Name: opsonophagocytic killing assay to assess immunological responses against bacterial pathogens
Uploaded: 2019-04-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens at JoVE.com

אנו מודים ד ר מון Nahm (אוניברסיטת אלבמה ברמינגהם) על שלו בפז סיוע בהקמת OPKA מבחני במעבדה שלנו. עבודה זו נתמכה על ידי מוסדות לאומיים של בריאות גרנט 1R01AI123383-01A1 כדי FYA.

1. תרבות, בידול, ובדיקת התאים HL-60

<ol><li>להכין HL-60 תא תרבות המדיה המורכבת של 500 מ"ל RPMI עם-גלוטמין ו- 50 מ ל חום-לא פעיל העובר שור סרום. אל תוסיף אנטיביוטיקה כמו זה משפיע על התמיינות של התאים HL-60.</li>
	<li>עבור הפצת/אחזקה של תאים HL-60, פרקו תרבות 5 x 106 תאים 10 מ"ל של HL-60 תא תרבות התקשורת 75 ס מ2 מ?...

<ol>
	<li>Romero-Steiner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+an+opsonophagocytic+assay+for+the+measurement+of+functional+antibody+activity+against+Streptococcus+pneumoniae+using+differentiated+HL-60+cells.">Standardization of an opsonophagocytic assay for the measurement of functional antibody activity against Streptococcus pneumoniae using differentiated HL-60 cells.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 4 (4), 415-422 (1997).</li><li>Nanra, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsular+polysaccharides+are+an+important+immune+evasion+mechanism+for+Staphylococcus+aureus.">Capsular polysaccharides are an important immune evasion mechanism for Staphylococcus aureus.</a> Human Vaccines and Immunotherapeutics. 9 (3), 480-487 (2013).</li><li>Ishibashi, K., Yamaguchi, O., Shiraiwa, Y., Ogihara, M., Shigeta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+therapy+of+Pseudomonas+aeruginosa+pyelonephritis+in+neutropenic+mice+with+human+antilipopolysaccharide+monoclonal+antibody+and+cefsulodin.">Combination therapy of Pseudomonas aeruginosa pyelonephritis in neutropenic mice with human antilipopolysaccharide monoclonal antibody and cefsulodin.</a> Journal of Urology. 155 (6), 2094-2097 (1996).</li><li>Middleton, D. R., Paschall, A. V., Duke, J. A., Avci, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+Hydrolysis+of+Pneumococcal+Capsular+Polysaccharide+Renders+the+Bacterium+Vulnerable+to+Host+Defense.">Enzymatic Hydrolysis of Pneumococcal Capsular Polysaccharide Renders the Bacterium Vulnerable to Host Defense.</a> Infection and Immunity. , (2018).</li><li>Baker, C. J., Noya, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+use+of+intravenous+immune+globulin+for+group+B+streptococcal+infection.">Potential use of intravenous immune globulin for group B streptococcal infection.</a> Reviews of Infectious Diseases. 12, 476-482 (1990).</li><li>Tian, H., Weber, S., Thorkildson, P., Kozel, T. R., Pirofski, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+opsonic+and+nonopsonic+serotype+3+pneumococcal+capsular+polysaccharide-specific+monoclonal+antibodies+against+intranasal+challenge+with+Streptococcus+pneumoniae+in+mice.">Efficacy of opsonic and nonopsonic serotype 3 pneumococcal capsular polysaccharide-specific monoclonal antibodies against intranasal challenge with Streptococcus pneumoniae in mice.</a> Infection and Immunity. 77 (4), 1502-1513 (2009).</li><li>Parameswarappa, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Semi-synthetic+Oligosaccharide+Conjugate+Vaccine+Candidate+Confers+Protection+against+Streptococcus+pneumoniae+Serotype+3+Infection.">A Semi-synthetic Oligosaccharide Conjugate Vaccine Candidate Confers Protection against Streptococcus pneumoniae Serotype 3 Infection.</a> Cell Chemical Biology. 23 (11), 1407-1416 (2016).</li><li>Jackson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomized+clinical+trial+of+a+single+versus+a+double+dose+of+13-valent+pneumococcal+conjugate+vaccine+in+adults+55+through+74+years+of+age+previously+vaccinated+with+23-valent+pneumococcal+polysaccharide+vaccine.">Randomized clinical trial of a single versus a double dose of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in adults 55 through 74 years of age previously vaccinated with 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine.</a> Vaccine. 36 (5), 606-614 (2018).</li><li>Cywes-Bentley, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+to+a+conserved+antigenic+target+is+protective+against+diverse+prokaryotic+and+eukaryotic+pathogens.">Antibody to a conserved antigenic target is protective against diverse prokaryotic and eukaryotic pathogens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (24), 2209-2218 (2013).</li><li>Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+HL-60+cell+line+to+measure+opsonic+capacity+of+pneumococcal+antibodies.">Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).</li><li>Collins, S. J., Ruscetti, F. W., Gallagher, R. E., Gallo, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+differentiation+of+human+promyelocytic+leukemia+cells+induced+by+dimethyl+sulfoxide+and+other+polar+compounds.">Terminal differentiation of human promyelocytic leukemia cells induced by dimethyl sulfoxide and other polar compounds.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 75 (5), 2458-2462 (1978).</li><li>Melnick, N., Rajam, G., Carlone, G. M., Sampson, J. S., Ades, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+novel+therapeutic+approach+to+treating+severe+pneumococcal+infection+using+a+mouse+model.">Evaluation of a novel therapeutic approach to treating severe pneumococcal infection using a mouse model.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 16 (6), 806-810 (2009).</li><li>Dwyer, M., Gadjeva, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opsonophagocytic+assay.">Opsonophagocytic assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1100, 373-379 (2014).</li><li>Burton, R. L., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+fourfold+multiplexed+opsonophagocytosis+assay+for+pneumococcal+antibodies+against+additional+serotypes+and+discovery+of+serological+subtypes+in+Streptococcus+pneumoniae+serotype+20.">Development of a fourfold multiplexed opsonophagocytosis assay for pneumococcal antibodies against additional serotypes and discovery of serological subtypes in Streptococcus pneumoniae serotype 20.</a> Clinical and Vaccine Immunololgy. 19 (6), 835-841 (2012).</li><li>Clarke, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-cost,+high-throughput,+automated+counting+of+bacterial+colonies.">Low-cost, high-throughput, automated counting of bacterial colonies.</a> Cytometry Part A. 77 (8), 790-797 (2010).</li><li>Aanei, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Database-guided+Flow-cytometry+for+Evaluation+of+Bone+Marrow+Myeloid+Cell+Maturation.">Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e57867 (2018).</li><li>Hirz, T., Dumontet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Isolation+and+Analysis+to+Determine+their+Role+in+Lymphoma+Cell+Sensitivity+to+Therapeutic+Agents.">Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents.</a> Journal of Visulaized Experiments. (109), e53846 (2016).</li><li>Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+annexin+V/propidium+iodide+apoptosis+assay+for+accurate+assessment+of+cell+death.">Modified annexin V/propidium iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), 2597 (2011).</li><li>Blair, O. C., Carbone, R., Sartorelli, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+HL-60+promyelocytic+leukemia+cells:+simultaneous+determination+of+phagocytic+activity+and+cell+cycle+distribution+by+flow+cytometry.">Differentiation of HL-60 promyelocytic leukemia cells: simultaneous determination of phagocytic activity and cell cycle distribution by flow cytometry.</a> Cytometry. 7 (2), 171-177 (1986).</li><li>Middleton, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+the+Streptococcus+pneumoniae+type+3+capsule-specific+glycoside+hydrolase+of+Paenibacillus+species+32352.">Identification and characterization of the Streptococcus pneumoniae type 3 capsule-specific glycoside hydrolase of Paenibacillus species 32352.</a> Glycobiology. 28 (2), 90-99 (2018).</li></ol>

OPKAs מגישים תפקידים חיוניים בהערכת תגובות חיסוניות מתווכת נוגדן המושרה על ידי חיסונים6,8. המשמעות העיקרית של OPKA פשוטה זו היא הסתגלות, בתנאים להיבדק (קרי, נוגדנים, אנזימים טיפולים, וכו '.). במובן זה, בעוד assay זה יכול לשמש כדי לבדוק את התרומה של opsonins (קרי, נוגדנים) phag...

Opsonophagocytic הורגת assay (OPKA) הוא כלי חיוני עבור קישור שינויים במבנה חיידקי או פונקציה לשינויים הבאים התגובה החיסונית ותפקוד. ככזה, הוא משמש לעתים קרובות כמו assay משלימים כדי לקבוע המבוסס על החיסון יעילותם של טיפולים נוגדן, חיסון מועמדים, אנזים אופטימיזציה, וכו '. בזמן מבחני ויוו נחוצים לקבוע סיווג יעיל או הגנה במודל של זיהום חיידקי, OPKA יכול לשמש כדי להעריך את התרומה חסין מוות תאים חיידקיים מרכיבים בסיסיים ביותר: חיידקים, תאי מערכת החיסון, וניסויים טיפולים. מחקרים קודמים הראו כי OPKAs יכול להיות שונה, המשמש למגוון רחב של חיידקים, אשר נגרמו מהזנים אליהם, כולל סטרפטוקוקוס pneumoniae1, Staphylococcus aureus2, Pseudomonas aeruginosa3. יתר על כן, מבחני ממוטבת אלה ניתן להשתמש כדי להעריך את ניסיוני טיפולים שונים, כולל היכולת של אנזים לגרום החיידק יותר נגיש4 תאים חיסוניים בתיווך המשלים וטיפולי נוגדנים כדי לשפר opsonization5. באופן קלאסי, OPKA assay בהצלחה שימש במחקר בסיסי וקליני הגדרות כמו מחוון עוצמה להגנה המושרה על ידי נוגדנים ספציפיים הפתוגן6,7,8,9 .
סוגים שונים של תאים חיסוניים עשוי לשמש להערכה של opsonophagocytic רצח. אוכלוסייה אחת phagocytic נפוץ הוא הקו תאי לוקמיה אדם HL-60. קו תא זה יכול להישמר כמו promyelocytes מוחלש בתרבות; עם זאת, הם יכול להיות מובחן המצבים השונים מופעל באמצעות סמים שונים טיפולים10,11. טיפול של HL60 עם N, N-dimethylformamide מבדילה את שורת התאים לתוך נויטרופילים הופעל עם פעילות חזקה phagocytic11. בעוד HL-60 תאים מוטבו משמשים לעתים קרובות אלה מבחני phagocytosis10, לויקוציטים אורך חייהם העיקרית אחרים יכול לשמש כזרוע המערכת החיסונית הניסוי12.
בנוסף, מבחני אלה יכולה להיות מפושטת13 או מרובב14 להסתכל על מספר זנים עמידים לאנטיביוטיקה של החיידק להיבדק. השיטה מרובבת נעשה יותר ריאלי דרך פיתוח תוכנה יעילה יכולה לסמוך מושבת חיידקים ויוצרים יחידות (CFUs) לכל נקודה על מטוס צלחת אגר15. כאן, אנו מתארים שיטה יעילה באמצעות אחד זן חיידקי, HL-60 תאים, המשלים ארנב התינוק פלטות אגר דם. בשיטה זו, טיפולים מרובים יכולים להיות מוערך במהירות כדי לטפל שאלות מחקר ספציפי על איך יכול להיות מאופנן התגובה החיסונית מולדת זיהום חיידקי.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:636px;" width="637">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Annexin V (APC conjugated)</td>
			<td style="width:147px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">640919</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">anti-CD35, human (PE conjugated)</td>
			<td style="width:147px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">333405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">anti-CD71, human (PE conjugated)</td>
			<td style="width:147px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">334105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:204px;">bacterial strain to be used (ie, Streptococcus pneumoniae, WU2)</td>
			<td style="width:147px;">Bacterial Respiratory Reference Laboratory (Dr. Moon Nahm)&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">blood agar plates</td>
			<td>Hardy Diagnostic</td>
			<td>A10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Fetal Clone serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30080.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9012-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">HL-60 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">IgG Isotype Control (PE conjugated)</td>
			<td style="width:147px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">400907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">N,N-dimethylformamide (DMF)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>UN2265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">propidium iodide</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">RPMI media with L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

opsonophagocytic killing assay to assess immunological responses against bacterial pathogens

היבט מרכזי של התגובה החיסונית מושבת חיידקים של הפונדקאי היא phagocytosis. Assay הריגה opsonophagocytic (OPKA) הוא תהליך ניסוי שבו תאים phagocytic הם תרבותי משותף עם יחידות חיידקי. תאים חיסוניים phagocytose ולהרוג את התרבויות חיידקי באופן תלוי-המשלים. היעילות של ההרג בתיווך החיסון התא תלויה במספר גורמים, והוא יכול לשמש כדי לקבוע כמה שונה בקטריאלי תרבויות להשוות מבחינת עמידות בפני מוות של תאים. בדרך זו, וצריך להעריך את היעילות של פוטנציאל הרפוי המבוסס על החיסון נגד זני חיידקים ספציפיים ו/או אשר נגרמו מהזנים אליהם. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים OPKA מפושטת אשר מנצל תנאים בסיסיים תרבות ותא לספור כדי לקבוע את הכדאיות תא החיידק אחרי תרבות משותפת עם הטיפול והתנאים תאים חיסוניים HL-60. בשיטה זו יש כבר מנוצל בהצלחה עם מספר שונה pneumococcal אשר נגרמו מהזנים אליהם, הסיבה acapsular זנים, ואת מיני חיידקים אחרים. היתרונות של פרוטוקול זה OPKA הם הפשטות שלה, צדדיות (כמו assay זו אינה מוגבלת נוגדן טיפולים כמו opsonins), ומינימיזציה של ריאגנטים להעריך קבוצות מעבדה בסיסית וזמן.

אימות של בידול HL-60 יש לבצעו לפני שמתחילים את OPKA. זה יכול להתבצע באמצעות cytometry זרימה כדי לקבוע את הביטוי חוץ-תאי של CD11b, CD35, CD71, annexin V (איור 1). יודיד Propidium יכול גם לשמש כסמן הכדאיות. לאחר מטופל עם DMF במשך 3 ימים, צריך להיות מוגברת הביטוי של CD35 (≥55% של כל התאים), ביטוי של CD71 צריך להיות י...

Watch this Scientific Journal Video about Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens at JoVE.com

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

שיטת ההרג הזה opsonophagocytic משמש כדי להשוות את היכולת של תאים חיסוניים phagocytic להגיב ולהרוג חיידקים בהתבסס על טיפולים שונים ו/או תנאים. באופן קלאסי, assay הזה משמש תקן זהב להערכת אפקטור פונקציות של נוגדנים שהועלו נגד חיידק בשם opsonin.

Opsonophagocytic הריגה הנועד להעריך תגובות אימונולוגי נגד פתוגנים חיידקיים

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

מקשה זו מקשרת אפנון של מבנה חיידקים ותפקוד לפעילות אנטיבקטריאלית מבוססת תאים חיסוניים. ככזה, אימונותרפיה מפתח של טיפול פוטנציאלי ניתן להעריך בקביעת הסבירות של שיפור סיווג חיידקי. בדיקת הרג Opsonophagocytic משמשת באופן מסורתי כתקן הזהב להערכת תפקודים יעילים של נוגדנים שהועלו נגד החיידק כאובסוננט.פרוטוקול זה מציע פשטות ורב-תכליתיות על-פני תפוקה גבוהה קיימת של תפוקה מתוקקנת. בפרוטוקול זה, אנו חוקרים את ההשפעות של טיפול תרופתי על דלקת ריאות סטרפטוקוקוס וכיצד השפעות אלה לתרגם phagocytosis משופרת של החיידק. כאן, אנו מיישמים את OPKA לתאי דלקת ריאות סטרפטוקוקוס.עם זאת פרוטוקול זה ניתן לאמץ כדי להעריך הרג phagocytic של פתוגנים אחרים על ידי תאים חיסוניים. להקדיש זמן כדי לייעל את מלאי החיידקים ולהבטיח CFUs הסופי להיספר ליפול בתוך הטווח האופטימלי. אנו ממליצים בחום להשתמש בציטומטריית זרימה כדי להבטיח שתאי HL60 יהיה בר קיימא ופעיל ותנסה תנאי תרבות שונים כדי להבטיח תאים פעילים מבחינה תפקודית.הדגמה חזותית תיתן הבנה טובה יותר של איך המדגם צריך להיות מצופה וכיצד להשיג דגימות לספירה. כדי להתחיל, להכין HL60 תאים תרבות מדיה מורכב 500 מיליליטר RPMI בתוספת L-גלוטמין ו 15 מיליליטר חום סרום לב עוברי מושבת. להפצה ותחזוקה של תאי HL60, תרבות חמישה מיליון תאים ב 10 מיליליטר של מדיה תרבות תא HL60 בבקבוקים 75 ס"מ רבועים אוורור ב 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוז פחמן דו חמצני.כדי ליצור מלאי עבודה של תאי HL60, הוסף כמיליון תאים למיליליטר במדיה התרבותית של HL60 בתוספת 10% דימתיל סולפוקסיד לצינור קריוגני מיליליטר אחד. כדי להבדיל בין תאי HL60, תרבות פי 1.5 10 לשבעת התאים ב-15 מיליליטר של מדיית תרבות תאים HL60 בתוספת 0.6% DMF במסנן סטרילי כתרים 75 בקבוקים רבועים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני במשך שלושה ימים לפני OPKA. כדי להכין את דגימות מלאי החיידקים, לגדל את זן חיידקי WU2 במרק מתאים במשך כשעתיים עד ארבע שעות ב 37 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, גלולה את החיידקים על ידי צנטריפוגה ב six,000 פעמים G במשך שתי דקות ו resuspend התאים ב 10 עד 30 מיליליטר של 15% גליצרול במרק המתאים. עליקוט את תרבות החיידקים לתוך סטרילי 1.5 צינורות צנטריפוגה מיליליטר ולאחסן ב 80 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להפשיר בקבוקון אחד של מלאי חיידקי באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.גלולה את התאים החיידקיים resuspend ב 500 microliters של OBB בתנאים סטריליים. דילול צלחת של מלאי חיידקי מטופל על צלחות אגר דם ותרבות הצלחות לילה ב 30 מעלות צלזיוס. לאחר שלב הדגירה, לספור את המושבות עבור כל דילול של מלאי חיידקי מטופל במשותף עם תאים HL60.שיא אשר דילול של חיידקים מניב את המספר האופטימלי של מושבות המחוז עבור OPKAs בעתיד עם מלאי חיידקי זה. להפשיר צינור אחד של מלאי חיידקי. חיידקי גלולה בששת אלפים פעמים G במשך שתי דקות ולתלות מחדש את גלולת התא ב OBB בדילול האופטימלי שהושג בשלב הקודם.פיפטה 10 microliters של דילול חיידקי resuspended ל הבאר בצלחת עגולה למטה 96 תרבות התא. לאחר מכן, להוסיף 20 microliters של נוגדן מתאים או טיפול תרופתי לכל באר ניסיונית כפולה. עבור בארות בקרה, השתמש 1XPBS או OBB בהתאם למאגר המשמש עבור בארות הטיפול.לנער את צלחת המדגם בכ 90 סל"ד בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת. כדי לקצור את HL60 תאים מובחנים המטופלים עם DMF שלושה ימים קודם לכן, גלולה את התאים ב 500 פעמים G במשך שלוש דקות. להשליך את supernatant ולשטוף את גלולה עם לפחות 10 מיליליטר של 1XPBS.גלולה התאים שטפו ב 500 פעמים G במשך שלוש דקות. השלך את העל-טבעי והתן מחדש את התאים ב- OBB. הוסף סרום ארנב תינוק סטרילי לא מזוהה בנפח של 1 עד 5 הימים.לאחר שעה אחת של תרבות חיידקית, מחלקים כל דגימה לתוך בארות כפולות עבור שתי קבוצות. לאחר מכן, הוסיפו 50 מיקרוליטרים של תערובת המשלימה HL60 לכל קבוצה ניסיונית של בארות ו-50 מיקרוליטרים של OBB ל הבארות של החיידקים בלבד. לנער את צלחת 96 גם ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.כדי לדגום את הלוח, לדלל כל באר עם OBB בנפח אחד עד חמישה סופיים, כך שלכל מדגם יש נפח של לפחות 50 מיקרוליטרים. לאחר מכן, פיפטה 50 microliters של כל מדגם ישירות על שטח המיועד של צלחת תרבות חיידקית, הבטחת ריווח הולם בין דגימות. מכסים ומאפשרים לדגימות להתייבש במשך כ-15 דקות בטמפרטורת החדר.להפוך את הצלחות והתרבות לילה ב 30 מעלות צלזיוס. לחלופין, צלחות תרבות בצנצנות אנאירוביות כדי לבדוק אם תנאים אנוקסיים משפיעים על צמיחת החיידקים או לשלוט במורפולוגיה. לאחר תרבות הלילה, ספור את המושבות בכל אזור לדוגמה ייעודי והמשך לניתוח נתונים על-ידי השוואת מספר התאים החיים בכל ערכה לפקדים המתאימים.ההיבטים הקשים ביותר של הקמת טכניקה זו בפעם הראשונה צפויים להיות אופטימיזציה CFUs ההתחלה של מלאי החיידקים, כמו גם להבטיח את התאים HL60 מובחנים ביעילות. לפני הפעלת OPKA, ההתבראות HL60 אומתה באמצעות ציטומטריית זרימה עם פרופידיום יודיד כסמן כדאיות. לאחר שטופלו ב- DMF במשך שלושה ימים, הביטוי של CD35 הוגדל והביטוי של CD71 ירד.האחוזים הממוצעים של CFUs חיידקי בקבוצות המטופלות HL60 בהשוואה לקבוצות המטופלות שאינן HL60 המקביל שימשו להשוואת הישרדות התא החיידקי של טיפולים שונים. התוצאות הראו כי עם טיפול יעיל, מספר המושבות היו שונים בין HL60 שיתוף תרבות ללא תאים HL60, המעיד על phagocytosis יעיל יותר. התוצאות הראו כי כאשר דילול החיידקים לא היה אופטימיזציה או צמיחת המושבה לא נצפתה בקפידה לאחר ציפוי, צמיחת יתר של המושבות יכול למנוע ספירה מדויקת של מושבות.הדבר החשוב ביותר שיש לזכור בעת ניסיון הליך זה הוא לפקח על הדגירה החיידקית בזהירות, כדי למנוע צמיחת יתר של CFUs. In vivo assays ניתן להשתמש כדי התחת אישור חיידקי יעיל בתוך המארח. ניתן להשתמש בתשקיף זה כדי לאשר את היעילות החיסונית שנצפתה עם OPKA ניתנים לתרגום למודלים של בני אדם או בעלי חיים.מוצנת ההרג האופוסופגוציטית שימשה להשפעה רבה במחקרים משמעותיים קודמים כדי לקשר טיפולים אנטיבקטריאליים לתגובות חיסוניות פאגוסטיות. עבודה עם פתוגנים חיידקיים יכולה להיות מסוכנת. אנא לבשו ציוד מגן אישי בכל עת במהלך ההתדגם הזה.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT): כימות Th-1 תגובות חיסוניות נגד אנטיגנים נייד מיקרוביאלית

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

אנטיגן ספציפי In vivo להרוג Assay באמצעות תווית CFSE תאים היעד

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation.  ...

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

מינהל פסיבי של נוגדנים חד שבטיים נגד ח capsulatum ואחרים פתוגנים פטרייתיים

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating ...

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

באמצעות assay הפאן ויראלי microarray (Virochip) אל מסך דוגמאות קליניות עבור פתוגנים ויראליים

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

&quot;Bioluminescent&quot; כתב phage לצורך זיהוי של קטגוריה פתוגנים חיידקיים

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

זיהום של עוברים דג הזברה עם פתוגנים חיידקיים תאיים

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

גידול והזרקה של<em&gt; Manduca סקסטה</em&gt; זחלים להערכה ארסית קטריאלי

Manduca sexta, commonly known as the tobacco hornworm, is considered a significant agricultural pest, feeding on solanaceous plants including tobacco and ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Application of Long-term cultured Interferon-ÃƒÅ½Ã‚Â³ Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

יישום של assay Immunospot לטווח ארוך אינטרפרון-γ התרבותי אנזים צמוד להערכת תגובות תא מפעיל וזיכרון T בבקר

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

זיהוי של חיידקים פתוגנים נדירים לפי 16S rRNA ג&#39;ין סידור MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...