’assurer que les cellules HL60 sont effectivement différenciées. Avant de commencer l’OPKA, la différenciation HL60 a été validée à l’aide de la cytométrie du débit avec l’iodure propidium comme marqueur de viabilité. Après avoir été traité avec DMF pendant trois jours, l’expression de CD35 a été augmentée et l’expression de CD71 a été diminuée.Les pourcentages moyens d’FC bactériennes dans les groupes traités HL60 par rapport aux groupes traités non-HL60 correspondants ont été utilisés pour comparer la survie des cellules bactériennes de différents traitements. Les résultats ont montré qu’avec un traitement efficace, le nombre de colonies était différent entre la co-culture HL60 et aucune cellule HL60, ce qui indique une phagocytose plus efficace. Les résultats ont montré que lorsque la dilution bactérienne n’était pas optimisée ou que la croissance de la colonie n’était pas soigneusement observée après placage, la prolifération des colonies pouvait empêcher un comptage précis des colonies.La chose la plus importante à retenir lors de la tentative de cette procédure est de surveiller attentivement l’incubation bactérienne afin d’éviter la prolifération des FC. Les analyses in vivo peuvent être utilisées pour évaluer le dégagement bactérien efficace au sein d’un hôte. Ces analyses peuvent être utilisées pour confirmer que l’efficacité immunitaire observée avec l’OPKA est traduisible en modèles humains ou animaux.L’essai de mise à mort opsonophagocytic a été employé à grand effet dans les études significatives précédentes de recherche pour lier des thérapies antibactériennes aux réponses immunisées phagostiques. Travailler avec des agents pathogènes bactériens peut être dangereux. S’il vous plaît porter de l’équipement personnel de protection en tout temps au cours de cet essai.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

L&#39;administration passive d&#39;anticorps monoclonaux contre H. capsulatum Et autres pathogènes fongiques

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating ...

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

En utilisant un dosage Microarray pan-virale (Virochip) pour cribler des échantillons cliniques pour les pathogènes viraux

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

Phage »Bioluminescent&quot; Reporter pour la détection des bactéries pathogènes de la catégorie A

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

L&#39;infection des embryons de poisson zèbre avec bactéries pathogènes intracellulaires

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

L&#39;élevage et de l&#39;injection de<em&gt; Manduca sexta</emLes larves&gt; pour évaluer la virulence bactérienne

Manduca sexta, commonly known as the tobacco hornworm, is considered a significant agricultural pest, feeding on solanaceous plants including tobacco and ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Application of Long-term cultured Interferon-ÃƒÅ½Ã‚Â³ Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Application de long terme de culture interféron-γ-enzymatique immunospot Essai d&#39;évaluation de mémoires et effectrices réponses des cellules T chez les bovins

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

Identification des bactéries pathogènes rares par 16S ARNr Gene Séquençage et MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...