Name: opsonophagocytic killing assay to assess immunological responses against bacterial pathogens
Uploaded: 2019-04-05T14:00:00
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Wir danken Dr. Moon Nahm (University of Alabama Birmingham) für seine unschätzbare Hilfe bei der Gründung OPKA Tests in unserem Labor. Diese Arbeit wurde vom National Institute of Health Grant 1R01AI123383-01A1, FYA unterstützt.

(1) Kultur, Differenzierung und Validierung von HL-60 Zellen

<ol><li>HL-60 Zellkulturmedien bestehend aus 500 mL RPMI mit L-Glutamin und 50 mL Hitze-inaktivierten fötalen Rinderserum vorzubereiten. Fügen Sie keine Antibiotika, da dies die Differenzierung der HL-60 Zellen beeinflussen kann.</li>
	<li>Für die Vermehrung/Wartung von HL-60 Zellen entlüftet Kultur 5 x 106 Zellen in HL-60 Zellkulturmedien 75 cm2 10 mL Fläschchen bei 37 ° C und 5 % CO2. Die Passage Zellen alle 3?...

<ol>
	<li>Romero-Steiner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+an+opsonophagocytic+assay+for+the+measurement+of+functional+antibody+activity+against+Streptococcus+pneumoniae+using+differentiated+HL-60+cells.">Standardization of an opsonophagocytic assay for the measurement of functional antibody activity against Streptococcus pneumoniae using differentiated HL-60 cells.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 4 (4), 415-422 (1997).</li><li>Nanra, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsular+polysaccharides+are+an+important+immune+evasion+mechanism+for+Staphylococcus+aureus.">Capsular polysaccharides are an important immune evasion mechanism for Staphylococcus aureus.</a> Human Vaccines and Immunotherapeutics. 9 (3), 480-487 (2013).</li><li>Ishibashi, K., Yamaguchi, O., Shiraiwa, Y., Ogihara, M., Shigeta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+therapy+of+Pseudomonas+aeruginosa+pyelonephritis+in+neutropenic+mice+with+human+antilipopolysaccharide+monoclonal+antibody+and+cefsulodin.">Combination therapy of Pseudomonas aeruginosa pyelonephritis in neutropenic mice with human antilipopolysaccharide monoclonal antibody and cefsulodin.</a> Journal of Urology. 155 (6), 2094-2097 (1996).</li><li>Middleton, D. R., Paschall, A. V., Duke, J. A., Avci, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+Hydrolysis+of+Pneumococcal+Capsular+Polysaccharide+Renders+the+Bacterium+Vulnerable+to+Host+Defense.">Enzymatic Hydrolysis of Pneumococcal Capsular Polysaccharide Renders the Bacterium Vulnerable to Host Defense.</a> Infection and Immunity. , (2018).</li><li>Baker, C. J., Noya, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+use+of+intravenous+immune+globulin+for+group+B+streptococcal+infection.">Potential use of intravenous immune globulin for group B streptococcal infection.</a> Reviews of Infectious Diseases. 12, 476-482 (1990).</li><li>Tian, H., Weber, S., Thorkildson, P., Kozel, T. R., Pirofski, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+opsonic+and+nonopsonic+serotype+3+pneumococcal+capsular+polysaccharide-specific+monoclonal+antibodies+against+intranasal+challenge+with+Streptococcus+pneumoniae+in+mice.">Efficacy of opsonic and nonopsonic serotype 3 pneumococcal capsular polysaccharide-specific monoclonal antibodies against intranasal challenge with Streptococcus pneumoniae in mice.</a> Infection and Immunity. 77 (4), 1502-1513 (2009).</li><li>Parameswarappa, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Semi-synthetic+Oligosaccharide+Conjugate+Vaccine+Candidate+Confers+Protection+against+Streptococcus+pneumoniae+Serotype+3+Infection.">A Semi-synthetic Oligosaccharide Conjugate Vaccine Candidate Confers Protection against Streptococcus pneumoniae Serotype 3 Infection.</a> Cell Chemical Biology. 23 (11), 1407-1416 (2016).</li><li>Jackson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomized+clinical+trial+of+a+single+versus+a+double+dose+of+13-valent+pneumococcal+conjugate+vaccine+in+adults+55+through+74+years+of+age+previously+vaccinated+with+23-valent+pneumococcal+polysaccharide+vaccine.">Randomized clinical trial of a single versus a double dose of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in adults 55 through 74 years of age previously vaccinated with 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine.</a> Vaccine. 36 (5), 606-614 (2018).</li><li>Cywes-Bentley, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+to+a+conserved+antigenic+target+is+protective+against+diverse+prokaryotic+and+eukaryotic+pathogens.">Antibody to a conserved antigenic target is protective against diverse prokaryotic and eukaryotic pathogens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (24), 2209-2218 (2013).</li><li>Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+HL-60+cell+line+to+measure+opsonic+capacity+of+pneumococcal+antibodies.">Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).</li><li>Collins, S. J., Ruscetti, F. W., Gallagher, R. E., Gallo, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+differentiation+of+human+promyelocytic+leukemia+cells+induced+by+dimethyl+sulfoxide+and+other+polar+compounds.">Terminal differentiation of human promyelocytic leukemia cells induced by dimethyl sulfoxide and other polar compounds.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 75 (5), 2458-2462 (1978).</li><li>Melnick, N., Rajam, G., Carlone, G. M., Sampson, J. S., Ades, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+novel+therapeutic+approach+to+treating+severe+pneumococcal+infection+using+a+mouse+model.">Evaluation of a novel therapeutic approach to treating severe pneumococcal infection using a mouse model.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 16 (6), 806-810 (2009).</li><li>Dwyer, M., Gadjeva, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opsonophagocytic+assay.">Opsonophagocytic assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1100, 373-379 (2014).</li><li>Burton, R. L., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+fourfold+multiplexed+opsonophagocytosis+assay+for+pneumococcal+antibodies+against+additional+serotypes+and+discovery+of+serological+subtypes+in+Streptococcus+pneumoniae+serotype+20.">Development of a fourfold multiplexed opsonophagocytosis assay for pneumococcal antibodies against additional serotypes and discovery of serological subtypes in Streptococcus pneumoniae serotype 20.</a> Clinical and Vaccine Immunololgy. 19 (6), 835-841 (2012).</li><li>Clarke, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-cost,+high-throughput,+automated+counting+of+bacterial+colonies.">Low-cost, high-throughput, automated counting of bacterial colonies.</a> Cytometry Part A. 77 (8), 790-797 (2010).</li><li>Aanei, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Database-guided+Flow-cytometry+for+Evaluation+of+Bone+Marrow+Myeloid+Cell+Maturation.">Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e57867 (2018).</li><li>Hirz, T., Dumontet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Isolation+and+Analysis+to+Determine+their+Role+in+Lymphoma+Cell+Sensitivity+to+Therapeutic+Agents.">Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents.</a> Journal of Visulaized Experiments. (109), e53846 (2016).</li><li>Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+annexin+V/propidium+iodide+apoptosis+assay+for+accurate+assessment+of+cell+death.">Modified annexin V/propidium iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), 2597 (2011).</li><li>Blair, O. C., Carbone, R., Sartorelli, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+HL-60+promyelocytic+leukemia+cells:+simultaneous+determination+of+phagocytic+activity+and+cell+cycle+distribution+by+flow+cytometry.">Differentiation of HL-60 promyelocytic leukemia cells: simultaneous determination of phagocytic activity and cell cycle distribution by flow cytometry.</a> Cytometry. 7 (2), 171-177 (1986).</li><li>Middleton, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+the+Streptococcus+pneumoniae+type+3+capsule-specific+glycoside+hydrolase+of+Paenibacillus+species+32352.">Identification and characterization of the Streptococcus pneumoniae type 3 capsule-specific glycoside hydrolase of Paenibacillus species 32352.</a> Glycobiology. 28 (2), 90-99 (2018).</li></ol>

OPKAs dienen die entscheidende Rolle bei der Beurteilung der Antikörper-vermittelten Immunantwort induziert durch Impfungen6,8. Die Hauptbedeutung dieser vereinfachten OPKA ist die Anpassungsfähigkeit der Bedingungen getestet werden (d. h., Antikörper, Enzym-Behandlungen). In diesem Sinne während dieser Assay verwendet werden kann, um den Beitrag von Opsonins (z.B. Antikörper) in Phagozytose, testen sie auch lässt sich beurteilen, Wege zur Überwindung von ...

Die Opsonophagocytic töten Assay (OPKA) ist ein wichtiges Werkzeug für spätere Änderungen der Immunantwort und Funktion Änderungen in bakteriellen Struktur oder Funktion verlinken. Als solche häufig dient es als eine ergänzende Assay immun-basierte Wirksamkeit von Antikörper-Therapien, Impfstoffkandidaten, Enzym-Optimierung zu bestimmen. In-vivo-Tests sind notwendig, um effektive Räumung oder Schutz in eine bakterielle Infektion-Modell zu bestimmen, kann die OPKA verwendet werden, um immun Beitrag zur bakteriellen Zelltod zu den grundlegende Komponenten bewerten: Bakterien, Immunzellen, und experimentelle Behandlungen. Frühere Studien haben gezeigt, dass die OPKAs geändert und für eine Vielzahl von Bakterien und Serotypen, darunter Streptococcus Pneumoniae1, Staphylococcus Aureus2, Pseudomonas Aeruginosa3verwendet werden kann. Darüber hinaus können diese optimierten Assays verwendet werden, um verschiedene experimentelle Behandlungen, einschließlich der Möglichkeit eines Enzyms, das Bakterium zugänglicher zu ergänzen-vermittelten immunen Zellen4 und Antikörper-Behandlungen zur Verbesserung machen bewerten Opsonization5. Klassisch, OPKA Assay erfolgreich eingesetzt in der Grundlagenforschung und klinische Forschung Einstellungen als ein aussagekräftiger Indikator für Schutz induziert durch Erreger-spezifischen Antikörper6,7,8,9 .
Verschiedene Arten von Immunzellen können zur Beurteilung der Opsonophagocytic töten verwendet werden. Eine häufig verwendete phagocytic Bevölkerung ist der HL-60 menschlichen leukämischen Zell-Linie. Diese Zelllinie kann als inaktivierte Promyelocytes in Kultur gehalten werden; jedoch können sie in verschiedene aktivierte Zustände über verschiedene Drogen Behandlungen10,11unterschieden werden. Behandlung von HL60 mit N, N-Dimethylformamid unterscheidet die Zellinie in aktivierten Neutrophilen mit starken phagocytic Aktivität11. Während HL-60 Zellen optimiert wurden und werden häufig für die Phagozytose Assays10verwendet, können andere primäre polymorphkernigen Leukozyten als immun Arm der Experiment-12verwendet werden.
Darüber hinaus können diese Assays vereinfachte13 oder14 betrachten mehrere Antibiotika-resistente Bakterienstämme der zu prüfenden gemultiplext. Die Multiplex-Methode worden eher möglich durch die Entwicklung von Software erzielt, die effizient bakterielle Koloniebildenden Einheiten (KBE) pro Spot auf einem Agar-Platte15zählen kann. Hier beschreiben wir eine optimierte Methode mit ein Bakterienstamm, HL-60-Zellen, Baby-Kaninchen-Ergänzung und Blutagar Platten. Mit dieser Methode können mehrere Behandlungen schnell beurteilt werden, um spezifische Forschung Fragen auf wie der angeborenen Immunantwort auf bakterielle Infektion moduliert werden kann.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:636px;" width="637">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Annexin V (APC conjugated)</td>
			<td style="width:147px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">640919</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">anti-CD35, human (PE conjugated)</td>
			<td style="width:147px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">333405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">anti-CD71, human (PE conjugated)</td>
			<td style="width:147px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">334105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:204px;">bacterial strain to be used (ie, Streptococcus pneumoniae, WU2)</td>
			<td style="width:147px;">Bacterial Respiratory Reference Laboratory (Dr. Moon Nahm)&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">blood agar plates</td>
			<td>Hardy Diagnostic</td>
			<td>A10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Fetal Clone serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30080.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9012-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">HL-60 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">IgG Isotype Control (PE conjugated)</td>
			<td style="width:147px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">400907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">N,N-dimethylformamide (DMF)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>UN2265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">propidium iodide</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">RPMI media with L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

opsonophagocytic killing assay to assess immunological responses against bacterial pathogens

Ein wesentlicher Aspekt der Immunantwort auf bakterielle Besiedlung des Gastgebers ist Phagozytose. Ein Opsonophagocytic-Tötung-Assay (OPKA) ist ein experimentelles Verfahren, in dem phagocytic Zellen mit bakteriellen Einheiten Co kultiviert sind. Die Immunzellen werden phagozytieren und töten die Bakterienkulturen in einer Ergänzung-abhängigen Weise. Die Effizienz der immun-vermittelte Zelle Tötung ist eine Reihe von Faktoren abhängig und kann verwendet werden, um festzustellen, wie die verschiedenen bakteriellen Kulturen zu vergleichen, in Bezug auf Widerstand zum Zelltod führt. Auf diese Weise kann die Wirksamkeit von potenziellen immun-basierten Therapeutika gegen bestimmte Bakterienstämme und/oder Serotypen beurteilt werden. In diesem Protokoll beschreiben wir eine vereinfachte OPKA, die grundlegende Kulturbedingungen und Zelle zählen, um bakterielle Zellviabilität nach Kokultur mit Behandlung und HL-60 Immunzellen bestimmen verwendet. Diese Methode wurde erfolgreich mit einer Reihe von verschiedenen Pneumokokken-Serotypen, Kapsel und Acapsular Stämme und andere Bakterienarten genutzt. Die Vorteile dieses OPKA-Protokolls sind seine Einfachheit, Vielseitigkeit, (da dieser Test auf Antikörper Behandlungen wie Opsonins nicht beschränkt), und Minimierung von Zeit und Reagenzien zu grundlegenden experimentelle Gruppen zu beurteilen.

Validierung von HL-60 Differenzierung sollte vor Beginn der OPKA durchgeführt werden. Dies kann erreicht werden mit Durchflusszytometrie um zu bestimmen, die extrazellulären Ausdruck von CD11b, CD35, CD71 und annexin V (Abbildung 1). Propidium Jodid kann auch als Lebensfähigkeit Marker verwendet werden. Nach der Behandlung mit DMF für 3 Tage, Ausdruck der CD35 erhöht werden sollte (≥55 % aller Zellen) und Ausdruck der CD71 verringert werden sollte (≤20 % aller Zellen). Der Prozentsa...

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Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

Dieser Opsonophagocytic Tötung Assay wird verwendet, um die Fähigkeit der phagocytic Immunzellen zur Beantwortung und töten Bakterien basierend auf verschiedene Behandlungen und/oder Bedingungen zu vergleichen. Klassisch, dient dieser Assay als der Goldstandard für die Beurteilung der Effektor-Funktionen von Antikörpern gegen ein Bakterium als Opsonin erhoben.

Opsonophagocytic Tötung Assay Immunreaktionen gegen bakterielle Krankheitserreger zu bewerten

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Dieser Test verbindet die Modulation der bakteriellen Struktur und Funktion mit immunzellbasierter antibakterieller Aktivität. Als solche kann ein wichtiges Immuntherapeutika einer potenziellen Behandlung bei der Bestimmung der Wahrscheinlichkeit einer verbesserten bakterielleclearance beurteilt werden. Opsonophagozytäre Tötungassay dient traditionell als Goldstandard für die Bewertung effektiver Funktionen von Antikörpern, die gegen das Bakterium als obsonant erhoben werden.Dieses Protokoll bietet Einfachheit und Vielseitigkeit gegenüber bestehenden standardisierten Assays mit hohem Durchsatz. In diesem Protokoll untersuchen wir die Auswirkungen einer medikamentösen Behandlung auf Streptokokken-Pneumonie und wie diese Effekte zu einer verbesserten Phagozytose des Bakteriums führen. Hier wenden wir das OPKA auf Streptokokken-Lungenentzündungszellen an.Dieses Protokoll kann jedoch angenommen werden, um die phagozytische Tötung anderer Krankheitserreger durch Immunzellen zu bewerten. Widmen Sie sich Zeit, um die Bakterienbestände zu optimieren und sicherzustellen, dass die zu zählenden endgültigen KBE in den optimalen Bereich fallen. Wir empfehlen dringend, die Durchflusszytometrie zu verwenden, um sicherzustellen, dass HL60-Zellen lebensfähig und aktiv sind und verschiedene Kulturbedingungen ausprobieren, um funktionell aktive Zellen zu gewährleisten.Die visuelle Demonstration wird ein besseres Verständnis dafür vermitteln, wie die Probe plattiert werden sollte und wie zählbare Proben erreicht werden können. Zu Beginn bereiten SIE HL60 Zellkultur-Medien bestehend aus 500 Milliliter RPMI ergänzt mit L-Glutamin und 15 Milliliter Hitze inaktiviert fetale Rinderserum. Zur Vermehrung und Wartung von HL60-Zellen, Kultur fünf Millionen Zellen in 10 Milliliter HL60 Zellkultur Medien in 75 Quadratzentimeter entlüfteten Kolben bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid.Um Arbeitsbestände an HL60-Zellen zu erzeugen, fügen Sie etwa eine Million Zellen pro Milliliter in HL60-Kulturmedien, ergänzt mit 10%dimethylsulfoxid, in einen Milliliter kryogenen Röhren ein. Zur Unterscheidung von HL60-Zellen, Kultur 1,5 mal 10 zu den sieben Zellen in 15 Milliliter n.HL60 Zellkultur Medien ergänzt mit 0,6%DMF in sterilen Filter gekappt 75 Quadratzentimeter Kolben bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für drei Tage vor OPKA. Zur Vorbereitung der bakteriellen Bestandsproben den WU2-Bakterienstamm in einer geeigneten Brühe etwa zwei bis vier Stunden bei 37 Grad Celsius anbauen.Als nächstes pellet die Bakterien durch Zentrifugation bei sechstausend Mal G für zwei Minuten und suspendieren die Zellen in 10 bis 30 Milliliter 15%Glycerin in der entsprechenden Brühe. Aliquot die Bakterienkultur in sterile 1,5 Milliliter Zentrifugenrohre und lagern bei 80 Grad Celsius. Als nächstes tauen Sie eine Durchstechflasche mit Bakterienvorräten in einem 37 Grad Celsius Wasserbad auf.Pellet die Bakterienzellen und resuspendieren in 500 Mikroliter OBB unter sterilen Bedingungen. Plattenverdünnungen des unbehandelten Bakterienbestandes auf Blutagarplatten und Kultur der Platten über Nacht bei 30 Grad Celsius. Zählen Sie nach dem Inkubationsschritt die Kolonien für jede Verdünnung unbehandelter Bakterienbestände, die mit HL60-Zellen kokultiviert werden.Zeichnen Sie auf, welche Verdünnung von Bakterien die optimale Anzahl zählbarer Kolonien für zukünftige OPKAs mit diesem Bakterienbestand ergibt. Eine Röhre mit Bakterienbestand auftauen. Pelletbakterien bei sechstausend Mal G für zwei Minuten und resuspendieren das Zellpellet in OBB bei der optimalen Verdünnung im vorherigen Schritt erhalten.Pipette 10 Mikroliter der resuspendierten bakteriellen Verdünnung pro Brunnen in einer runden unteren 96 Brunnenzellkulturplatte. Fügen Sie dann 20 Mikroliter eines geeigneten Antikörpers oder einer medikamentösen Behandlung zu jedem experimentellen Brunnen in doppelter Weise hinzu. Für Steuerbrunnen verwenden Sie 1XPBS oder OBB, abhängig von dem Puffer, der für die Behandlungsbrunnen verwendet wird.Schütteln Sie die Probenplatte bei ca. 90 Umdrehungen pro Minute bei Raumtemperatur für eine Stunde. Um die HL60 differenzierten Zellen zu ernten, die drei Tage zuvor mit DMF behandelt werden, pellet die Zellen drei Minuten lang bei 500 mal G. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet mit mindestens 10 Millilitern 1XPBS.Pellet die gewaschenen Zellen bei 500 mal G für drei Minuten. Entsorgen Sie den Überstand, und setzen Sie die Zellen in OBB erneut aus. Fügen Sie steriles unverdünntes Babykaninchenserum in einem ein bis fünf Endvolumen hinzu.Nach einer Stunde Bakterienkultur, teilen Sie jede Probe in doppelte Brunnen für zwei Gruppen. Als nächstes fügen Sie 50 Mikroliter der HL60-Ergänzungsmischung zu jedem experimentellen Satz von Brunnen und 50 Mikroliter OBB nur zu den Brunnen von Bakterien hinzu. Schütteln Sie die 96-Well-Platte bei 37 Grad Celsius für eine Stunde.Um Plattenproben, verdünnen Sie jeden Brunnen mit OBB in einem bis fünf Endvolumen, so dass jede Probe ein Volumen von mindestens 50 Mikroliter hat. Als nächstes Pipette 50 Mikroliter jeder Probe direkt auf einen bestimmten Bereich einer bakteriellen Kulturplatte, um einen angemessenen Abstand zwischen den Proben zu gewährleisten. Bedecken und Proben ca. 15 Minuten bei Raumtemperatur trocknen lassen.Umkehren Sie die Teller und Kultur über Nacht bei 30 Grad Celsius. Alternativ können Kulturplatten in anaeroben Gläsern testen, ob anoxische Bedingungen das Bakterienwachstum beeinflussen oder um die Morphologie zu kontrollieren. Zählen Sie nach der Nachtkultur die Kolonien in jedem ausgewiesenen Stichprobenbereich, und analysieren Sie die Daten, indem Sie die Anzahl der lebenden Zellen in jedem Satz mit den entsprechenden Steuerelementen vergleichen.Die schwierigsten Aspekte bei der Ersteinführung dieser Technik werden wahrscheinlich die Optimierung der Ausgangs-KGE des Bakterienbestands sein und sicherstellen, dass die HL60-Zellen effektiv differenziert werden. Vor dem Start des OPKA wurde die HL60-Differenzierung mittels Durchflusszytometrie mit Propidiumjodid als Lebensfähigkeitsmarker validiert. Nach der Behandlung mit DMF für drei Tage wurde die Expression von CD35 erhöht und die Expression von CD71 verringert.Die durchschnittlichen Prozentsätze der bakteriellen KBE in den HL60 behandelten Gruppen im Vergleich zu den entsprechenden nicht-HL60 behandelten Gruppen wurden verwendet, um das Überleben der bakteriellen Zell verschiedener Behandlungen zu vergleichen. Die Ergebnisse zeigten, dass bei einer wirksamen Behandlung die Anzahl der Kolonien zwischen DER HL60-Kokultur und den wenigen HL60-Zellen unterschiedlich war, was auf eine effizientere Phagozytose hindeutet. Die Ergebnisse zeigten, dass, wenn die bakterielle Verdünnung nicht optimiert wurde oder das Koloniewachstum nach der Beschichtung nicht sorgfältig beobachtet wurde, das Überwuchern der Kolonien eine genaue Zählung der Kolonien verhindern konnte.Das Wichtigste, was sie beim Versuch dieses Verfahrens beachten sollten, ist, die bakterielle Inkubation sorgfältig zu überwachen, um ein Überwuchern der KBE zu vermeiden. In-vivo-Assays können verwendet werden, um eine effektive bakterielle Clearance innerhalb eines Wirts zu beschüben. Diese Assays können verwendet werden, um die mit dem OPKA beobachtete Immunwirksamkeit zu bestätigen, die auf menschliche oder tierische Modelle übertragbar sind.Der opsonophagozytäre Tötungstest wurde in früheren bedeutenden Studien mit großer Wirkung verwendet, um antibakterielle Therapien mit phagostischen Immunantworten zu verknüpfen. Die Arbeit mit bakteriellen Krankheitserregern kann gefährlich sein. Bitte tragen Sie während dieses Testes jederzeit eine persönliche Schutzausrüstung.

Research

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Forschung

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Mit einem Pan-Viral Microarray-Assay (Virochip) zur klinischen Proben, die für virale Erreger Bildschirm

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

&quot;Bioluminescent &#39;Reporter Phage für den Nachweis von Kategorie A bakteriellen Erregern

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Die Infektion von Zebrafisch-Embryos mit Intrazelluläre bakterielle Krankheitserreger

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Aufzucht und Injektion von<em&gt; Manduca sexta</em&gt; Larven zu bakteriellen Virulenz beurteilen

Manduca sexta, commonly known as the tobacco hornworm, is considered a significant agricultural pest, feeding on solanaceous plants including tobacco and ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Application of Long-term cultured Interferon-ÃƒÅ½Ã‚Â³ Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Anwendung von Langzeit kultiviert Interferon-γ Enzyme-linked Immunospot Assay zur Beurteilung Effektor und Gedächtnis-T-Zell-Antworten in Cattle

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

Identifizierung von Rare bakteriellen Erregern von 16S rRNA-Gen-Sequenzierung und MALDI-TOF-MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...