Name: opsonophagocytic killing assay to assess immunological responses against bacterial pathogens
Uploaded: 2019-04-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens at JoVE.com

Vi takker Dr. Moon Nahm (University of Alabama Birmingham) for hans uvurderlig hjelp i å etablere OPKA analyser i vårt laboratorium. Dette arbeidet ble støttet av nasjonale institutter for helse Grant 1R01AI123383-01A1 til FYA.

1. kultur, differensiering, og validering av HL-60 celler

<ol><li>Forberede HL-60 celle kultur medier består av 500 mL RPMI med L-glutamin og 50 mL inaktivert fosterets bovin serum. Ikke Legg antibiotika som dette kan påvirke differensiering av HL-60 cellene.</li>
	<li>Overføring/vedlikehold av HL-60 celler, kultur 5 x 106 celler i 10 mL av HL-60 celle kultur medier i 75 cm2 luftet kolber på 37 ° C og 5% CO2. Passasjen cellene hver 3−4 dager for å opprettholde optimal ce...

<ol>
	<li>Romero-Steiner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+an+opsonophagocytic+assay+for+the+measurement+of+functional+antibody+activity+against+Streptococcus+pneumoniae+using+differentiated+HL-60+cells.">Standardization of an opsonophagocytic assay for the measurement of functional antibody activity against Streptococcus pneumoniae using differentiated HL-60 cells.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 4 (4), 415-422 (1997).</li><li>Nanra, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsular+polysaccharides+are+an+important+immune+evasion+mechanism+for+Staphylococcus+aureus.">Capsular polysaccharides are an important immune evasion mechanism for Staphylococcus aureus.</a> Human Vaccines and Immunotherapeutics. 9 (3), 480-487 (2013).</li><li>Ishibashi, K., Yamaguchi, O., Shiraiwa, Y., Ogihara, M., Shigeta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+therapy+of+Pseudomonas+aeruginosa+pyelonephritis+in+neutropenic+mice+with+human+antilipopolysaccharide+monoclonal+antibody+and+cefsulodin.">Combination therapy of Pseudomonas aeruginosa pyelonephritis in neutropenic mice with human antilipopolysaccharide monoclonal antibody and cefsulodin.</a> Journal of Urology. 155 (6), 2094-2097 (1996).</li><li>Middleton, D. R., Paschall, A. V., Duke, J. A., Avci, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+Hydrolysis+of+Pneumococcal+Capsular+Polysaccharide+Renders+the+Bacterium+Vulnerable+to+Host+Defense.">Enzymatic Hydrolysis of Pneumococcal Capsular Polysaccharide Renders the Bacterium Vulnerable to Host Defense.</a> Infection and Immunity. , (2018).</li><li>Baker, C. J., Noya, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+use+of+intravenous+immune+globulin+for+group+B+streptococcal+infection.">Potential use of intravenous immune globulin for group B streptococcal infection.</a> Reviews of Infectious Diseases. 12, 476-482 (1990).</li><li>Tian, H., Weber, S., Thorkildson, P., Kozel, T. R., Pirofski, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+opsonic+and+nonopsonic+serotype+3+pneumococcal+capsular+polysaccharide-specific+monoclonal+antibodies+against+intranasal+challenge+with+Streptococcus+pneumoniae+in+mice.">Efficacy of opsonic and nonopsonic serotype 3 pneumococcal capsular polysaccharide-specific monoclonal antibodies against intranasal challenge with Streptococcus pneumoniae in mice.</a> Infection and Immunity. 77 (4), 1502-1513 (2009).</li><li>Parameswarappa, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Semi-synthetic+Oligosaccharide+Conjugate+Vaccine+Candidate+Confers+Protection+against+Streptococcus+pneumoniae+Serotype+3+Infection.">A Semi-synthetic Oligosaccharide Conjugate Vaccine Candidate Confers Protection against Streptococcus pneumoniae Serotype 3 Infection.</a> Cell Chemical Biology. 23 (11), 1407-1416 (2016).</li><li>Jackson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomized+clinical+trial+of+a+single+versus+a+double+dose+of+13-valent+pneumococcal+conjugate+vaccine+in+adults+55+through+74+years+of+age+previously+vaccinated+with+23-valent+pneumococcal+polysaccharide+vaccine.">Randomized clinical trial of a single versus a double dose of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in adults 55 through 74 years of age previously vaccinated with 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine.</a> Vaccine. 36 (5), 606-614 (2018).</li><li>Cywes-Bentley, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+to+a+conserved+antigenic+target+is+protective+against+diverse+prokaryotic+and+eukaryotic+pathogens.">Antibody to a conserved antigenic target is protective against diverse prokaryotic and eukaryotic pathogens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (24), 2209-2218 (2013).</li><li>Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+HL-60+cell+line+to+measure+opsonic+capacity+of+pneumococcal+antibodies.">Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).</li><li>Collins, S. J., Ruscetti, F. W., Gallagher, R. E., Gallo, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+differentiation+of+human+promyelocytic+leukemia+cells+induced+by+dimethyl+sulfoxide+and+other+polar+compounds.">Terminal differentiation of human promyelocytic leukemia cells induced by dimethyl sulfoxide and other polar compounds.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 75 (5), 2458-2462 (1978).</li><li>Melnick, N., Rajam, G., Carlone, G. M., Sampson, J. S., Ades, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+novel+therapeutic+approach+to+treating+severe+pneumococcal+infection+using+a+mouse+model.">Evaluation of a novel therapeutic approach to treating severe pneumococcal infection using a mouse model.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 16 (6), 806-810 (2009).</li><li>Dwyer, M., Gadjeva, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opsonophagocytic+assay.">Opsonophagocytic assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1100, 373-379 (2014).</li><li>Burton, R. L., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+fourfold+multiplexed+opsonophagocytosis+assay+for+pneumococcal+antibodies+against+additional+serotypes+and+discovery+of+serological+subtypes+in+Streptococcus+pneumoniae+serotype+20.">Development of a fourfold multiplexed opsonophagocytosis assay for pneumococcal antibodies against additional serotypes and discovery of serological subtypes in Streptococcus pneumoniae serotype 20.</a> Clinical and Vaccine Immunololgy. 19 (6), 835-841 (2012).</li><li>Clarke, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-cost,+high-throughput,+automated+counting+of+bacterial+colonies.">Low-cost, high-throughput, automated counting of bacterial colonies.</a> Cytometry Part A. 77 (8), 790-797 (2010).</li><li>Aanei, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Database-guided+Flow-cytometry+for+Evaluation+of+Bone+Marrow+Myeloid+Cell+Maturation.">Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e57867 (2018).</li><li>Hirz, T., Dumontet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Isolation+and+Analysis+to+Determine+their+Role+in+Lymphoma+Cell+Sensitivity+to+Therapeutic+Agents.">Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents.</a> Journal of Visulaized Experiments. (109), e53846 (2016).</li><li>Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+annexin+V/propidium+iodide+apoptosis+assay+for+accurate+assessment+of+cell+death.">Modified annexin V/propidium iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), 2597 (2011).</li><li>Blair, O. C., Carbone, R., Sartorelli, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+HL-60+promyelocytic+leukemia+cells:+simultaneous+determination+of+phagocytic+activity+and+cell+cycle+distribution+by+flow+cytometry.">Differentiation of HL-60 promyelocytic leukemia cells: simultaneous determination of phagocytic activity and cell cycle distribution by flow cytometry.</a> Cytometry. 7 (2), 171-177 (1986).</li><li>Middleton, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+the+Streptococcus+pneumoniae+type+3+capsule-specific+glycoside+hydrolase+of+Paenibacillus+species+32352.">Identification and characterization of the Streptococcus pneumoniae type 3 capsule-specific glycoside hydrolase of Paenibacillus species 32352.</a> Glycobiology. 28 (2), 90-99 (2018).</li></ol>

OPKAs tjene viktige roller i å vurdere antistoff mediert immunreaksjoner indusert av vaksiner6,8. Viktigste betydningen av dette forenklet OPKA er tilpasningsevne i forhold til testes (dvs. antistoffer, enzym behandlinger, etc.). I denne forstand, mens denne analysen kan brukes til å teste bidrag av opsonins (dvs. antistoffer) i fagocytose, kan det også brukes til å vurdere måter å overvinne virulens faktorer (dvs. capsular polysakkarider) som normalt hemme...

Opsonophagocytic drepe analysen (OPKA) er et kritisk verktøy for å koble endringer i bakteriell strukturen eller funksjon til etterfølgende endringer i immunforsvaret og funksjon. Som sådan, er det ofte brukt som en komplementær analysen for å bestemme immun-baserte effekten av antistoff behandlinger, vaksine kandidater, enzym optimalisering, etc. Mens i vivo analyser er nødvendig for å bestemme effektiv klarering eller beskyttelse i en bakteriell infeksjon modell, OPKA kan brukes til å vurdere immun bidrag til bakteriell celledød på de grunnleggende komponentene: bakterier, immunceller, og eksperimentelle behandlinger. Tidligere studier har vist at OPKAs kan endres og brukes til en rekke bakterier og serotyper, inkludert Streptococcus pneumoniae1, Staphylococcus aureus2, Pseudomonas aeruginosa3. Videre kan disse optimalisert analyser brukes til å vurdere ulike eksperimentelle behandlinger, inkludert muligheten for et enzym å gjøre bakterien mer tilgjengelig for komplement-mediert immunceller4 og antistoff behandlinger for å forbedre opsonization5. Tradisjonelt OPKA analysen har blitt brukt i grunnleggende og klinisk forskning som en mektig indikator for beskyttelse indusert av patogen-spesifikke antistoffer6,7,8,9 .
Ulike immunceller kan brukes for vurdering av opsonophagocytic drap. En brukte phagocytic befolkningen er HL-60 human leukemic celle linjen. Denne cellen linjen kan holdes som deaktivert promyelocytes i kultur; Imidlertid kan de differensieres i ulike aktivert stater via ulike behandlinger10,11. Behandling av HL60 n, N-vannistedenfor skiller celle linjen i aktivert nøytrofile med sterke phagocytic aktivitet11. Mens HL-60 celler er optimalisert og brukes ofte for disse fagocytose analyser10, kan andre primære polymorfonukleære leukocytter brukes som immun armen av eksperimentet12.
I tillegg disse analyser kan være forenklet13 eller multiplekset14 å se på flere antibiotika-resistente stammer av bakterier skal testes. Metoden multiplex er gjort mer mulig gjennom utvikling av programvare som kan effektivt telle bakterie kolonien danner enheter (CFUs) per plass på en agar plate15. Her beskriver vi en strømlinjeformet metode som bruker en bakteriell stamme, HL-60 celler, baby kaninen supplement og blod agar plater. Med denne metoden kan flere behandlinger vurderes raskt for å løse spesifikke problemstillinger på hvordan medfødte immunforsvaret til bakteriell infeksjon kan være modulert.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:636px;" width="637">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Annexin V (APC conjugated)</td>
			<td style="width:147px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">640919</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">anti-CD35, human (PE conjugated)</td>
			<td style="width:147px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">333405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">anti-CD71, human (PE conjugated)</td>
			<td style="width:147px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">334105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:204px;">bacterial strain to be used (ie, Streptococcus pneumoniae, WU2)</td>
			<td style="width:147px;">Bacterial Respiratory Reference Laboratory (Dr. Moon Nahm)&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">blood agar plates</td>
			<td>Hardy Diagnostic</td>
			<td>A10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Fetal Clone serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30080.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9012-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">HL-60 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">IgG Isotype Control (PE conjugated)</td>
			<td style="width:147px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">400907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">N,N-dimethylformamide (DMF)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>UN2265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">propidium iodide</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">RPMI media with L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

opsonophagocytic killing assay to assess immunological responses against bacterial pathogens

En viktig del av immunforsvaret til bakteriell kolonisering av verten er fagocytose. Opsonophagocytic drepe analysen (OPKA) er en eksperimentell prosedyre der phagocytic cellene er co kulturperler med bakteriell enheter. Immunceller vil phagocytose og dreper bakteriekulturer i en komplement-avhengige måte. Effektiviteten av immun-mediert celle drapet er avhengig av flere faktorer og kan brukes til å bestemme hvordan ulike bakteriell kulturer sammenligne med hensyn til motstand mot celledød. På denne måten kan effekten av potensielle immun-baserte therapeutics vurderes mot spesifikke bakteriell stammer og/eller serotyper. I denne protokollen beskriver vi en forenklet OPKA som benytter grunnleggende oppdrettsforholdene og celle teller for å fastslå bakteriell celle levedyktighet etter co kultur med behandling betingelser og HL-60 immunceller. Denne metoden har blitt vellykket utnyttet med en rekke forskjellige pneumokokk serotyper, capsular og acapsular stammer, og andre bakterie-art. Fordelene med denne OPKA protokollen er dens enkelhet, allsidighet (som denne analysen ikke er begrenset til antistoff behandlinger som opsonins), og minimering av tid og reagenser å vurdere eksperimentelle standardgrupper.

Validering av HL-60 differensiering skal utføres før OPKA. Dette kan oppnås ved å bruke flowcytometri til å bestemme den ekstracellulære uttrykket for CD11b, CD35, CD71 og annexin V (figur 1). Propidium iodide kan også brukes som en levedyktighet markør. Etter behandling med DMF for 3 dager, uttrykk for CD35 bør økes (≥55% av alle celler) og uttrykk for CD71 bør reduseres (≤20% av alle celler). Andelen annexin V + og propidium iodide (PI +) celler sammen skal < 35% å sikre ti...

Watch this Scientific Journal Video about Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens at JoVE.com

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

Denne opsonophagocytic drepe analysen brukes til å sammenligne evne til phagocytic immunceller svare og drepe bakterier basert på ulike behandlinger og/eller betingelser. Klassisk, fungerer denne analysen som gullstandarden for vurdering funksjoner effektor av antistoffer reist mot en bakterie som opsonin.

Opsonophagocytic drepe analysen å vurdere immunologiske svar mot bakteriell patogener

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Denne analysen knytter modulering av bakteriell struktur og funksjon til immuncellebasert antibakteriell aktivitet. Som sådan kan en viktig immunterapeutisk av en potensiell behandling vurderes for å bestemme sannsynligheten for forbedret bakteriell clearance. Opsonofagocytisk drapsanalyse fungerer tradisjonelt som gullstandarden for å vurdere effektive funksjoner av antistoffer hevet mot bakterien som obsonant.Denne protokollen gir enkelhet og allsidighet over eksisterende standardiserte analyser med høy gjennomstrømning. I denne protokollen undersøker vi effekten av en narkotikabehandling på streptokokker lungebetennelse og hvordan disse effektene oversettes til forbedret fagocytose av bakterien. Her bruker vi OPKA til streptokokker lungebetennelse celler.Men denne protokollen kan vedtas for å vurdere fagocytisk drap på andre patogener av immunceller. Dediker tid til å optimalisere bakterielagrene og sikre at de endelige CFUene telles faller innenfor det optimale området. Vi anbefaler på det sterkeste at du bruker strømningscytometri for å sikre at HL60-celler er levedyktige og aktive og prøver forskjellige kulturforhold for å sikre funksjonelt aktive celler.Visuell demonstrasjon vil gi en bedre forståelse av hvordan prøven skal være belagt og hvordan man oppnår tellbare prøver. Til å begynne med, forberede HL60 celle kultur medier bestående av 500 milliliter RPMI supplert med L-glutamin og 15 milliliter varme inaktivert fosterbovin serum. For forplantning og vedlikehold av HL60-celler, kultur fem millioner celler i 10 milliliter HL60 celle kultur media i 75 kvadratcentimeter ventilert flasker på 37 grader celsius og fem prosent karbondioksid.For å generere arbeidslagre av HL60-celler, legg til omtrent en million celler per milliliter i HL60 kulturmedier supplert med 10% dimetylsulfoksid i ett milliliter kryogenrør. For å skille HL60-celler, kultur 1,5 ganger 10 til de syv cellene i 15 milliliter HL60 cellekulturmedier supplert med 0,6% DMF i sterilt filter avkortet 75 kvadratcentimeter flasker ved 37 grader celsius og 5% karbondioksid i tre dager før OPKA. For å forberede bakterielagerprøvene, øk WU2 bakteriell belastning i en passende kjøttkraft i omtrent to til fire timer ved 37 grader celsius.Deretter pellet bakteriene ved sentrifugering på seks tusen ganger G i to minutter og gjenbruke cellene i 10 til 30 milliliter av 15% glyserol i riktig kjøttkraft. Aliquot bakteriekulturen i sterile 1,5 milliliter sentrifugerør og lagre på 80 grader celsius. Deretter tine ut ett hetteglass med bakteriell lager i en 37 grader celsius vannbad.Pellet bakteriecellene og resuspend i 500 mikroliter OBB under sterile forhold. Plate fortynninger av ubehandlet bakteriell lager på blod agar plater og kultur platene over natten på 30 grader celsius. Etter inkubasjonstrinnet teller koloniene for hver fortynning av ubehandlet bakteriebestand sammen med HL60-celler.Rekord som fortynning av bakterier gir det optimale antall fylker kolonier for fremtidige OPKAs med denne bakterielle bestanden. Tin ett rør av bakteriell lager. Pellet bakterier på seks tusen ganger G i to minutter og resuspend cellen pellet i OBB på optimal fortynning oppnådd i forrige trinn.Pipette 10 mikroliter av den gjenbrukte bakterielle fortynningen per brønn i en rund bunn 96 brønncellekulturplate. Deretter legger du til 20 mikroliter av et passende antistoff eller en narkotikabehandling til hver eksperimentelle brønn i duplikat. For kontrollbrønner, bruk 1XPBS eller OBB avhengig av bufferen som brukes til behandlingsbrønnene.Rist prøveplaten ved ca. 90 o/min ved romtemperatur i én time. For å høste HL60 differensierte celler som behandles med DMF tre dager før, pellet cellene ved 500 ganger G i tre minutter. Kast det overnaturlige og vask pelletet med minst 10 milliliter 1XPBS.Pellet de vasket cellene ved 500 ganger G i tre minutter. Kast de overnaturante og gjenoppuss cellene i OBB. Tilsett sterilt ufortynnet baby kanin serum på en en til fem siste volum.Etter en time bakteriell kultur, del hver prøve i dupliserte brønner for to grupper. Deretter legger du til 50 mikroliter av HL60-komplementblandingen til hvert eksperimentelle sett med brønner og 50 mikroliter OBB til brønnene av bakterier bare. Rist 96-brønnplaten ved 37 grader celsius i en time.For å plateprøver, fortynne hver brønn med OBB med ett til fem endelig volum, slik at hver prøve har et volum på minst 50 mikroliter. Deretter pipette 50 mikroliter av hver prøve direkte på et utpekt område av en bakteriell kulturplate, noe som sikrer tilstrekkelig avstand mellom prøvene. Dekk og la prøvene tørke i ca. 15 minutter ved romtemperatur.Inverter platene og kulturen over natten ved 30 grader celsius. Alternativt kan kulturplater i anaerobe krukker for å teste om anoksiske forhold påvirker bakterieveksten eller å kontrollere for morfologi. Etter overnattingskulturen teller du koloniene i hvert utpekte utvalgsområde og fortsetter å analysere data ved å sammenligne antall levende celler i hvert sett med de tilsvarende kontrollene.De vanskeligste aspektene ved å etablere denne teknikken for første gang vil trolig være å optimalisere start-CFUene til bakterielageret, samt sikre at HL60-cellene er effektivt differensiert. Før opka ble OPKA validert ved hjelp av strømningscytometri med propidiumjodid som levedyktighetsmarkør. Etter å ha blitt behandlet med DMF i tre dager, ble uttrykket for CD35 økt og uttrykket for CD71 ble redusert.De gjennomsnittlige prosentandelene av bakterielle CFUer i de HL60 behandlede gruppene sammenlignet med de tilsvarende gruppene som ikke behandlet HL60 ble brukt til å sammenligne bakteriell celleoverlevelse av ulike behandlinger. Resultatene viste at med en effektiv behandling var antall kolonier forskjellig mellom HL60-co-kultur og ingen HL60-celler, noe som indikerer mer effektiv fagocytose. Resultatene viste at når bakteriell fortynning ikke var optimalisert eller koloniveksten ikke ble nøye observert etter plating, kunne overvekst av koloniene forhindre nøyaktig telling av kolonier.Det viktigste å huske når du prøver denne prosedyren er å overvåke bakteriell inkubasjon nøye for å unngå overvekst av CFUer. In vivo-analyser kan brukes til å analysere effektiv bakteriell clearance hos en vert. Disse analysene kan brukes til å bekrefte at immuneffekten observert med OPKA kan oversettes til menneskelige eller animalske modeller.Den opsonofagocytiske drapsanalysen har blitt brukt til stor effekt i tidligere betydelige forskningsstudier for å knytte antibakterielle terapier til phagostiske immunresponser. Arbeid med bakterielle patogener kan være farlig. Bruk verneutstyr til enhver tid under denne analysen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation.  ...

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating ...

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Infeksjon av sebrafisk embryo med intracellulære bakterier

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Oppdragelse og Injeksjon av<em&gt; Manduca sexta</em&gt; Larver å vurdere Bakteriell Virulence

Manduca sexta, commonly known as the tobacco hornworm, is considered a significant agricultural pest, feeding on solanaceous plants including tobacco and ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Application of Long-term cultured Interferon-ÃƒÅ½Ã‚Â³ Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Påføring av Long-term kultivert Interferon-γ Enzyme-linked immunospot analyse for Assessing Cell Responses Effector og Memory T i Cattle

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

Identifisering av sjeldne bakterielle patogener av 16S rRNA Gene Sequencing og MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...