Name: opsonophagocytic killing assay to assess immunological responses against bacterial pathogens
Uploaded: 2019-04-05T14:00:00
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Ringraziamo il dottor Moon Nahm (University of Alabama Birmingham) per la sua preziosa assistenza nella creazione di saggi OPKA nel nostro laboratorio. Questo lavoro è stato supportato da istituti nazionali di salute Grant 1R01AI123383-01A1 a FYA.

1. la cultura, la differenziazione e la convalida delle cellule HL-60

<ol><li>Preparare terreni di coltura delle cellule HL-60 composto da 500 mL RPMI con L-Glutammina e 50ml inattivati siero bovino fetale. Non aggiungere antibiotici come questo può influenzare la differenziazione delle cellule HL-60.</li>
	<li>Per propagazione/manutenzione delle cellule HL-60, 5 x 106 cellule in 10 mL di terreni di coltura delle cellule HL-60 75 cm2 sfiato matracci a 37 ° C e 5% CO2. Passaggi...

<ol>
	<li>Romero-Steiner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+an+opsonophagocytic+assay+for+the+measurement+of+functional+antibody+activity+against+Streptococcus+pneumoniae+using+differentiated+HL-60+cells.">Standardization of an opsonophagocytic assay for the measurement of functional antibody activity against Streptococcus pneumoniae using differentiated HL-60 cells.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 4 (4), 415-422 (1997).</li><li>Nanra, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsular+polysaccharides+are+an+important+immune+evasion+mechanism+for+Staphylococcus+aureus.">Capsular polysaccharides are an important immune evasion mechanism for Staphylococcus aureus.</a> Human Vaccines and Immunotherapeutics. 9 (3), 480-487 (2013).</li><li>Ishibashi, K., Yamaguchi, O., Shiraiwa, Y., Ogihara, M., Shigeta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+therapy+of+Pseudomonas+aeruginosa+pyelonephritis+in+neutropenic+mice+with+human+antilipopolysaccharide+monoclonal+antibody+and+cefsulodin.">Combination therapy of Pseudomonas aeruginosa pyelonephritis in neutropenic mice with human antilipopolysaccharide monoclonal antibody and cefsulodin.</a> Journal of Urology. 155 (6), 2094-2097 (1996).</li><li>Middleton, D. R., Paschall, A. V., Duke, J. A., Avci, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+Hydrolysis+of+Pneumococcal+Capsular+Polysaccharide+Renders+the+Bacterium+Vulnerable+to+Host+Defense.">Enzymatic Hydrolysis of Pneumococcal Capsular Polysaccharide Renders the Bacterium Vulnerable to Host Defense.</a> Infection and Immunity. , (2018).</li><li>Baker, C. J., Noya, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+use+of+intravenous+immune+globulin+for+group+B+streptococcal+infection.">Potential use of intravenous immune globulin for group B streptococcal infection.</a> Reviews of Infectious Diseases. 12, 476-482 (1990).</li><li>Tian, H., Weber, S., Thorkildson, P., Kozel, T. R., Pirofski, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+opsonic+and+nonopsonic+serotype+3+pneumococcal+capsular+polysaccharide-specific+monoclonal+antibodies+against+intranasal+challenge+with+Streptococcus+pneumoniae+in+mice.">Efficacy of opsonic and nonopsonic serotype 3 pneumococcal capsular polysaccharide-specific monoclonal antibodies against intranasal challenge with Streptococcus pneumoniae in mice.</a> Infection and Immunity. 77 (4), 1502-1513 (2009).</li><li>Parameswarappa, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Semi-synthetic+Oligosaccharide+Conjugate+Vaccine+Candidate+Confers+Protection+against+Streptococcus+pneumoniae+Serotype+3+Infection.">A Semi-synthetic Oligosaccharide Conjugate Vaccine Candidate Confers Protection against Streptococcus pneumoniae Serotype 3 Infection.</a> Cell Chemical Biology. 23 (11), 1407-1416 (2016).</li><li>Jackson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomized+clinical+trial+of+a+single+versus+a+double+dose+of+13-valent+pneumococcal+conjugate+vaccine+in+adults+55+through+74+years+of+age+previously+vaccinated+with+23-valent+pneumococcal+polysaccharide+vaccine.">Randomized clinical trial of a single versus a double dose of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in adults 55 through 74 years of age previously vaccinated with 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine.</a> Vaccine. 36 (5), 606-614 (2018).</li><li>Cywes-Bentley, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+to+a+conserved+antigenic+target+is+protective+against+diverse+prokaryotic+and+eukaryotic+pathogens.">Antibody to a conserved antigenic target is protective against diverse prokaryotic and eukaryotic pathogens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (24), 2209-2218 (2013).</li><li>Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+HL-60+cell+line+to+measure+opsonic+capacity+of+pneumococcal+antibodies.">Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).</li><li>Collins, S. J., Ruscetti, F. W., Gallagher, R. E., Gallo, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+differentiation+of+human+promyelocytic+leukemia+cells+induced+by+dimethyl+sulfoxide+and+other+polar+compounds.">Terminal differentiation of human promyelocytic leukemia cells induced by dimethyl sulfoxide and other polar compounds.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 75 (5), 2458-2462 (1978).</li><li>Melnick, N., Rajam, G., Carlone, G. M., Sampson, J. S., Ades, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+novel+therapeutic+approach+to+treating+severe+pneumococcal+infection+using+a+mouse+model.">Evaluation of a novel therapeutic approach to treating severe pneumococcal infection using a mouse model.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 16 (6), 806-810 (2009).</li><li>Dwyer, M., Gadjeva, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opsonophagocytic+assay.">Opsonophagocytic assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1100, 373-379 (2014).</li><li>Burton, R. L., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+fourfold+multiplexed+opsonophagocytosis+assay+for+pneumococcal+antibodies+against+additional+serotypes+and+discovery+of+serological+subtypes+in+Streptococcus+pneumoniae+serotype+20.">Development of a fourfold multiplexed opsonophagocytosis assay for pneumococcal antibodies against additional serotypes and discovery of serological subtypes in Streptococcus pneumoniae serotype 20.</a> Clinical and Vaccine Immunololgy. 19 (6), 835-841 (2012).</li><li>Clarke, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-cost,+high-throughput,+automated+counting+of+bacterial+colonies.">Low-cost, high-throughput, automated counting of bacterial colonies.</a> Cytometry Part A. 77 (8), 790-797 (2010).</li><li>Aanei, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Database-guided+Flow-cytometry+for+Evaluation+of+Bone+Marrow+Myeloid+Cell+Maturation.">Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e57867 (2018).</li><li>Hirz, T., Dumontet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Isolation+and+Analysis+to+Determine+their+Role+in+Lymphoma+Cell+Sensitivity+to+Therapeutic+Agents.">Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents.</a> Journal of Visulaized Experiments. (109), e53846 (2016).</li><li>Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+annexin+V/propidium+iodide+apoptosis+assay+for+accurate+assessment+of+cell+death.">Modified annexin V/propidium iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), 2597 (2011).</li><li>Blair, O. C., Carbone, R., Sartorelli, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+HL-60+promyelocytic+leukemia+cells:+simultaneous+determination+of+phagocytic+activity+and+cell+cycle+distribution+by+flow+cytometry.">Differentiation of HL-60 promyelocytic leukemia cells: simultaneous determination of phagocytic activity and cell cycle distribution by flow cytometry.</a> Cytometry. 7 (2), 171-177 (1986).</li><li>Middleton, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+the+Streptococcus+pneumoniae+type+3+capsule-specific+glycoside+hydrolase+of+Paenibacillus+species+32352.">Identification and characterization of the Streptococcus pneumoniae type 3 capsule-specific glycoside hydrolase of Paenibacillus species 32352.</a> Glycobiology. 28 (2), 90-99 (2018).</li></ol>

OPKAs servire ruoli essenziali nella valutazione risposte immunitarie anticorpo mediata indotte dalla vaccinazione6,8. Il significato principale di questo OPKA semplificata è l'adattabilità nelle condizioni per essere testati (cioè, anticorpi, enzimi trattamenti, ecc.). In questo senso, mentre questo test può essere utilizzato per verificare il contributo di opsonine (cioè anticorpi) nella fagocitosi, può anche essere utilizzato per valutare il modo di supe...

L'anticorpli uccidendo assay (OPKA) sono uno strumento critico per il collegamento di alterazioni nella struttura batterica o funzione alle successive modifiche nella risposta immunitaria e la funzione. Come tale, esso è frequente come analisi complementare per determinare il sistema immunitario l'efficacia di trattamenti anticorpali, vaccini candidati, ottimizzazione degli enzimi, ecc. Saggi in vivo sono necessari per determinare l'effettiva liquidazione o protezione in un modello di infezione batterica, il OPKA può essere utilizzato per valutare il contributo immune alla morte delle cellule batteriche componenti di base al massimo: batteri, cellule immunitarie e sperimentale trattamenti. Gli studi precedenti hanno dimostrato che la OPKAs può essere modificato e utilizzato per una varietà di batteri e sierotipi, tra cui1di Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus2, Pseudomonas aeruginosa3. Inoltre, queste analisi ottimizzate possono essere utilizzate per valutare i diversi trattamenti sperimentali, tra cui la possibilità di un enzima per rendere più accessibile ai trattamenti di4 e l'anticorpo di complemento-mediata di cellule immuni per migliorare il batterio opsonizzazione5. Classicamente, analisi di OPKA è stato utilizzato con successo nella ricerca clinica e di base impostazioni come un indicatore potente per la protezione indotta da anticorpi patogeni specifici6,7,8,9 .
Diversi tipi di cellule del sistema immunitario possono essere utilizzati per la valutazione dell'uccisione di anticorpli. Una popolazione fagocitica comunemente usato è la linea di cellule leucemiche umane HL-60. Questa linea cellulare può essere mantenuta come inattivato promielociti nella cultura; Tuttavia, possono essere differenziati in vari stati attivati via droga diversi trattamenti10,11. Trattamento di HL60 con N, N-dimetilformammide differenzia la linea cellulare in neutrofili attivati con forte attività fagocitica11. Mentre le cellule HL-60 sono state ottimizzate e sono frequentemente utilizzate per questi test di fagocitosi10, altri leucociti polimorfonucleari primari è utilizzabile come il braccio immune dell' esperimento12.
Inoltre, queste analisi possono essere semplificata13 o multiplex14 a guardare più ceppi resistenti agli antibiotici dei batteri da testare. Il metodo multiplex è stato reso più fattibile attraverso lo sviluppo di software che può contare in modo efficiente Colonia batterica formando unità (CFUs) al posto su una piastra di agar15. Qui, descriviamo un metodo semplificato utilizzando un ceppo batterico, cellule HL-60, complemento di coniglio bambino e piastre di agar sangue. Con questo metodo, i trattamenti multipli possono essere valutati rapidamente per affrontare questioni di ricerche specifiche su come può essere modulata la risposta immunitaria innata alle infezioni batteriche.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:636px;" width="637">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Annexin V (APC conjugated)</td>
			<td style="width:147px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">640919</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">anti-CD35, human (PE conjugated)</td>
			<td style="width:147px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">333405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">anti-CD71, human (PE conjugated)</td>
			<td style="width:147px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">334105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:204px;">bacterial strain to be used (ie, Streptococcus pneumoniae, WU2)</td>
			<td style="width:147px;">Bacterial Respiratory Reference Laboratory (Dr. Moon Nahm)&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">blood agar plates</td>
			<td>Hardy Diagnostic</td>
			<td>A10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Fetal Clone serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30080.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9012-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">HL-60 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">IgG Isotype Control (PE conjugated)</td>
			<td style="width:147px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">400907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">N,N-dimethylformamide (DMF)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>UN2265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">propidium iodide</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">RPMI media with L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

opsonophagocytic killing assay to assess immunological responses against bacterial pathogens

Un aspetto chiave della risposta immunitaria a colonizzazione batterica dell'host è la fagocitosi. Un'analisi di uccisione di anticorpli (OPKA) è una procedura sperimentale in cui le cellule fagocitiche sono co-coltivate con unità batterica. Le cellule immunitarie verranno fagocitare e uccidere le colture batteriche in modo complemento-dipendente. L'efficienza dell'uccisione delle cellule immuno-mediata è dipendente da una serie di fattori e può essere utilizzato per determinare batterica come le diverse culture confrontare per quanto riguarda la resistenza alla morte cellulare. In questo modo, può essere valutata l'efficacia di potenziali terapie basate su immunitario contro ceppi batterici specifici e/o sierotipi. In questo protocollo, descriviamo un OPKA semplificata che utilizza condizioni di cultura di base e delle cellule di conteggio per determinare la vitalità cellulare batterica dopo co-coltura con condizioni di trattamento e le cellule immunitarie di HL-60. Questo metodo è stato utilizzato con successo con un numero di diversi sierotipi pneumococcici, capsulari e ceppi di acapsular e altre specie batteriche. I vantaggi di questo protocollo OPKA sono la sua semplicità, versatilità (come questo test non è limitato ai trattamenti di anticorpo come opsonine) e la minimizzazione del tempo e reagenti per valutare gruppi sperimentali di base.

Convalida di differenziazione di HL-60 deve essere eseguita prima di iniziare la OPKA. Questa operazione può essere eseguita mediante citometria a flusso per determinare l'espressione extracellulare di CD11b, CD35, CD71 e Annessina V (Figura 1). Ioduro di propidio può essere utilizzato anche come un indicatore di redditività. Dopo essere stati trattati con DMF per 3 giorni, dovrebbe essere aumentata espressione di CD35 (≥ 55% di tutte le cellule) e deve essere diminuita espressione di C...

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Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

Questo test di uccisione anticorpli viene utilizzato per confrontare la capacità delle cellule fagocitiche immuni di rispondere e uccidere i batteri basati su diversi trattamenti e/o condizioni. Classicamente, questo test serve come il gold standard per valutare le funzioni effettrici degli anticorpi alzati contro un batterio come opsonina.

Anticorpli uccisione test per valutare le risposte immunologiche contro batteri patogeni

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Questo saggio collega la modulazione della struttura batterica e della funzione all'attività antibatterica basata sulle cellule immunitarie. Come tale, un'immunoterapeutica chiave di un potenziale trattamento può essere valutata nel determinare la probabilità di una migliore clearance batterica. Il saggio di uccisione opsonofagocitica serve tradizionalmente come gold standard per valutare le funzioni efficaci degli anticorpi sollevati contro il batterio come osservante.Questo protocollo offre semplicità e versatilità rispetto ai test standardizzati ad alta produttività esistenti. In questo protocollo, studiamo gli effetti di un trattamento farmacologico sulla polmonite da streptococco e come questi effetti si traducono in una migliore fagocitosi del batterio. Qui, applichiamo l'OPKA alle cellule della polmonite dello streptococco.Tuttavia questo protocollo può essere adottato per valutare l'uccisione fagocitica di altri agenti patogeni da parte delle cellule immunitarie. Dedicare tempo per ottimizzare le scorte batteriche e garantire che i CFC finali da contare rientrano nell'intervallo ottimale. Si consiglia vivamente di utilizzare la citometria a flusso per garantire che le cellule HL60 siano vitali e attive e provare diverse condizioni di coltura per garantire cellule funzionalmente attive.La dimostrazione visiva fornirà una migliore comprensione di come il campione deve essere placcato e come ottenere campioni contati. Per iniziare, preparare i mezzi di coltura cellulare HL60 composti da 500 millilitri RPMI integrati con L-glutammina e 15 millilitri riscaldano il siero bovino fetale inattivato. Per la propagazione e il mantenimento di cellule HL60, coltura di cinque milioni di cellule in 10 millilitri di mezzi di coltura cellulare HL60 in contenitori ventilati di 75 centimetri quadrati a 37 gradi celsius e anidride carbonica al cinque%.Per generare scorte di lavoro di cellule HL60, aggiungere circa un milione di cellule per millilitro nei mezzi di coltura HL60 integrati con solfossido di dimetile al 10% in un tubi criogenici millilitro. Per differenziare le cellule HL60, coltura 1,5 per 10 per le sette cellule in 15 millilitri di ambienti di coltura cellulare HL60 integrati con 0,6%DMF in filtro sterile limitato 75 flaconi di centimetri quadrati a 37 gradi celsius e 5% di anidride carbonica per tre giorni prima di OPKA. Per preparare i campioni di stock batterici, far crescere il ceppo batterico WU2 in un brodo appropriato per circa due o quattro ore a 37 gradi Celsius.Successivamente, pelletare i batteri per centrifugazione a seimila volte G per due minuti e rimescolare le cellule in 10-30 millilitri di 15%glicerolo nel brodo appropriato. Aliquotare la coltura batterica in tubi sterili di centrifuga da 1,5 millilitri e conservare a 80 gradi celsius. Successivamente, scongelare una fiala di stock batterico in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius.Pellet le cellule batteriche e resuspend in 500 microlitri di FFS in condizioni sterili. Diluizioni della piastra del calcio batterico non trattato sulle placche di agar del sangue e coltura delle piastre durante la notte a 30 gradi Celsius. Dopo la fase di incubazione, contare le colonie per ogni diluizione di stock batterico non trattato co-coltivato con cellule HL60.Registra quale diluizione di batteri produce il numero ottimale di colonie numerabili per i futuri OPKA con questo stock batterico. Scongelare un tubo di calcio batterico. Batteri a pellet a seimila volte G per due minuti e rimosi il pellet cellulare in OBB alla diluizione ottimale ottenuta nella fase precedente.Pipetta 10 microlitri della diluizione batterica rimostrata per pozzo in un fondo rotondo 96 piastra di coltura cellulare del pozzo. Quindi, aggiungere 20 microlitri di un anticorpo appropriato o di un trattamento farmacologico a ciascun pozzo sperimentale in duplice copia. Per i pozzi di controllo, utilizzare 1XPBS o OBB a seconda del tampone utilizzato per i pozzi di trattamento.Agitare la piastra campione a circa 90 giri/min a temperatura ambiente per un'ora. Per raccogliere le cellule differenziate HL60 che vengono trattate con DMF tre giorni prima, pelletare le cellule a 500 volte G per tre minuti. Scartare il supernatante e lavare il pellet con almeno 10 millilitri di 1XPBS.Pellet le cellule lavate a 500 volte G per tre minuti. Scartare il supernatante e rimescolare le cellule in OBB. Aggiungere siero sterile di coniglio non diluito a un volume finale da uno a cinque.Dopo un'ora di coltura batterica, dividere ogni campione in pozzi duplicati per due gruppi. Successivamente, aggiungere 50 microlitri della miscela di complementi HL60 a ogni set sperimentale di pozzi e 50 microlitri di OBB solo ai pozzi dei batteri. Agitare la piastra del pozzo 96 a 37 gradi Celsius per un'ora.Per placcare i campioni, diluire ogni pozzo con OBB a uno o cinque volumi finali in modo che ogni campione abbia un volume di almeno 50 microlitri. Successivamente, pipetta 50 microlitri di ciascun campione direttamente su un'area designata di una piastra di coltura batterica, garantendo un'adeguata spaziatura tra i campioni. Coprire e lasciare asciugare i campioni per circa 15 minuti a temperatura ambiente.Invertire i piatti e la coltura durante la notte a 30 gradi celsius. In alternativa, piastre di coltura in barattoli anaerobici per verificare se le condizioni anossiche influenzano la crescita batterica o per controllare la morfologia. Dopo la coltura notturna, contare le colonie in ogni area campione designata e procedere all'analisi dei dati confrontando il numero di cellule vive in ogni set con i controlli corrispondenti.Gli aspetti più difficili della creazione di questa tecnica per la prima volta saranno probabilmente l'ottimizzazione dei CFC di partenza dello stock batterico, oltre a garantire che le cellule HL60 siano efficacemente differenziate. Prima di iniziare l'OPKA, la differenziazione HL60 è stata convalidata usando la citometria del flusso con ioduro di propidio come marcatore di vitalità. Dopo essere stato trattato con DMF per tre giorni, l'espressione di CD35 è stata aumentata e l'espressione di CD71 è stata ridotta.Le percentuali medie di CFC batterici nei gruppi trattati con HL60 rispetto ai corrispondenti gruppi trattati non HL60 sono state utilizzate per confrontare la sopravvivenza cellulare batterica di diversi trattamenti. I risultati hanno mostrato che con un trattamento efficace, il numero di colonie era diverso tra la co-coltura HL60 e nessuna cellule HL60, indicativa di fagocitosi più efficiente. I risultati hanno mostrato che quando la diluizione batterica non è stata ottimizzata o la crescita della colonia non è stata osservata con attenzione dopo la placcatura, la crescita troppo delle colonie poteva impedire un conteggio accurato delle colonie.La cosa più importante da ricordare quando si tenta questa procedura è monitorare attentamente l'incubazione batterica in modo da evitare la crescita troppo dei CFC. I saggi in vivo possono essere utilizzati per valutare un'efficace clearance batterica all'interno di un ospite. Questi test possono essere utilizzati per confermare l'efficacia immunitaria osservata con l'OPKA sono traducibili in modelli umani o animali.Il saggio di uccisione opsonofagocitica è stato usato con grande effetto in precedenti studi di ricerca significativi per collegare le terapie antibatteriche alle risposte immunitarie fagostiche. Lavorare con agenti patogeni batterici può essere pericoloso. Si prega di indossare dispositivi personali protettivi in ogni momento durante questo test.

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Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

Amministrazione passivo di anticorpi monoclonali contro H. capsulatum E altri patogeni fungini

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating ...

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Utilizzando un pan-virale Assay Microarray (Virochip) allo schermo campioni clinici di patogeni virali

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

Phage &#39;Bioluminescent&#39; Reporter per il rilevamento di batteri patogeni di categoria A

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

L&#39;infezione di embrioni di zebrafish con batteri patogeni intracellulari

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Allevamento e iniezione di<em&gt; Manduca sexta</em&gt; Le larve per valutare virulenza batterica

Manduca sexta, commonly known as the tobacco hornworm, is considered a significant agricultural pest, feeding on solanaceous plants including tobacco and ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Application of Long-term cultured Interferon-ÃƒÅ½Ã‚Â³ Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Applicazione di lungo termine colta interferone-γ Enzyme Linked immunospot Assay per la valutazione effettori e memoria delle cellule T risposte a Bovino

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

Identificazione di batteri patogeni rari da 16S rRNA sequenziamento del gene e MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...