Name: opsonophagocytic killing assay to assess immunological responses against bacterial pathogens
Uploaded: 2019-04-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens at JoVE.com

Мы благодарим д-р Муна Nahm (Университет штата Алабама Бирмингем) за его неоценимую помощь в создании OPKA анализы в нашей лаборатории. Эта работа была поддержана национальными институтами здравоохранения грант 1R01AI123383-01A1 для FYA.

1. Культура, дифференциация и проверки клеток HL-60

<ol><li>Подготовьте СМИ культуры клеток HL-60 состоит из 500 мл RPMI с L-глютамина и 50 мл тепло инактивированная плода бычьим сывороточным. Не добавляйте антибиотики, как это может повлиять на дифференциацию клеток HL-60.</li>
	<li>Для распространен?...

<ol>
	<li>Romero-Steiner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+an+opsonophagocytic+assay+for+the+measurement+of+functional+antibody+activity+against+Streptococcus+pneumoniae+using+differentiated+HL-60+cells.">Standardization of an opsonophagocytic assay for the measurement of functional antibody activity against Streptococcus pneumoniae using differentiated HL-60 cells.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 4 (4), 415-422 (1997).</li><li>Nanra, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsular+polysaccharides+are+an+important+immune+evasion+mechanism+for+Staphylococcus+aureus.">Capsular polysaccharides are an important immune evasion mechanism for Staphylococcus aureus.</a> Human Vaccines and Immunotherapeutics. 9 (3), 480-487 (2013).</li><li>Ishibashi, K., Yamaguchi, O., Shiraiwa, Y., Ogihara, M., Shigeta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+therapy+of+Pseudomonas+aeruginosa+pyelonephritis+in+neutropenic+mice+with+human+antilipopolysaccharide+monoclonal+antibody+and+cefsulodin.">Combination therapy of Pseudomonas aeruginosa pyelonephritis in neutropenic mice with human antilipopolysaccharide monoclonal antibody and cefsulodin.</a> Journal of Urology. 155 (6), 2094-2097 (1996).</li><li>Middleton, D. R., Paschall, A. V., Duke, J. A., Avci, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+Hydrolysis+of+Pneumococcal+Capsular+Polysaccharide+Renders+the+Bacterium+Vulnerable+to+Host+Defense.">Enzymatic Hydrolysis of Pneumococcal Capsular Polysaccharide Renders the Bacterium Vulnerable to Host Defense.</a> Infection and Immunity. , (2018).</li><li>Baker, C. J., Noya, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+use+of+intravenous+immune+globulin+for+group+B+streptococcal+infection.">Potential use of intravenous immune globulin for group B streptococcal infection.</a> Reviews of Infectious Diseases. 12, 476-482 (1990).</li><li>Tian, H., Weber, S., Thorkildson, P., Kozel, T. R., Pirofski, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+opsonic+and+nonopsonic+serotype+3+pneumococcal+capsular+polysaccharide-specific+monoclonal+antibodies+against+intranasal+challenge+with+Streptococcus+pneumoniae+in+mice.">Efficacy of opsonic and nonopsonic serotype 3 pneumococcal capsular polysaccharide-specific monoclonal antibodies against intranasal challenge with Streptococcus pneumoniae in mice.</a> Infection and Immunity. 77 (4), 1502-1513 (2009).</li><li>Parameswarappa, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Semi-synthetic+Oligosaccharide+Conjugate+Vaccine+Candidate+Confers+Protection+against+Streptococcus+pneumoniae+Serotype+3+Infection.">A Semi-synthetic Oligosaccharide Conjugate Vaccine Candidate Confers Protection against Streptococcus pneumoniae Serotype 3 Infection.</a> Cell Chemical Biology. 23 (11), 1407-1416 (2016).</li><li>Jackson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomized+clinical+trial+of+a+single+versus+a+double+dose+of+13-valent+pneumococcal+conjugate+vaccine+in+adults+55+through+74+years+of+age+previously+vaccinated+with+23-valent+pneumococcal+polysaccharide+vaccine.">Randomized clinical trial of a single versus a double dose of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in adults 55 through 74 years of age previously vaccinated with 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine.</a> Vaccine. 36 (5), 606-614 (2018).</li><li>Cywes-Bentley, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+to+a+conserved+antigenic+target+is+protective+against+diverse+prokaryotic+and+eukaryotic+pathogens.">Antibody to a conserved antigenic target is protective against diverse prokaryotic and eukaryotic pathogens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (24), 2209-2218 (2013).</li><li>Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+HL-60+cell+line+to+measure+opsonic+capacity+of+pneumococcal+antibodies.">Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).</li><li>Collins, S. J., Ruscetti, F. W., Gallagher, R. E., Gallo, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+differentiation+of+human+promyelocytic+leukemia+cells+induced+by+dimethyl+sulfoxide+and+other+polar+compounds.">Terminal differentiation of human promyelocytic leukemia cells induced by dimethyl sulfoxide and other polar compounds.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 75 (5), 2458-2462 (1978).</li><li>Melnick, N., Rajam, G., Carlone, G. M., Sampson, J. S., Ades, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+novel+therapeutic+approach+to+treating+severe+pneumococcal+infection+using+a+mouse+model.">Evaluation of a novel therapeutic approach to treating severe pneumococcal infection using a mouse model.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 16 (6), 806-810 (2009).</li><li>Dwyer, M., Gadjeva, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opsonophagocytic+assay.">Opsonophagocytic assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1100, 373-379 (2014).</li><li>Burton, R. L., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+fourfold+multiplexed+opsonophagocytosis+assay+for+pneumococcal+antibodies+against+additional+serotypes+and+discovery+of+serological+subtypes+in+Streptococcus+pneumoniae+serotype+20.">Development of a fourfold multiplexed opsonophagocytosis assay for pneumococcal antibodies against additional serotypes and discovery of serological subtypes in Streptococcus pneumoniae serotype 20.</a> Clinical and Vaccine Immunololgy. 19 (6), 835-841 (2012).</li><li>Clarke, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-cost,+high-throughput,+automated+counting+of+bacterial+colonies.">Low-cost, high-throughput, automated counting of bacterial colonies.</a> Cytometry Part A. 77 (8), 790-797 (2010).</li><li>Aanei, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Database-guided+Flow-cytometry+for+Evaluation+of+Bone+Marrow+Myeloid+Cell+Maturation.">Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e57867 (2018).</li><li>Hirz, T., Dumontet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Isolation+and+Analysis+to+Determine+their+Role+in+Lymphoma+Cell+Sensitivity+to+Therapeutic+Agents.">Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents.</a> Journal of Visulaized Experiments. (109), e53846 (2016).</li><li>Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+annexin+V/propidium+iodide+apoptosis+assay+for+accurate+assessment+of+cell+death.">Modified annexin V/propidium iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), 2597 (2011).</li><li>Blair, O. C., Carbone, R., Sartorelli, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+HL-60+promyelocytic+leukemia+cells:+simultaneous+determination+of+phagocytic+activity+and+cell+cycle+distribution+by+flow+cytometry.">Differentiation of HL-60 promyelocytic leukemia cells: simultaneous determination of phagocytic activity and cell cycle distribution by flow cytometry.</a> Cytometry. 7 (2), 171-177 (1986).</li><li>Middleton, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+the+Streptococcus+pneumoniae+type+3+capsule-specific+glycoside+hydrolase+of+Paenibacillus+species+32352.">Identification and characterization of the Streptococcus pneumoniae type 3 capsule-specific glycoside hydrolase of Paenibacillus species 32352.</a> Glycobiology. 28 (2), 90-99 (2018).</li></ol>

OPKAs служат существенно важную роль в оценке антител при посредничестве иммунных реакций, вызванных прививки6,8. Основной смысл этой упрощенной OPKA является адаптируемость в условиях для проверки (то есть, антитела, фермента лечения и т.д.). В этом смысле в то...

Opsonophagocytic убийства пробирного (OPKA) является важнейшим инструментом для увязки изменения в бактериальных структуры или функции для последующих изменений в иммунной реакции и функции. Таким образом он часто используется в качестве дополнительного анализа для определения на основе иммунной эффективность лечения антителами, вакцин-кандидатов, оптимизация фермента и т.д. Хотя в естественных условиях анализы необходимы для определения эффективного разминирования или защиты в модели бактериальной инфекции, OPKA может использоваться для оценки иммунного вклад в бактериальной клетке смерти на самых основных компонентов: бактерии, иммунные клетки и экспериментальные лечение. Предыдущие исследования показали, что OPKAs могут быть модифицировать и использовать для различных бактерий и серотипов, включая Streptococcus pneumoniae1,2 золотистый стафилококк, синегнойная3. Кроме того эти оптимизированные анализов может использоваться для оценки различных экспериментальных процедур, включая фермента возможность сделать более доступными для дополнения опосредованных иммунных клеток4 и антитела лечение для улучшения бактерии опсонизацию5. Классически, OPKA пробирного успешно используется в фундаментальных и клинических исследованиях параметры как мощный индикатор для защиты индуцированных возбудителя специфические антитела6,,78,9 .
Различные типы иммунных клеток может использоваться для оценки opsonophagocytic убийства. Один из часто используемых фагоцитарной населения является линия человека лейкозных клеток HL-60. Эта линия клетки могут храниться как инактивированных promyelocytes в культуре; Однако они могут быть продифференцированы в различных активированных государства через различных наркотиков лечения10,11. Лечение HL60 с N, N-Диметилформамид дифференцирует линии клетки в активированных нейтрофилов с сильным фагоцитарной активности11. В то время как клеток HL-60 были оптимизированы и часто используются для этих анализов фагоцитоза10, других первичных полиморфноядерных лейкоцитов может использоваться как иммунные руку эксперимент12.
Кроме того эти анализы может быть упрощенной13 или мультиплексированных14 взглянуть на несколько устойчивых к антибиотикам штаммов бактерий для проверки. Мультиплексированных метод был достигнут более реальным путем разработки программного обеспечения, которое может эффективно рассчитывать бактериальные колонии, образуя единиц (CFUs) за пятно на плиты агара15. Здесь мы описываем рациональный метод, используя один штамм бактерий, клеток HL-60, ребенок кролика дополнением и плиты агара крови. С помощью этого метода несколько процедур можно быстро оценить вопросы конкретных исследований на как можно модулировать врожденный иммунный ответ к бактериальной инфекции.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:636px;" width="637">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Annexin V (APC conjugated)</td>
			<td style="width:147px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">640919</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">anti-CD35, human (PE conjugated)</td>
			<td style="width:147px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">333405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">anti-CD71, human (PE conjugated)</td>
			<td style="width:147px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">334105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:204px;">bacterial strain to be used (ie, Streptococcus pneumoniae, WU2)</td>
			<td style="width:147px;">Bacterial Respiratory Reference Laboratory (Dr. Moon Nahm)&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">blood agar plates</td>
			<td>Hardy Diagnostic</td>
			<td>A10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Fetal Clone serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30080.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9012-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">HL-60 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">IgG Isotype Control (PE conjugated)</td>
			<td style="width:147px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">400907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">N,N-dimethylformamide (DMF)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>UN2265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">propidium iodide</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">RPMI media with L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

opsonophagocytic killing assay to assess immunological responses against bacterial pathogens

Ключевым аспектом иммунного ответа на бактериальной колонизации хоста является фагоцитоза. Assay убийство opsonophagocytic (OPKA) является экспериментальной процедуры, в котором фагоцитирующих клеток совместно культивируемых с бактериальной единиц. Иммунные клетки фагоцитоз и убить бактериальных культур в духе дополнение зависимых. Эффективность убийства клеток иммунной системы зависит от целого ряда факторов и может использоваться для определения различных бактериальных культур сравнения в отношении устойчивости к смерти клетки. Таким образом можно оценить эффективность потенциал на основе иммунной терапии против конкретных штаммов бактерий и/или серотипов. В этом протоколе мы описываем упрощенная OPKA, которая использует основные культуры условий и клеток подсчета для определения жизнеспособности бактериальных клеток после совместного культуры с условий лечения и иммунных клеток HL-60. Этот метод был успешно использован с рядом различных серотипов пневмококков, капсульные и acapsular штаммов и других бактериальных видов. Преимущества этого протокола OPKA являются его простота, универсальность (как этот assay не ограничивается лечения антителами как опсонины) и минимизации времени и реагенты для оценки основных экспериментальных групп.

Проверка HL-60 дифференциации должны выполняться перед началом OPKA. Это может быть достигнуто с помощью проточной цитометрии для определения внеклеточного выражение CD11b, CD35, CD71 и annexin V (рис. 1). Пропидий йодидом может также использоваться в качестве маркера жизнеспособности...

Watch this Scientific Journal Video about Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens at JoVE.com

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

Этот assay убийство opsonophagocytic используется для сравнения способность фагоцитирующих иммунных клеток реагировать и убивают бактерии, основанные на различных методов лечения и/или условий. Классически этот assay служит золотой стандарт для оценки эффекторные функции антител против бактерий как опсонин.

Opsonophagocytic убийства Assay оценить иммунологические реакции против бактериальных патогенов

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Этот анализ связывает модуляцию бактериальной структуры и функции с антибактериальной активностью на основе иммунных клеток. Таким образом, ключевой иммунотерапевтический потенциал лечения может быть оценен при определении вероятности улучшения бактериального клиренса. Анализ убийства опсонофагоцитов традиционно служит золотым стандартом для оценки эффективных функций антител, поднятых против бактерии, как обсонант.Этот протокол предлагает простоту и универсальность по отношению к существующим высоким уровнем пропускной способности стандартизированных анализов. В этом протоколе мы исследуем влияние медикаментозного лечения на стрептококковую пневмонию и то, как эти эффекты приводят к улучшению фагоцитоза бактерии. Здесь мы применяем OPKA к клеткам стрептококковой пневмонии.Однако этот протокол может быть принят для оценки фагоцитического убийства других патогенов иммунными клетками. Посвятите время оптимизации бактериальных запасов и обеспечению того, чтобы окончательные CFUs, которые будут подсчитаны, подпадают под оптимальный диапазон. Мы настоятельно рекомендуем использовать цитометрию потока, чтобы обеспечить HL60 клетки являются жизнеспособными и активными и пытается различные условия культуры для обеспечения функционально активных клеток.Визуальная демонстрация даст лучшее представление о том, как следует помять образец и как достичь подсчитываемых образцов. Для начала подготовьте средства культуры клеток HL60, состоящие из 500 миллилитров RPMI, дополненных L-глутамином и 15 миллилитров тепловой инактивированной сыворотки крупного рогатого скота плода. Для распространения и поддержания клеток HL60, культура пять миллионов клеток в 10 миллилитров HL60 клеточной культуры средств массовой информации в 75 квадратных сантиметров вентилируемые колбы при 37 градусов по Цельсию и пять процентов углекислого газа.Для создания рабочих запасов клеток HL60 добавьте около миллиона клеток на миллилитр в культурных средствах массовой информации HL60, дополненных 10%dimethyl sulfoxide в одну миллилитровую криогенную трубку. Чтобы дифференцировать HL60 клеток, культура 1,5 раза 10 до семи клеток в 15 миллилитров HL60 клеточной культуры средств массовой информации дополняется 0,6% DMF в стерильный фильтр ограничен 75 квадратных сантиметров колбы при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа в течение трех дней до OPKA. Для подготовки образцов бактериального запаса, расти WU2 бактериального штамма в соответствующий бульон в течение примерно двух-четырех часов при 37 градусов по Цельсию.Далее, гранулы бактерий центрифугации в шесть тысяч раз G в течение двух минут и повторного незаменимых клеток в 10 до 30 миллилитров 15%глицерол в соответствующем бульоне. Aliquot культуры бактерий в стерильных 1,5 миллилитров центрифуги труб и хранить при 80 градусов по Цельсию. Далее, оттепель из одного флакона бактериального запаса в 37 градусов по Цельсию водяной бане.Пеллет бактериальных клеток и resuspend в 500 микролитров OBB в стерильных условиях. Разбавления плиты необработанного бактериального бульона на агарных пластинах крови и культуры пластин на ночь при 30 градусах по Цельсию. После инкубации шаг, рассчитывать колоний для каждого разбавления необработанных бактериальных запасов совместно культурных с HL60 клеток.Запись, которая разбавления бактерий дает оптимальное количество подсчитывается колоний для будущих OPKAs с этим бактериальным запасом. Оттепель одной трубки бактериального запаса. Пеллетные бактерии при шести тысячах раз G в течение двух минут и повторное использование клеточных гранул в OBB при оптимальном разбавлении, полученном на предыдущем этапе.Pipette 10 микролитров повторного бактериального разбавления на колодец в круглом дне 96 хорошо пластины культуры клеток. Затем добавьте 20 микролитров соответствующего антитела или медикаментозного лечения к каждому экспериментальному колодец в дублировании. Для контрольных скважин используйте 1XPBS или OBB в зависимости от буфера, используемого для очистных скважин.Встряхните образец пластины при температуре около 90 об/мин при комнатной температуре в течение одного часа. Для сбора HL60 дифференцированных клеток, которые обрабатываются DMF за три дня до этого, гранулы клеток в 500 раз G в течение трех минут. Откажитесь от супернатанта и вымойте гранулы не менее чем 10 миллилитров 1XPBS.Пеллет промывают клетки при 500 раз G в течение трех минут. Откажитесь от супернатанта и будем повторно помекать клетки в OBB. Добавить стерильные неразбавленные сыворотки кролика ребенка на один-пять окончательный объем.После одного часа бактериальной культуры, разделить каждый образец на дубликаты скважин для двух групп. Затем добавьте 50 микролитров смеси HL60 к каждому экспериментальному набору скважин и 50 микролитров OBB только к колодцам бактерий. Встряхните 96 хорошо пластины при 37 градусов по Цельсию в течение одного часа.Чтобы пластины образцов, разбавить каждый колодец с OBB на один-пять окончательный том, так что каждый образец имеет объем не менее 50 микролитров. Далее, пипетки 50 микролитров каждого образца непосредственно на назначенную область бактериальной пластины культуры, обеспечивая адекватное расстояние между образцами. Накройте крышкой и дайте образцам высохнуть в течение примерно 15 минут при комнатной температуре.Инвертировать пластины и культуры на ночь при 30 градусов по Цельсию. Кроме того, культуры пластин в анаэробных банках, чтобы проверить, влияют ли аноксические условия на рост бактерий или для контроля для морфологии. После ночной культуры подсчитайте колонии в каждой назначенной области выборки и приступайте к анализу данных, сравнивая количество живых ячеек в каждом наборе с соответствующими элементами управления.Наиболее сложными аспектами создания этого метода в первый раз, вероятно, будет оптимизация стартовых CFUs бактериального запаса, а также обеспечение HL60 клетки эффективно дифференцированы. Перед запуском OPKA дифференциация HL60 была проверена с использованием цитометрии потока с йодидом пропидия в качестве маркера жизнеспособности. После лечения с DMF в течение трех дней, выражение CD35 было увеличено и выражение CD71 было уменьшено.Средний процент бактериальных CFUs в HL60 обработанных групп по сравнению с соответствующими не-HL60 обработанных групп был использован для сравнения выживаемости бактериальных клеток различных методов лечения. Результаты показали, что при эффективном лечении, количество колоний были разными между HL60 совместной культуры и не HL60 клеток, что свидетельствует о более эффективном фагоцитозе. Результаты показали, что, когда бактериальное разбавление не было оптимизировано или рост колонии не наблюдался тщательно после покрытия, разрастание колоний могло предотвратить точный подсчет колоний.Самое главное помнить при попытке этой процедуры является мониторинг бактериальной инкубации тщательно, чтобы избежать разрастания CFUs. In vivo анализы могут быть использованы для ослов эффективного бактериального зазора в принимающей. Эти анализы могут быть использованы для подтверждения иммунной эффективности наблюдается с OPKA являются переводимыми на человека или животных моделей.Анализ убийства опсонофагоцитов был использован для большого эффекта в предыдущих значительных научных исследованиях, чтобы связать антибактериальную терапию с фагостической иммунной реакцией. Работа с бактериальными патогенами может быть опасной. Пожалуйста, носите защитное личное оборудование в любой момент во время этого анализа.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Фермент связанных Immunospot анализ (ELISPOT): Количественная оценка Th-1 клеточного иммунного ответа против микробных антигенов

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Антиген Конкретные В Vivo Убийство методом с использованием меченых клеток CFSE Целевая

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation.  ...

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

Пассивный Администрации моноклональных антител против H. capsulatum И другие грибным патогенам

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating ...

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Использование Пан-Вирусные Microarray анализ (Virochip), чтобы экран клинических образцов для вирусных патогенов

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

&quot;Биолюминесцентный &#39;Reporter Фаг для обнаружения Категория бактериальных патогенов

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Заражение эмбрионов данио рерио с внутриклеточные бактериальные патогены

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Выращивание и инъекции<em&gt; Manduca Sexta</em&gt; Личинки для оценки бактериальной вирулентности

Manduca sexta, commonly known as the tobacco hornworm, is considered a significant agricultural pest, feeding on solanaceous plants including tobacco and ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Application of Long-term cultured Interferon-ÃƒÅ½Ã‚Â³ Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Применение Долгосрочный культивируют Интерферон-γ фермент-связанного Immunospot анализе для оценки эффекторных и памяти T-клеточные ответы у крупного рогатого скота

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

Идентификация редких бактериальными патогенами с 16S рРНК секвенирование гена и MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...