Name: opsonophagocytic killing assay to assess immunological responses against bacterial pathogens
Uploaded: 2019-04-05T14:00:00
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हम डॉ चांद Nahm (अलबामा बर्मिंघम के विश्वविद्यालय) हमारी प्रयोगशाला में OPKA assays की स्थापना में उनकी अमूल्य सहायता के लिए धंयवाद । इस कार्य को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान द्वारा सहायता प्रदान की गई थी, जो FYA के लिए 1R01AI123383-01A1 है ।

1. संस्कृति, भेदभाव, और HL-६० कोशिकाओं का सत्यापन

<ol><li>HL-६० सेल संस्कृति मीडिया एल glutamine और ५० मिलीलीटर हीट-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ ५०० एमएल RPMI से बना तैयार । के रूप में इस HL-६० कोशिकाओं के भेदभाव ?...

<ol>
	<li>Romero-Steiner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+an+opsonophagocytic+assay+for+the+measurement+of+functional+antibody+activity+against+Streptococcus+pneumoniae+using+differentiated+HL-60+cells.">Standardization of an opsonophagocytic assay for the measurement of functional antibody activity against Streptococcus pneumoniae using differentiated HL-60 cells.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 4 (4), 415-422 (1997).</li><li>Nanra, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsular+polysaccharides+are+an+important+immune+evasion+mechanism+for+Staphylococcus+aureus.">Capsular polysaccharides are an important immune evasion mechanism for Staphylococcus aureus.</a> Human Vaccines and Immunotherapeutics. 9 (3), 480-487 (2013).</li><li>Ishibashi, K., Yamaguchi, O., Shiraiwa, Y., Ogihara, M., Shigeta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+therapy+of+Pseudomonas+aeruginosa+pyelonephritis+in+neutropenic+mice+with+human+antilipopolysaccharide+monoclonal+antibody+and+cefsulodin.">Combination therapy of Pseudomonas aeruginosa pyelonephritis in neutropenic mice with human antilipopolysaccharide monoclonal antibody and cefsulodin.</a> Journal of Urology. 155 (6), 2094-2097 (1996).</li><li>Middleton, D. R., Paschall, A. V., Duke, J. A., Avci, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+Hydrolysis+of+Pneumococcal+Capsular+Polysaccharide+Renders+the+Bacterium+Vulnerable+to+Host+Defense.">Enzymatic Hydrolysis of Pneumococcal Capsular Polysaccharide Renders the Bacterium Vulnerable to Host Defense.</a> Infection and Immunity. , (2018).</li><li>Baker, C. J., Noya, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+use+of+intravenous+immune+globulin+for+group+B+streptococcal+infection.">Potential use of intravenous immune globulin for group B streptococcal infection.</a> Reviews of Infectious Diseases. 12, 476-482 (1990).</li><li>Tian, H., Weber, S., Thorkildson, P., Kozel, T. R., Pirofski, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+opsonic+and+nonopsonic+serotype+3+pneumococcal+capsular+polysaccharide-specific+monoclonal+antibodies+against+intranasal+challenge+with+Streptococcus+pneumoniae+in+mice.">Efficacy of opsonic and nonopsonic serotype 3 pneumococcal capsular polysaccharide-specific monoclonal antibodies against intranasal challenge with Streptococcus pneumoniae in mice.</a> Infection and Immunity. 77 (4), 1502-1513 (2009).</li><li>Parameswarappa, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Semi-synthetic+Oligosaccharide+Conjugate+Vaccine+Candidate+Confers+Protection+against+Streptococcus+pneumoniae+Serotype+3+Infection.">A Semi-synthetic Oligosaccharide Conjugate Vaccine Candidate Confers Protection against Streptococcus pneumoniae Serotype 3 Infection.</a> Cell Chemical Biology. 23 (11), 1407-1416 (2016).</li><li>Jackson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomized+clinical+trial+of+a+single+versus+a+double+dose+of+13-valent+pneumococcal+conjugate+vaccine+in+adults+55+through+74+years+of+age+previously+vaccinated+with+23-valent+pneumococcal+polysaccharide+vaccine.">Randomized clinical trial of a single versus a double dose of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in adults 55 through 74 years of age previously vaccinated with 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine.</a> Vaccine. 36 (5), 606-614 (2018).</li><li>Cywes-Bentley, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+to+a+conserved+antigenic+target+is+protective+against+diverse+prokaryotic+and+eukaryotic+pathogens.">Antibody to a conserved antigenic target is protective against diverse prokaryotic and eukaryotic pathogens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (24), 2209-2218 (2013).</li><li>Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+HL-60+cell+line+to+measure+opsonic+capacity+of+pneumococcal+antibodies.">Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).</li><li>Collins, S. J., Ruscetti, F. W., Gallagher, R. E., Gallo, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+differentiation+of+human+promyelocytic+leukemia+cells+induced+by+dimethyl+sulfoxide+and+other+polar+compounds.">Terminal differentiation of human promyelocytic leukemia cells induced by dimethyl sulfoxide and other polar compounds.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 75 (5), 2458-2462 (1978).</li><li>Melnick, N., Rajam, G., Carlone, G. M., Sampson, J. S., Ades, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+novel+therapeutic+approach+to+treating+severe+pneumococcal+infection+using+a+mouse+model.">Evaluation of a novel therapeutic approach to treating severe pneumococcal infection using a mouse model.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 16 (6), 806-810 (2009).</li><li>Dwyer, M., Gadjeva, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opsonophagocytic+assay.">Opsonophagocytic assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1100, 373-379 (2014).</li><li>Burton, R. L., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+fourfold+multiplexed+opsonophagocytosis+assay+for+pneumococcal+antibodies+against+additional+serotypes+and+discovery+of+serological+subtypes+in+Streptococcus+pneumoniae+serotype+20.">Development of a fourfold multiplexed opsonophagocytosis assay for pneumococcal antibodies against additional serotypes and discovery of serological subtypes in Streptococcus pneumoniae serotype 20.</a> Clinical and Vaccine Immunololgy. 19 (6), 835-841 (2012).</li><li>Clarke, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-cost,+high-throughput,+automated+counting+of+bacterial+colonies.">Low-cost, high-throughput, automated counting of bacterial colonies.</a> Cytometry Part A. 77 (8), 790-797 (2010).</li><li>Aanei, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Database-guided+Flow-cytometry+for+Evaluation+of+Bone+Marrow+Myeloid+Cell+Maturation.">Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e57867 (2018).</li><li>Hirz, T., Dumontet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Isolation+and+Analysis+to+Determine+their+Role+in+Lymphoma+Cell+Sensitivity+to+Therapeutic+Agents.">Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents.</a> Journal of Visulaized Experiments. (109), e53846 (2016).</li><li>Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+annexin+V/propidium+iodide+apoptosis+assay+for+accurate+assessment+of+cell+death.">Modified annexin V/propidium iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), 2597 (2011).</li><li>Blair, O. C., Carbone, R., Sartorelli, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+HL-60+promyelocytic+leukemia+cells:+simultaneous+determination+of+phagocytic+activity+and+cell+cycle+distribution+by+flow+cytometry.">Differentiation of HL-60 promyelocytic leukemia cells: simultaneous determination of phagocytic activity and cell cycle distribution by flow cytometry.</a> Cytometry. 7 (2), 171-177 (1986).</li><li>Middleton, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+the+Streptococcus+pneumoniae+type+3+capsule-specific+glycoside+hydrolase+of+Paenibacillus+species+32352.">Identification and characterization of the Streptococcus pneumoniae type 3 capsule-specific glycoside hydrolase of Paenibacillus species 32352.</a> Glycobiology. 28 (2), 90-99 (2018).</li></ol>

Opkas एंटीबॉडी मध्यस्थता प्रतिरक्षा6,8टीकाकरण द्वारा प्रेरित प्रतिक्रियाओं का आकलन करने में आवश्यक भूमिकाओं की सेवा । इस सरलीकृत OPKA का मुख्य महत्व है (यानी, एंटीबॉडी, एंजाइम उपचार, आ?...

ऑप्सोनोफैगोसाइटिक हत्या परख (OPKA) बैक्टीरियल संरचना या प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और समारोह में बाद में परिवर्तन के लिए समारोह में परिवर्तन को जोड़ने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है । जैसे, यह अक्सर एक पूरक परख एंटीबॉडी उपचार, वैक्सीन उंमीदवारों, एंजाइम अनुकूलन, आदि के प्रतिरक्षा आधारित प्रभावकारिता निर्धारित करने के रूप में प्रयोग किया जाता है जबकि vivo assays में एक जीवाणु संक्रमण मॉडल में प्रभावी मंजूरी या सुरक्षा निर्धारित करने के लिए आवश्यक हैं, OPKA को सबसे बुनियादी घटकों में बैक्टीरियल कोशिका मौत के लिए प्रतिरक्षा योगदान का आकलन किया जा सकता है: बैक्टीरिया, प्रतिरक्षा कोशिकाओं, और प्रयोगात्मक उपचार. पिछले अध्ययनों से पता चला है कि opkas और संशोधित किया जा सकता है बैक्टीरिया और serotypes की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया, streptococcus निमोनियासहित1, staphylococcus2, स्यूडोमोनस aeruginosa3। इसके अलावा, इन अनुकूलित assays के लिए एक एंजाइम की क्षमता के लिए और अधिक सुलभ करने के लिए पूरक-मध्यस्थता प्रतिरक्षा कोशिकाओं4 और एंटीबॉडी उपचार में सुधार करने के लिए बनाने के लिए सहित विभिन्न प्रायोगिक उपचार, का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता opsonization5. प्रतिष्ठित, opka परख सफलतापूर्वक रोगज़नक़ द्वारा प्रेरित सुरक्षा के लिए एक शक्तिशाली संकेतक के रूप में बुनियादी और नैदानिक अनुसंधान सेटिंग्स में इस्तेमाल किया गया है विशिष्ट एंटीबॉडी6,7,8,9 .
प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार opsonophagocytic हत्या के आकलन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एक आम तौर पर इस्तेमाल किया भक्षकाण्विक जनसंख्या HL-६० मानव ल्यूसेमिक सेल लाइन है । इस सेल लाइन संस्कृति में निष्क्रिय promyelocytes के रूप में रखा जा सकता है; हालांकि, वे विभिंन दवा उपचार10,11के माध्यम से विभिंन सक्रिय राज्यों में विभेदित किया जा सकता है । N के साथ HL60 के उपचार, N-dimethylformamide मजबूत भकोसिटिक गतिविधि11के साथ सक्रिय न्यूट्रोफिल में सेल लाइन differentiates. जबकि HL-६० कोशिकाओं को अनुकूलित किया गया है और अक्सर इन phagocytosis के लिए इस्तेमाल किया जाता है10assays, अंय प्राथमिक polymorphonuclear ल्यूकोसाइट्स प्रयोग12के प्रतिरक्षा हाथ के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
इसके अतिरिक्त, इन assays13 या बहुसंकेतित14 सरलीकृत किया जा सकता है बैक्टीरिया के कई एंटीबायोटिक प्रतिरोधी उपभेदों को देखने के लिए परीक्षण किया जा करने के लिए । बहुसंकेतित विधि को सॉफ्टवेयर के विकास के माध्यम से अधिक व्यवहार्य बनाया गया है जो एक आगर प्लेट15पर बैक्टीरिया कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयूएस) को कुशलतापूर्वक गिन सकता है । यहां, हम एक सुव्यवस्थित विधि का वर्णन एक जीवाणु तनाव का उपयोग कर, HL-६० कोशिकाओं, बेबी खरगोश पूरक, और रक्त आगर प्लेटें । इस विधि के साथ, कई उपचार जल्दी कैसे बैक्टीरियल संक्रमण के लिए सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया modulated किया जा सकता है पर विशिष्ट अनुसंधान सवाल पता करने के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:636px;" width="637">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Annexin V (APC conjugated)</td>
			<td style="width:147px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">640919</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">anti-CD35, human (PE conjugated)</td>
			<td style="width:147px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">333405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">anti-CD71, human (PE conjugated)</td>
			<td style="width:147px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">334105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:204px;">bacterial strain to be used (ie, Streptococcus pneumoniae, WU2)</td>
			<td style="width:147px;">Bacterial Respiratory Reference Laboratory (Dr. Moon Nahm)&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">blood agar plates</td>
			<td>Hardy Diagnostic</td>
			<td>A10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Fetal Clone serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30080.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9012-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">HL-60 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">IgG Isotype Control (PE conjugated)</td>
			<td style="width:147px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">400907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">N,N-dimethylformamide (DMF)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>UN2265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">propidium iodide</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">RPMI media with L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

opsonophagocytic killing assay to assess immunological responses against bacterial pathogens

प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के एक प्रमुख पहलू को मेजबान के बैक्टीरियल उपनिवेशन के लिए phagocytosis है । एक ऑप्सोनोफेगोसाइटिक हत्या परख (OPKA) एक प्रायोगिक प्रक्रिया है जिसमें भक्षकाणु कोशिकाओं बैक्टीरियल इकाइयों के साथ सह-सभ्य हैं । प्रतिरक्षा कोशिकाओं phagocytose और एक पूरक निर्भर तरीके से जीवाणु संस्कृतियों को मार डालेगा । प्रतिरक्षा-मध्यस्थता कोशिका हत्या की दक्षता कारकों की एक संख्या पर निर्भर है और कैसे विभिन्न बैक्टीरिया संस्कृतियों कोशिका मौत के प्रतिरोध के संबंध में तुलना निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस तरह, संभावित प्रतिरक्षा आधारित चिकित्सा विज्ञान की प्रभावकारिता विशिष्ट बैक्टीरियल उपभेदों और/या serotypes के खिलाफ मूल्यांकन किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल में, हम एक सरलीकृत OPKA का वर्णन है कि बुनियादी संस्कृति की स्थिति और सेल को सह के बाद बैक्टीरियल सेल व्यवहार्यता का निर्धारण करने के लिए गिनती का इस्तेमाल-उपचार शर्तों और HL-६० प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ संस्कृति । इस विधि का सफलतापूर्वक विभिन्न न्यूमोकोकल सेरोटाइप, कैप्सूलर और अकास्लर उपभेदों, और अन्य जीवाणु प्रजातियों के साथ उपयोग किया गया है । इस OPKA प्रोटोकॉल के लाभ अपनी सादगी, बहुमुखी प्रतिभा है (के रूप में इस परख opsonins के रूप में एंटीबॉडी उपचार के लिए सीमित नहीं है), और समय और अभिकर्मकों के ंयूनतम करने के लिए बुनियादी प्रयोगात्मक समूहों का आकलन ।

HL-६० विभेद का विधिमान्यकरण OPKA प्रारंभ करने से पहले किया जाना चाहिए । यह प्रवाह cytometry का उपयोग कर पूरा किया जा सकता CD11b, CD35, CD71 की extracellular अभिव्यक्ति का निर्धारण, और एनेकिन वी (चित्रा 1) । प्रोपिडियम आयोड?...

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Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

इस ऑप्सोनोफेगोसाइटिक हत्या परख के लिए भगोसाइटिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं की क्षमता की तुलना करने के लिए जवाब और विभिंन उपचार और/ Classically, इस परख opsonin के रूप में एक जीवाणु के खिलाफ उठाया एंटीबॉडी के effector कार्यों का आकलन करने के लिए सोने के मानक के रूप में कार्य करता है ।

बैक्टीरियल रोगजनकों के खिलाफ Immunological प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए Opsonophagocytic हत्या परख

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

यह परख बैक्टीरियल संरचना के मॉड्यूलेशन को जोड़ता है और प्रतिरक्षा कोशिका आधारित जीवाणुरोधी गतिविधि के लिए कार्य करता है। इस प्रकार, बेहतर बैक्टीरियल क्लीयरेंस की संभावना निर्धारित करने में संभावित उपचार के एक प्रमुख इम्यूनोथेराप्यूटिक का आकलन किया जा सकता है। ओप्सोनोफेग्याजिस्ट हत्या परख पारंपरिक रूप से जीवाणु के खिलाफ उठाए गए एंटीबॉडी के प्रभावी कार्यों का आकलन करने के लिए सोने के मानक के रूप में कार्य करता है।यह प्रोटोकॉल मौजूदा उच्च थ्रूप मानक मानकीकृत परख पर सादगी और बहुमुखी प्रतिभा प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल में, हम स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया पर दवा उपचार के प्रभावों की जांच करते हैं और ये प्रभाव जीवाणु के बेहतर फैगोसाइटोसिस में कैसे अनुवाद करते हैं। यहां, हम स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया कोशिकाओं के लिए OPKA लागू होते हैं।हालांकि इस प्रोटोकॉल को प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा अन्य रोगजनकों की फैगोसाइटिक हत्या का आकलन करने के लिए अपनाया जा सकता है। बैक्टीरियल स्टॉक को अनुकूलित करने और इष्टतम सीमा के भीतर आने वाले अंतिम सीएफयू को सुनिश्चित करने के लिए समय समर्पित करें। हम दृढ़ता से प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करने की सलाह देते हैं ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि एचएल 60 कोशिकाएं व्यवहार्य और सक्रिय हैं और कार्यात्मक रूप से सक्रिय कोशिकाओं को सुनिश्चित करने के लिए विभिन्न संस्कृति स्थितियों की कोशिश कर रही हैं।दृश्य प्रदर्शन कैसे नमूना चढ़ाया जाना चाहिए और कैसे गिनती नमूनों को प्राप्त करने के लिए की एक बेहतर समझ दे देंगे । शुरू करने के लिए, एल-ग्लूटामाइन और 15 मिलीलीटर गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक 500 मिलीलीटर RPMI से बना HL60 सेल संस्कृति मीडिया तैयार करें। HL60 कोशिकाओं के प्रचार और रखरखाव के लिए, संस्कृति ५,०,० कोशिकाओं में HL60 सेल संस्कृति मीडिया के 10 मिलीलीटर में ७५ वर्ग सेंटीमीटर में ३७ डिग्री सेल्सियस और पांच प्रतिशत कार्बन डाइऑक्साइड पर फ्लास्क निकाल दिया ।एचएल60 कोशिकाओं के कामकाजी स्टॉक उत्पन्न करने के लिए, एचएल60 संस्कृति मीडिया में लगभग दस लाख कोशिकाओं को जोड़ें, जो एक मिलीलीटर क्रायोजेनिक ट्यूबों में 10% डाइमेथाइल सल्फोक्साइड के साथ पूरक हैं। HL60 कोशिकाओं में अंतर करने के लिए, संस्कृति 1.5 बार 10 HL60 सेल संस्कृति मीडिया के 15 मिलीलीटर में सात कोशिकाओं के लिए बाँझ फिल्टर में 0.6% DMF के साथ पूरक 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड के लिए तीन दिन के लिए OPKA से पहले छाया हुआ। बैक्टीरियल स्टॉक नमूनों को तैयार करने के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस पर लगभग दो से चार घंटे के लिए एक उपयुक्त शोरबा में WU2 जीवाणु तनाव बढ़ना।इसके बाद, दो मिनट के लिए छह हजार बार जी पर अपकेंद्रित्र द्वारा बैक्टीरिया को गोली दें और उचित शोरबा में 15% ग्लाइसरोल के 10 से 30 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें। बैक्टीरिया संस्कृति को बाँझ 1.5 मिलीलीटर सेंट्रलाइज ट्यूब में डालें और 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। इसके बाद, ३७ डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में बैक्टीरियल स्टॉक की एक शीशी को गल लें ।जीवाणु कोशिकाओं को गोली मारें और बाँझ परिस्थितियों में ओबीबी के 500 माइक्रोलीटर में पुनर्स्ल व्यय करें। रक्त आगर प्लेटों पर अनुपचारित जीवाणु स्टॉक की प्लेट कमजोर पड़ जाती है और 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्लेटों को संस्कृति । इनक्यूबेशन कदम के बाद, एचएल60 कोशिकाओं के साथ सह-संस्कारी अनुपचारित बैक्टीरियल स्टॉक के प्रत्येक कमजोर पड़ने के लिए उपनिवेशों की गणना करें।रिकॉर्ड जो बैक्टीरिया के कमजोर पड़ने इस जीवाणु स्टॉक के साथ भविष्य OPKAs के लिए गिनती कालोनियों की इष्टतम संख्या पैदावार । बैक्टीरियल स्टॉक की एक ट्यूब गल। दो मिनट के लिए छह हजार बार जी पर गोली बैक्टीरिया और पिछले कदम में प्राप्त इष्टतम कमजोर पड़ने पर ओबीबी में सेल पेलेट को फिर से खर्च करें।एक गोल नीचे 96 अच्छी तरह से सेल कल्चर प्लेट में प्रति अच्छी तरह से पुनर्नॉमित बैक्टीरियल कमजोर पड़ने के पिपेट 10 माइक्रोलीटर। फिर, डुप्लिकेट में प्रत्येक प्रयोगात्मक अच्छी तरह से एक उपयुक्त एंटीबॉडी या एक दवा उपचार के 20 माइक्रोलीटर जोड़ें। नियंत्रण कुओं के लिए, उपचार कुओं के लिए इस्तेमाल बफर के आधार पर 1XPBS या OBB का उपयोग करें ।एक घंटे के लिए कमरे के तापमान पर लगभग 90 आरपीएम पर नमूना प्लेट हिलाएं। तीन दिन पहले डीएमएफ के साथ इलाज किए जाने वाले एचएल60 विभेदित कोशिकाओं को फसल करने के लिए, कोशिकाओं को तीन मिनट के लिए 500 बार जी पर गोली दें। सुपरनेट को त्यागें और 1XPBS के कम से कम 10 मिलीलीटर के साथ गोली धोएं।तीन मिनट के लिए 500 बार जी पर धोया कोशिकाओं को गोली। सुपरनेट को त्यागें और ओबीबी में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें। एक से पांच अंतिम मात्रा में बाँझ बिना पतला बच्चे खरगोश सीरम जोड़ें।एक घंटे की बैक्टीरियल संस्कृति के बाद, प्रत्येक नमूने को दो समूहों के लिए डुप्लिकेट कुओं में विभाजित करें। इसके बाद, कुओं के प्रत्येक प्रयोगात्मक सेट में एचएल60 पूरक मिश्रण के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें और केवल बैक्टीरिया के कुओं में ओबीबी के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें। एक घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 96 अच्छी तरह से प्लेट हिला।प्लेट नमूनों के लिए, एक से पांच अंतिम मात्रा में ओबीबी के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से पतला करें ताकि प्रत्येक नमूने में कम से कम 50 माइक्रोलीटर की मात्रा हो। इसके बाद, प्रत्येक नमूने के 50 माइक्रोलीटर सीधे बैक्टीरियल कल्चर प्लेट के एक निर्धारित क्षेत्र पर, नमूनों के बीच पर्याप्त अंतर सुनिश्चित करते हैं। कवर और नमूनों को कमरे के तापमान पर लगभग 15 मिनट के लिए सूखने की अनुमति दें।प्लेटों और संस्कृति को रात भर 30 डिग्री सेल्सियस पर उलटा करें। वैकल्पिक रूप से, एनारोबिक जार में संस्कृति प्लेटें यह परीक्षण करने के लिए कि क्या एनोक्सिक स्थितियां बैक्टीरियल विकास को प्रभावित करती हैं या आकृति विज्ञान के लिए नियंत्रित करती हैं। रातोंरात संस्कृति के बाद, प्रत्येक नामित नमूना क्षेत्र में कालोनियों की गणना करें और प्रत्येक सेट में जीवित कोशिकाओं की संख्या की तुलना संबंधित नियंत्रणों से करके डेटा का विश्लेषण करने के लिए आगे बढ़ें।पहली बार इस तकनीक की स्थापना के सबसे कठिन पहलुओं की संभावना बैक्टीरियल स्टॉक के शुरुआती CFUs का अनुकूलन किया जाएगा, साथ ही यह सुनिश्चित करने के HL60 कोशिकाओं को प्रभावी ढंग से विभेदित कर रहे हैं । ओपीकेए शुरू करने से पहले, एचएल60 भेदभाव को एक व्यवहार्यता मार्कर के रूप में प्रोपिडियम आयोडाइड के साथ प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके मान्य किया गया था। तीन दिनों तक डीएमएफ के साथ इलाज करने के बाद सीडी 35 की अभिव्यक्ति बढ़ा दी गई और सीडी 71 की अभिव्यक्ति कम हो गई।एचएल60 उपचारित समूहों में बैक्टीरियल सीएफयू के औसत प्रतिशत का उपयोग विभिन्न उपचारों के बैक्टीरियल सेल अस्तित्व की तुलना में किया गया था। परिणामों से पता चला है कि एक प्रभावी उपचार के साथ, कालोनियों की संख्या HL60 सह-संस्कृति और कोई एचएल 60 कोशिकाओं के बीच अलग थी, जो अधिक कुशल फैगोसाइटोसिस का संकेत है। परिणामों से पता चला है कि जब बैक्टीरियल कमजोर पड़ने का अनुकूलन नहीं किया गया था या प्लेटिंग के बाद कॉलोनी विकास को ध्यान से नहीं देखा गया था, तो कॉलोनियों की अधिक वृद्धि कॉलोनियों की सटीक गिनती को रोक सकती है।इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय याद रखने के लिए सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि बैक्टीरियल इनक्यूबेशन की सावधानीपूर्वक निगरानी की जाए ताकि सीएफओ की अधिक वृद्धि से बचा जा सके। वीवो परख में एक मेजबान के भीतर प्रभावी जीवाणु निकासी गधे के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इन परख का उपयोग ओपीकेए के साथ देखी गई प्रतिरक्षा प्रभावकारिता की पुष्टि करने के लिए किया जा सकता है मानव या पशु मॉडल के लिए अनुवाद योग्य हैं।opsonophagocytic हत्या परख पिछले महत्वपूर्ण अनुसंधान अध्ययनों में महान प्रभाव के लिए इस्तेमाल किया गया है phagostic प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के लिए जीवाणुरोधी चिकित्सा लिंक । बैक्टीरियल रोगजनकों के साथ काम करना खतरनाक हो सकता है। कृपया इस परख के दौरान हर समय सुरक्षात्मक व्यक्तिगत उपकरण पहनें।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

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एनजाइम से जुड़े Immunospot (ELISPOT) परख: TH-1 माइक्रोबियल प्रतिजनों के खिलाफ सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की मात्रा

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

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विशिष्ट प्रतिजन Vivo में हत्या CFSE लेबल टारगेट कक्ष का उपयोग परख

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation.  ...

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

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मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के निष्क्रिय खिलाफ प्रशासन एच. capsulatum और फफूंद रोगज़नक़ों दूसरों

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating ...

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

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एक पैन वायरल माइक्रोएरे परख (Virochip) का प्रयोग वायरल रोगज़नक़ों के लिए नैदानिक ​​नमूनों स्क्रीन

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

श्रेणी बैक्टीरियल रोगज़नक़ों की जांच के लिए &#39;bioluminescent&#39; रिपोर्टर फेज

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Zebrafish भ्रूण की Intracellular बैक्टीरियल रोगज़नक़ों के साथ संक्रमण

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

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पालन ​​और इंजेक्शन<em&gt; Manduca Sexta</em&gt; बैक्टीरियल डाह का आकलन लार्वा

Manduca sexta, commonly known as the tobacco hornworm, is considered a significant agricultural pest, feeding on solanaceous plants including tobacco and ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Application of Long-term cultured Interferon-ÃƒÅ½Ã‚Â³ Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

मवेशी में effector और स्मृति टी सेल प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए लंबे समय तक सुसंस्कृत इंटरफेरॉन γ एंजाइम से जुड़ी Immunospot परख के आवेदन

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

-16 RRNA जीन अनुक्रमण और MALDI-TOF एमएस द्वारा दुर्लभ बैक्टीरियल रोगज़नक़ों की पहचान

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...